孫魯寧，楊博宇，劉 玲，朱俊偉，楊添樂，彭 政，鄭 瀾，謝華平，d?

（湖南師范大學(xué) a.動物腸道功能調(diào)控湖南省重點實驗室；b.動物營養(yǎng)與人體健康實驗室；c.體適能與運動康復(fù)湖南省重點實驗室；d.淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國家重點實驗室，長沙 410081）

G蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptors，GPCRs）是構(gòu)成人體的最大最普遍的膜受體家族，具有大約800個不同的成員，可識別多種細胞外配體，如核苷酸、肽、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，并將其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細胞中，是藥物治療最常見的靶點［1-3］。GPCRs均具有一個基本相同的分子結(jié)構(gòu)：7個由25～35個連續(xù)殘基組成的跨膜疏水結(jié)構(gòu)域。此外，它們還具有共同的信號傳導(dǎo)機制，即其與普遍存在的鳥嘌呤核苷酸結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白（G蛋白）相互作用，以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)第二信使的合成［4］。黏附類G蛋白偶聯(lián)受體（adhesion G protein coupled receptors，aGPCRs）是GPCRs的5個主要家族中的一族，其中“黏附”一詞反映了其在細胞黏附中的潛在作用［5-6］。GPR112（ADGRG4）是aGPCRs家族的一員，由GPR112基因編碼。目前國際上對GPR112的針對性的研究非常少，其生物功能也不為人知。作為其為數(shù)不多的研究成果之一，GPR112曾被確認為神經(jīng)內(nèi)分泌癌細胞的標記基因［7］。

斑馬魚（Daniorerio）作為脊椎動物模式生物具有許多優(yōu)點，包括其透明的胚胎便于觀察細胞和器官的形態(tài)以及報告基因的表達，且CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)已被熟練地運用于斑馬魚的基因組編輯中［8-9］。斑馬魚gpr112a（adgrg4a）基因是人類GPR112的直系同源基因，經(jīng)高通量實時定量PCR鑒定，其最早在受精后5 dpf（days post fertilization）出現(xiàn)顯著表達，于11 dpf出現(xiàn)表達量的峰值，且在成魚腸道中高表達［10］。

我們首次使用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)對斑馬魚的gpr112a基因進行特異性敲除，以獲得gpr112a基因缺陷的突變體斑馬魚，從而進一步研究gpr112a基因缺失對斑馬魚的生長發(fā)育造成的影響以及其生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料

TU品系斑馬魚來自國家斑馬魚資源中心（China Zebrafish Resource Center，CZRC），于本實驗室養(yǎng)殖。

研究所用主要試劑和耗材包括：E3 Buffer（5.00 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.33 mmol/L CaCl2、0.33 mmol/L MgSO4［11］，均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；斑馬魚養(yǎng)殖與繁育系統(tǒng)（北京愛生科技發(fā)展有限公司）；Rapid Taq Master Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司）；柱式DNA膠回收試劑盒（生工生物工程股份有限公司）；DL2000 DNA Marker［寶生物工程（大連）有限公司］；T7轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司，美國）；RNeasy Mini Kit（Qiagen，德國）；Lysis Buffer（50 mmol/L Tris-HCl pH=8.0，25 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，0.5% SDS，100 μg/mL Proteinase-K，其中Tris和HCl購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，EDTA和SDS購自生工生物工程股份有限公司，Proteinase-K購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）；pMD18-T Vector Cloning Kit［寶生物工程（大連）有限公司］；Plasmid Mini-Prep Kit（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）；4%多聚甲醛（上海源葉生物科技有限公司）；磷酸鹽緩沖液（武漢賽維爾生物科技有限公司）；低熔點瓊脂糖［西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司］。

Sanger測序委托北京擎科生物科技有限公司進行。

1.2 斑馬魚的飼養(yǎng)與繁殖

在28℃恒定溫度下養(yǎng)殖成年斑馬魚，并保持14 h光照和10 h黑暗的明暗循環(huán)。性成熟的雌雄斑馬魚各1條，每周產(chǎn)卵1次；收集胚胎放至E3 Buffer中，每12 h換1次E3 Buffer，飼養(yǎng)至5 dpf開始喂食草履蟲。當(dāng)斑馬魚發(fā)育到14 dpf之后，將幼魚放置到斑馬魚養(yǎng)殖與繁育系統(tǒng)中進行養(yǎng)殖，并喂食豐年蟲，早中晚共3次。

1.3 sgRNA靶位點的設(shè)計

在 Ensembl（http://www.ensembl.org/index.html）網(wǎng)站上查詢gpr112a的轉(zhuǎn)錄本與內(nèi)、外顯子信息；找出所有緊鄰5'-NGG-3'（PAM）的候選靶序列，其大小一般為18～20 bp。sgRNA上游引物序列F的序列構(gòu)成為：于靶序列前加保護堿基（GCG）和T7啟動子（TAATACGACTCACTATA），靶序列后加sgRNA骨架序列的上游序列（GTTTTAGAGGCTAGAAATAGG）。sgRNA下游引物R為固定序列（AAGCACCGACTCGGTGCCACT）。根據(jù)gpr112a基因的靶位點，在靶位點的上下游通過Primer3.0（https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）在線工具分別設(shè)計正、反檢測引物gpr112a-F和gpr112a-R（表1）。

表1 本研究涉及的引物序列Tab.1 Primer sequences involved in this study

1.4 聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）

根據(jù)說明書，在200.0 μL離心管中混合10.0 μL Rapid Taq Master Mix、1.0 μL上游引物、1.0 μL下游引物和0.5～1.0 μL模板，加入雙蒸水補齊至20.0 μL。將混合好的反應(yīng)溶液放入聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）熱循環(huán)儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國）中，依照Rapid Taq Master Mix設(shè)置常規(guī)PCR程序，其中退火溫度為58℃，延伸時間為15 s，共30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，對反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析并成像。

1.5 顯微注射

收集15 min內(nèi)產(chǎn)的斑馬魚受精卵，將gpr112a基因靶位點的sgRNA1、sgRNA2和Cas9蛋白混勻（終質(zhì)量濃度分別為50.00、50.00、250.00 ng/μL）注射到斑馬魚受精卵中，每顆胚胎的注射體積控制在1～2 nL之間，隨后置于28℃的恒溫箱中培養(yǎng)。

1.6 斑馬魚基因組DNA的提取

將60 dpf左右的斑馬魚麻醉，用眼科剪刀剪取約0.2 mm2的尾鰭末端放入離心管中，再加入50 μL Lysis Buffer，55℃水浴12～24 h。水浴結(jié)束后，在離心管中加入50 μL預(yù)冷的異丙醇，混合均勻后12 000 r/min離心10 min，棄上清。加入100 μL 70%乙醇，振蕩混勻，12 000 r/min離心10 min，棄上清。于55℃烘箱干燥10 min后，加入20 μL雙蒸水，振蕩溶解，得到斑馬魚的基因組DNA溶液。

1.7 gpr112a基因型的鑒定

以單條斑馬魚的基因組DNA為模板進行PCR反應(yīng)，gpr112a-F、gpr112a-R分別為上游引物和下游引物。根據(jù)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖來確定斑馬魚的基因型為野生型、gpr112a基因突變雜合子還是gpr112a基因突變純合子。

1.8 T-A克隆

在滅菌的離心管種加入 1 μL pMD18-T、5 μL Solution I（來自 pMD18-T Vector Cloning Kit）、100 ng帶有A尾的純化DNA片段，加入雙蒸水補齊至10 μL以配置成連接溶液。將含有連接溶液的離心管放入PCR儀中，設(shè)置溫度為16℃，時間為30 min。反應(yīng)結(jié)束后，將連接溶液加入至100 μL的感受態(tài)大腸桿菌中，于冰上放置30 min后42℃熱激1 min，再次將其轉(zhuǎn)移至冰上放置2～5 min。在超凈工作臺中將感受態(tài)混合液滴加至含氨芐青霉素鈉的肉湯瓊脂培養(yǎng)基表面，涂抹均勻后于37℃培養(yǎng)12 h。從培養(yǎng)基表面挑取單克隆菌落加入到肉湯液體培養(yǎng)基中擴培，使用Plasmid MiniPrep Kit提取質(zhì)粒。

1.9 體視顯微鏡成像

將斑馬魚幼魚收集到離心管中，盡量將水吸干，加入1 mL 4%多聚甲醛，于4℃存放過夜。次日，將離心管中的液體吸出，使用磷酸鹽緩沖液沖洗幼魚2次。使用1%低熔點瓊脂糖固定幼魚，使其左側(cè)身體朝上。使用體式顯微鏡（Leica公司，德國）觀察其側(cè)面觀并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 gpr112a基因敲除sgRNA的合成

為了將野生型斑馬魚的gpr112a基因敲除，我們現(xiàn)合成了一對用于顯微注射的sgRNA。以Template DNA［12］為模板，sgRNA1-F/sgRNA-R或sgRNA2-F/sgRNA-R為正向引物和反向引物進行PCR擴增。比照DNA Marker，用潔凈的小刀將100 bp左右的特異性條帶切下，并按照柱式DNA膠回收試劑盒說明書的要求進行DNA純化回收。以回收的DNA作為模板，使用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄，獲得sgRNA1和sgRNA2。使用RNeasy Mini Kit將兩種sgRNA純化后進行瓊脂糖凝膠電泳，驗證sgRNA的成功合成（圖1）。

圖1 用于gpr112a基因敲除的sgRNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of sgRNA for gpr112a knockout

2.2 gpr112a基因敲除的有效性鑒定及F0代突變等位基因嵌合體成年斑馬魚的篩選

為了驗證斑馬魚胚胎的顯微注射靶位點是否有效，選擇注射后發(fā)育至60 dpf的斑馬魚尾鰭提取基因組DNA，并將其作為模板，使用基因型鑒定引物（gpr112a-F、gpr112a-R），通過PCR擴增進行注射有效性的鑒定。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，野生型的PCR產(chǎn)物特異性條帶為431 bp，1～7泳道除了有野生型431 bp條帶外，都還出現(xiàn)了一條較為明顯的小帶，說明我們雙靶位點的顯微注射可能是有效的（圖2）。將這7條F0代斑馬魚繼續(xù)養(yǎng)至性成熟。

圖2 經(jīng)顯微注射的gpr112a基因敲除F0代60 dpf斑馬魚基因型鑒定Fig.2 Genotyping of 60 dpf zebrafish in the F0 generation of gpr112a knockout by microinjection

2.3 gpr112a突變等位基因的T-A克隆及Sanger測序分析確立gpr112a基因敲除品系建立

為了驗證F0代中可能存在的gpr112a基因突變是否可以遺傳至后代，我們將圖2中篩選出的第4號成年F0代斑馬魚與野生型斑馬魚雜交，得到F1代胚胎，培育到2 dpf時隨機提取胚胎的基因組，進行基因型鑒定。瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，其后代產(chǎn)生了gpr112a突變等位基因的雜合子斑馬魚（圖3）。

將圖3中10號斑馬魚基因組再次使用基因型鑒定引物進行大量擴增，切取產(chǎn)物中的不同于野生型斑馬魚的較小分子量的條帶，使用柱式DNA膠回收試劑盒進行DNA純化回收。將回收的DNA溶液進行T-A克隆，選取陽性克隆質(zhì)粒進行Sanger測序，與野生型斑馬魚的gpr112a基因進行比對。該斑馬魚的gpr112a突變等位基因DNA在2號外顯子共缺失145 bp，致使其開放閱讀框改變，并提前終止翻譯（圖4a、4b）。分析gpr112a突變等位基因所編碼的蛋白質(zhì)，可證明其主要結(jié)構(gòu)域已缺失（圖4c）。因此，此F0代斑馬魚嵌合體含有這種所翻譯的蛋白質(zhì)功能失效的gpr112a突變等位基因的體細胞，且這種突變等位基因能夠穩(wěn)定遺傳至后代的突變體F1代。此F1代gpr112a突變等位基因雜合子斑馬魚的誕生即代表了gpr112a基因敲除斑馬魚品系的成功建立。

圖3 F1代斑馬魚gpr112a突變等位基因雜合子的篩選Fig.3 Screening of heterozygotes for mutant alleles of gpr112a in F1 generation zebrafish

2.4 gpr112a基因突變體純合子的篩選

為了構(gòu)建完整的斑馬魚敲除突變體品系，將與上述經(jīng)過基因測序的F1代斑馬魚同時所產(chǎn)的剩余胚胎培養(yǎng)至性成熟，經(jīng)基因型鑒定后篩選出gpr112a突變雜合子。將它們的gpr112a突變等位基因T-A克隆后進行Sanger測序，選取測序結(jié)果為圖4所示的雜合子F1代的雌雄魚進行自交，提取其后代的基因組DNA進行PCR以鑒定其基因型。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，此23條gpr112a突變雜合子自交所產(chǎn)的F2代斑馬魚中含9條gpr112a突變純合子、10條突變雜合子、4條野生型。這證明了gpr112a基因敲除品系建立成功（圖5）。

圖4 gpr112a突變等位基因序列與其所翻譯蛋白質(zhì)序列分析Fig.4 Sequence analysis of gpr112a mutant allele and its translated protein

圖5 gpr112a突變等位基因純合子斑馬魚的篩選Fig.5 Screening of zebrafish homozygous for the gpr112a mutant allele

2.5 gpr112a基因突變純合子斑馬魚相較野生型無明顯差異表型

gpr112a突變等位基因純合子斑馬魚為gpr112a基因表達缺失的斑馬魚。為了觀察其與野生型斑馬魚的差異，我們對它進行了體式顯微鏡白光成像。由于野生型斑馬魚中g(shù)pr112a在5 dpf和7 dpf均有顯著表達［10］，所以我們選取了7 dpf的gpr112a-/-斑馬魚幼魚，使用體式顯微鏡拍攝其側(cè)面觀。結(jié)果顯示，gpr112a的缺失并沒有致使斑馬魚在受精后7 dpf與野生型出現(xiàn)明顯的外觀形態(tài)差異（圖6）。

圖6 野生型與gpr112a純合子突變斑馬魚7 dpf側(cè)面觀Fig.6 7 dpf lateral view of zebrafish homozygous for wild-type and gpr112a mutant alleles

對同一天受精的野生型和gpr112a-/-斑馬魚持續(xù)飼養(yǎng)并觀察，直至240 dpf。相較野生型斑馬魚，gpr112a-/-斑馬魚均并沒有出現(xiàn)明顯的異常表型（圖7）。

圖7 野生型與gpr112a突變等位基因純合子斑馬魚240 dpf側(cè)面觀Fig.7 240 dpf side view of zebrafish homozygous for wild-type and gpr112a mutant alleles

3 討論

CRISPR-Cas9作為基因編輯工具，其在生命科學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用已深刻地影響了科學(xué)界，尤其是分子生物學(xué)領(lǐng)域［13-14］。CRISPR-Cas9所介導(dǎo)的基因敲除作為基因編輯的一種，其作用機制為RNA引導(dǎo)的Cas9核酸酶可以精確靶向，在基因組中的特定位點誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂（double-strand breaks，DSB），觸發(fā)修復(fù)機制，而這種修復(fù)所介導(dǎo)的突變有可能會降低或消除基因功能［15-17］?；蚯贸脑O(shè)計與作用方式是靈活多樣的，我們所采用的是設(shè)計用于靶向gpr112a基因中單個外顯子的兩個不同位點的sgRNA，將它們與Cas9內(nèi)切酶混合后同時注射入斑馬魚的受精卵中。這樣即可在斑馬魚基因組DNA中引入兩個并發(fā)的DSB，并導(dǎo)致兩個位點之間基因組片段的靶向缺失［18-19］。之后篩選出嵌合體后代中g(shù)pr112a的外顯子核苷酸缺失數(shù)量為非三整數(shù)倍的個體，即產(chǎn)生了gpr112a翻譯區(qū)移碼突變的斑馬魚，其為gpr112a蛋白翻譯失效的特異性基因敲除品系。其雜合子自交所得的F2代的基因型符合孟德爾分離定律，即野生型和純合子各約占1/4，雜合子約占1/2。我們基于此研究首次報道了在模式生物中敲除人類GPR112的直系同源基因的方式及結(jié)果。

在生物體內(nèi)存在一些補償機制致使敲除生物體中的某個基因可能幾乎沒有表型影響，包括重復(fù)基因的存在、代謝途徑和調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的代償?shù)龋?0］。事實上，GPR112在斑馬魚基因組中存在兩個旁系同源基因，即gpr112a和gpr112b［10］。旁系同源基因是通過基因的復(fù)制而產(chǎn)生的基因［21-22］，旁系同源物之間的功能重疊使它們能夠補償彼此的缺失［23-24］。也就是說，旁系同源基因可以互相作為“功能備份”，當(dāng)一個基因由于突變或者表達受抑制導(dǎo)致功能受損時，它的旁系基因可能就充當(dāng)替補隊員來部分彌補其缺失的功能，維持斑馬魚生理狀態(tài)的相對正常。另外，隨著反向遺傳工具的使用，許多報道指出，基因敲除與基因敲低在各種模式生物中出現(xiàn)表型差異［25-27］。由此，遺傳補償或轉(zhuǎn)錄適應(yīng)的概念被提出，但人們目前對它的具體分子機制知之甚少［28-29］。總之，上述機制均是生命體遺傳穩(wěn)健性的體現(xiàn)，我們在斑馬魚gpr112a突變等位基因純合子上沒有觀察到與野生型有明顯差異的表型，可能是上述多種因素的復(fù)合結(jié)果。我們未來擬敲除它的旁系同源基因gpr112b，并構(gòu)建gpr112a、gpr112b雙基因敲除的斑馬魚品系，以消除它們可能存在的代償機制，更好地揭示GPR112在遺傳和發(fā)育中的作用。