劉瓊芝，黃文麗

（1.長沙市中心醫(yī)院，長沙 410028；2.長沙金域醫(yī)學(xué)檢驗實驗室有限公司，長沙 410205）

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是成人急性白血病中最常見的一種，其發(fā)病率隨著年齡增長逐漸增加，且患者預(yù)后較差［1］?，F(xiàn)今，AML的主要治療方式為化療、靶向治療和造血干細胞移植，這使AML患者病情有所緩解［2］，但在臨床表現(xiàn)和治療預(yù)后方面，患者之間存在較大的異質(zhì)性。進一步探究發(fā)現(xiàn)，這種異質(zhì)性更加體現(xiàn)在基因?qū)用?，?fù)發(fā)的原因可能與部分白血病細胞發(fā)生免疫逃逸，從而在骨髓中形成殘留病灶有關(guān)［3-4］。因此，進一步探究AML的骨髓微環(huán)境對于優(yōu)化治療方案以及提高 AML患者的生存率具有重要的意義。雖然既往有許多分析腫瘤微環(huán)境中免疫細胞構(gòu)成與預(yù)后之間關(guān)系的研究，但關(guān)于AML的研究較少［5］。本研究根據(jù)免疫基因構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險模型，比較高風(fēng)險組和低風(fēng)險組AML患者之間骨髓微環(huán)境中免疫細胞的分布比例，進而分析風(fēng)險模型與AML的免疫細胞浸潤模式的相關(guān)性及其預(yù)后價值，旨在為改善AML治療和預(yù)后效果提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)庫分析

通過癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載141例AML（TCGA-LAML）樣本的RNA表達數(shù)據(jù)以及生存等臨床信息。本研究通過基因表達綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.goc/geo/）下載轉(zhuǎn)錄組RNA測序數(shù)據(jù)集GSE15601，其中包括69例正常對照和202例AML患者的骨髓樣本。

1.2 篩選差異表達基因及獲取相關(guān)免疫基因、候選基因

通過R軟件包limma，以P<0.05為閾值，篩選數(shù)據(jù)集GSE15601中正常對照與AML患者的骨髓樣本間的差異表達基因。從IMMPORT數(shù)據(jù)庫（https://www.immport.org/home）中下載人類免疫及免疫相關(guān)基因。利用jvenn工具（http://jvenn.toulouse.inra.fr/）取數(shù)據(jù)集GSE15601中差異表達基因與免疫基因的交集，并繪制Venn圖，得到候選基因。

1.3 構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險模型

使用TCGA-LAML數(shù)據(jù)集，采用R語言包survival對55個免疫基因進行單因素COX回歸分析以及多因素COX回歸分析，建立預(yù)后風(fēng)險模型，并計算回歸模型下每位患者的風(fēng)險評分。風(fēng)險評分=各基因回歸系數(shù)×其表達水平之和。

1.4 繪制生存分析曲線和接受者操作特性曲線（ROC）

根據(jù)風(fēng)險評分的中位值將患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，并進行Kaplan-Meier生存分析，以比較高風(fēng)險組和低風(fēng)險組之間的總體生存期（overall survival，OS）差異，選擇P<0.05作為截止值。同時繪制風(fēng)險曲線和生存狀態(tài)圖，并基于R軟件包pheatmap繪制4個預(yù)后基因在高風(fēng)險組和低風(fēng)險組中表達的熱圖。采用R軟件包timeROC進行分析，繪制接受者操作特性曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）以評估預(yù)后風(fēng)險模型的準(zhǔn)確性。

1.5 繪制臨床相關(guān)性分析和列線圖

基于TCGA-LAML數(shù)據(jù)集中AML患者的年齡（≤65和＞65）、性別（男和女）進行分組，比較組間風(fēng)險評分的差異。根據(jù)患者臨床信息（年齡、性別、生存時間）以及風(fēng)險評分，采用R軟件包rms繪制列線圖，以評估AML患者的預(yù)后。

1.6 腫瘤微環(huán)境分析

ESTIMATE是一種預(yù)測腫瘤純度的工具，可基于基因表達數(shù)據(jù)預(yù)測腫瘤組織中浸潤的基質(zhì)/免疫細胞的存在。ESTIMATE算法基于單樣本基因集富集分析生成三個評分：基質(zhì)評分（捕獲腫瘤組織中基質(zhì)的存在）、免疫評分（表示免疫細胞在腫瘤組織中的浸潤）、ESTIMATE評分（綜合基質(zhì)評分和免疫評分，推斷腫瘤純度）［6］。我們使用R軟件包estimate（https://r-forge.r-project.org/projects/estimate/）計算高風(fēng)險組和低風(fēng)險組的基質(zhì)評分、免疫評分、ESTIMATE評分以及重量純度，并進行組間比較。

1.7 免疫浸潤分析

通過CIBERSORT算法估計TCGA-LAML數(shù)據(jù)集中22種免疫細胞的浸潤比例，模擬次數(shù)為1 000次［7］。基于R軟件包corrplot（https://CRAN.R-project.org/package=corrplot）對預(yù)后基因或風(fēng)險評分與免疫細胞含量進行相關(guān)性分析，以|r|>0.2且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)閾值，其中r為相關(guān)系數(shù)。

1.8 免疫檢查點相關(guān)性分析和差異分析

收集47個常見的免疫檢查點，分別為：IDO1、LAG3、CTLA4、TNFRSF9、ICOS、CD80、PDCD1LG2、TIGIT、CD70、TNFSF9、ICOSLG、KIR3DL1、CD86、PDCD1、LAIR1、TNFRSF8、TNFSF15、TNFRSF14、IDO2、CD276、CD40、TNFRSF4、TNFSF14、HHLA2、CD244、CD274、HAVCR2、CD27、BTLA、LGALS9、TMIGD2、CD28、CD48、TNFRSF25、CD40LG、ADORA2A、VTCN1、CD160、CD44、TNFSF18、TNFRSF18、BTNL2、C10orf54、CD200R1、TNFSF4、CD200、NRP1。首先，篩選出高風(fēng)險組和低風(fēng)險組間差異表達的免疫檢查點，然后，進一步基于R軟件包corrplot分析免疫檢查點表達與風(fēng)險評分的相關(guān)性，以|r|>0.3以及P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)閾值進行篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 AML中55個免疫基因差異表達

通過GEO數(shù)據(jù)庫得到AML患者和正常對照的骨髓樣本的轉(zhuǎn)錄組RNA-seq數(shù)據(jù)集GSE15061，以P<0.05為閾值篩選出差異表達的基因，選取差異表達最為顯著的前500個基因（圖1a）。同時，從IMMPORT數(shù)據(jù)庫中下載到1 793個免疫相關(guān)基因，取差異表達的基因與免疫相關(guān)基因的交集，獲得AML患者中差異表達顯著的55個免疫相關(guān)基因（圖1b）。

圖1 AML中差異表達的免疫基因的篩選Fig.1 Screening of differentially expressed immune genes in AML

2.2 免疫基因的預(yù)后風(fēng)險模型構(gòu)建

在TCGA數(shù)據(jù)庫中下載AML的轉(zhuǎn)錄組RNA測序數(shù)據(jù)集TCGA-LAML，其中包含141例AML患者的骨髓樣本以及臨床信息。首選以上55個免疫基因進行單因素COX分析（以P<0.05為閾值），發(fā)現(xiàn)其中6個基因（FLT3、FGF13、CRLF3、GZMB、KLRD1、IGF2R）與AML患者的生存情況顯著相關(guān)（圖2a）。隨后，通過多因素COX分析構(gòu)建包含4個免疫基因（FGF13、GZMB、FLT3、CRLF3）的風(fēng)險模型，根據(jù)以下公式計算每位患者的風(fēng)險評分：風(fēng)險評分=（-1.645 7×ExpFGF13）+（0.064 9×ExpGZMB）+（0.002 9×ExpFLT3）+（-0.064 6×ExpCRLF3），其中Exp表示基因表達。以風(fēng)險評分中位數(shù)為分界線，將患者劃分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組（圖2b）。通過進一步對風(fēng)險模型中AML患者的生存狀態(tài)進行統(tǒng)計，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高風(fēng)險組中死亡患者的數(shù)目要多于低風(fēng)險組，并且其生存時間普遍更短（圖2c）。4個免疫基因在低風(fēng)險組與高風(fēng)險組間也存在一定的差異表達（圖2d）。

圖2 基于TCGA-LAML數(shù)據(jù)集構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險模型Fig.2 Construction of a prognostic risk model based on the TCGA-LAML dataset

2.3 由FGF13、GZMB、FLT3、CRLF3構(gòu)建的風(fēng)險模型可準(zhǔn)確預(yù)測AML患者的預(yù)后

Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果表明，低風(fēng)險組患者的存活時間明顯高于高風(fēng)險組患者（圖3a）。ROC分析結(jié)果也顯示了風(fēng)險模型1、2、3 年總生存率的良好預(yù)測準(zhǔn)確性（圖3b）。進一步分析該風(fēng)險模型與AML患者臨床參數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，高風(fēng)險組和低風(fēng)險組患者的性別無明顯差異（圖3c），高風(fēng)險組患者的年齡顯著高于低風(fēng)險組（圖3d）。繪制列線圖展示了風(fēng)險評分、年齡和性別對患者生存的預(yù)測能力，總得分可用于預(yù)測AML患者1、2、3年生存率（圖3e），并繪制了1年生存率的校正曲線（圖3f）。以上結(jié)果表明，由4個免疫基因（FGF13、GZMB、FLT3、CRLF3）構(gòu)建的風(fēng)險模型可準(zhǔn)確預(yù)測AML患者的預(yù)后。

圖3 風(fēng)險模型在AML患者預(yù)后中的預(yù)測價值Fig.3 Predictive value of risk models in the prognosis of AML patients

2.4 風(fēng)險模型與AML腫瘤微環(huán)境中免疫浸潤密切相關(guān)

在腫瘤微環(huán)境中，免疫細胞和基質(zhì)細胞是兩種主要類型的非腫瘤組分，并且已被提出對于腫瘤的診斷和預(yù)后評估是有價值的。為了探究4個免疫基因構(gòu)建的風(fēng)險模型與AML腫瘤微環(huán)境是否相關(guān)，我們基于EATIMATE算法計算基質(zhì)評分、免疫評分、ESTIMATE評分以及腫瘤純度，評分越高說明細胞含量越高。結(jié)果表明：高風(fēng)險組和低風(fēng)險組基質(zhì)評分無顯著差異（圖4a）；高風(fēng)險組免疫評分顯著高于低風(fēng)險組（圖4b）；高風(fēng)險組綜合評分顯著高于低風(fēng)險組（圖4c）；高風(fēng)險組腫瘤純度顯著高于低風(fēng)險組（圖4d）。這說明，由FGF13、GZMB、FLT3、CRLF3構(gòu)建的風(fēng)險模型與免疫浸潤密切相關(guān)。

圖4 高風(fēng)險組和低風(fēng)險組AML樣本的腫瘤微環(huán)境分析Fig.4 Tumor microenvironment analysis of AML samples in high-risk group and low-risk group

2.5 風(fēng)險模型與AML中免疫細胞的含量密切相關(guān)

前面結(jié)果顯示，該風(fēng)險模型與免疫浸潤存在顯著相關(guān)性。我們進一步通過CIBERSORT算法估計了TCGA-LAML數(shù)據(jù)集中22種免疫細胞的浸潤比例，并分析了兩組免疫細胞含量的差異。結(jié)果顯示：高風(fēng)險組中未激活的B細胞、CD8+T細胞、激活的自然殺傷細胞的含量顯著高于低風(fēng)險組，同時，以上免疫細胞的含量與風(fēng)險評分顯著正相關(guān)（圖5a～5c、5e）；高風(fēng)險組中未激活的CD4+T細胞、靜息的肥大細胞的含量顯著低于低風(fēng)險組，同時，以上免疫細胞的含量與風(fēng)險評分顯著負相關(guān)（圖5a、5d、5f）。

圖5 基于CIBERSORT算法估計高風(fēng)險組和低風(fēng)險組免疫細胞含量Fig.5 Estimation of immune cell content in high-risk group and low-risk group based on CIBERSORT

2.6 風(fēng)險模型與多個免疫檢查點顯著相關(guān)

本文分析了47個常見的免疫檢查點在高風(fēng)險組和低風(fēng)險組的表達，其中15個免疫檢查點的表達存在顯著差異（圖6a）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，其中4個免疫檢查點（CTLA4、PDCD1、KIR3DL、LAG3）與風(fēng)險評分的相關(guān)性顯著，且均為正相關(guān)（圖6b～6f）。這也進一步體現(xiàn)了該風(fēng)險模型在AML患者免疫治療中的應(yīng)用潛力。

圖6 風(fēng)險模型與免疫檢查點相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between risk model and immune checkpoint

2.7 FGF13、GZMB、FLT3、CRLF3與AML患者生存、免疫細胞含量顯著相關(guān)

為了進一步探究風(fēng)險模型中4個免疫基因（FGF13、GZMB、FLT3、CRLF3）與AML患者生存、免疫細胞含量的相關(guān)性。我們基于TCGA-LAML數(shù)據(jù)集，根據(jù)基因高/低表達進行分組。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果表明：高表達FGF13、CRLF3組患者的存活時間明顯高于低表達組患者（圖7a、7g）；高表達GZMB、FLT3組患者的存活時間明顯低于低表達組患者（圖7c、7e）。免疫細胞的含量差異分析結(jié)果表明：高表達和低表達FGF13組間靜息的CD4+記憶T細胞、單核細胞、M2巨噬細胞、靜息的肥大細胞含量存在顯著差異（圖7b）；高表達和低表達GZMB組間未激活的B細胞、漿細胞、CD8+T細胞、激活的CD4+T細胞、靜息的自然殺傷細胞、靜息的樹突狀細胞、靜息的肥大細胞、嗜酸性粒細胞的含量存在顯著差異（圖7d）；高表達和低表達CRLF3組間γδ T細胞、M2巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性白細胞含量存在顯著差異（圖7h）；高表達和低表達CRLF3組間靜息的CD4+T細胞、激活的自然殺傷細胞含量存在顯著差異（圖7f）。

圖7 FGF13、GZMB、FLT3、CRLF3與AML患者生存、免疫細胞含量的相關(guān)性Fig.7 Correlation between FGF13, GZMB, FLT3, CRLF3 and survival and immune cell content in AML patients

3 討論

AML作為一種侵襲性的血液惡性腫瘤，疾病進展快速且預(yù)后較差，目前認為這與骨髓微環(huán)境相關(guān)［8］。骨髓微環(huán)境是由免疫細胞、基質(zhì)細胞、細胞外基質(zhì)以及細胞因子等一起構(gòu)成的動態(tài)系統(tǒng)。其中，基質(zhì)細胞和免疫細胞是AML發(fā)生發(fā)展所必需的主要成分［9］。AML的骨髓微環(huán)境在患者治療和預(yù)后中發(fā)揮著極其重要的作用，然而，其中相關(guān)細胞及分子在AML預(yù)后中的作用并不清楚［10］。本研究基于141例TCGA-LAML樣本，通過EATIMATE算法計算高風(fēng)險組和低風(fēng)險組的基質(zhì)評分、免疫評分、ESTIMATE評分以及腫瘤純度，結(jié)果顯示，免疫細胞浸潤可能在AML腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮了重要作用。鑒于AML患者骨髓微環(huán)境的免疫特征仍然不是很清楚，我們有必要對于骨髓微環(huán)境中免疫細胞浸潤模式進行進一步的探究，篩選免疫相關(guān)預(yù)后基因，建立準(zhǔn)確性良好的預(yù)后風(fēng)險模型，并為AML患者個體化治療提供重要的參考價值。

目前尚缺乏免疫基因相關(guān)AML預(yù)后評估模型。本研究首次提出4個重要的免疫基因（FGF13、GZMB、FLT3、CRLF3）構(gòu)建的風(fēng)險評估模型可準(zhǔn)確預(yù)測AML患者的預(yù)后，其中，F(xiàn)GF13、CRLF3為低風(fēng)險基因，GZMB、FLT3為高風(fēng)險基因。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF13在多種腫瘤中均發(fā)揮了一定的功能［11-12］，其中，F(xiàn)GF13與肝細胞癌微環(huán)境中免疫細胞浸潤密切相關(guān)［13］。GZMB編輯的蛋白可由自然殺傷細胞和細胞毒性T淋巴細胞分泌，被認為是一種細胞毒性的促凋亡蛋白酶［14］。值得一提的是，GZMB在乳腺癌等腫瘤免疫浸潤中具有一定的功能［15］。本研究也發(fā)現(xiàn)，與低表達GZMB組相比，高表達GZMB組CD8+T細胞、靜息的自然殺傷細胞等的含量顯著升高，靜息的肥大細胞、嗜酸性粒細胞等的含量顯著降低。目前已有較多的研究表明，F(xiàn)LT3與AML發(fā)生發(fā)展存在關(guān)聯(lián)［16-17］，并在臨床治療上展現(xiàn)了一定的價值［18］。如Patnaik等［16］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LT3-ITD是一個負面的預(yù)后因素，即使在化療或干細胞移植后仍具有預(yù)后相關(guān)性，這也與本研究結(jié)果一致。CRLF3在血小板形成的最后階段發(fā)揮了關(guān)鍵作用，是血小板血癥潛在的治療靶點［19］。雖然暫無研究顯示CRLF3與骨髓微環(huán)境存在關(guān)聯(lián)，但有證據(jù)表明，CRLF3在改善AML患者預(yù)后中可能存在一定的價值［20］。此外，本研究單基因預(yù)后分析結(jié)果也顯示，F(xiàn)GF13、GZMB、FLT3、CRLF3與AML預(yù)后顯著相關(guān)，同時與骨髓微環(huán)境中多種免疫細胞的含量密切相關(guān)。各免疫基因發(fā)揮作用的具體機制亟待進一步探究。

越來越多的研究顯示，腫瘤浸潤性免疫細胞在預(yù)測腫瘤治療和預(yù)后效果中發(fā)揮了重要作用，部分免疫細胞亞群的作用尤為突出［21-22］?；谌ゾ矸e原理的CIBERSORT算法可以利用標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達數(shù)據(jù)去計算不同免疫細胞亞群的相對比例，進而量化特定細胞類型的豐度，在一定程度上克服了傳統(tǒng)分析方法的缺陷［23］，目前已應(yīng)用于多種腫瘤中［24-25］。本研究采用CIBERSORT算法估計AML骨髓樣本中22種免疫細胞的分布比例，并依據(jù)風(fēng)險評分將樣本分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，同時比較組間免疫細胞含量的差異。在過去的十年里，免疫治療在腫瘤治療方面取得了巨大的進步，實現(xiàn)腫瘤免疫治療的一個極有希望的方法是阻斷免疫檢查點途徑［26］。本研究構(gòu)建的預(yù)后風(fēng)險模型與4個免疫檢查點（CTLA4、PDCD1、KIR3DL、LAG3）顯著相關(guān)。結(jié)合研究表明，以上免疫檢查點已在臨床上應(yīng)用廣泛［27-28］。這也進一步明確了該免疫相關(guān)的風(fēng)險模型在AML免疫治療中的應(yīng)用潛力。

綜上所述，本研究依據(jù)多種數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學(xué)構(gòu)建了包含4個免疫相關(guān)基因（FGF13、GZMB、FLT3、CRLF3）的預(yù)后風(fēng)險模型。該模型與免疫細胞以及CTLA4等免疫檢查點密切相關(guān)，同時可預(yù)測AML患者的預(yù)后。需說明的是，本研究的結(jié)論是基于公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)以及生物信息學(xué)分析所得，仍有待開展相關(guān)體內(nèi)外試驗加以驗證，這也是本項目組今后工作的重點。本研究為探究免疫相關(guān)基因在AML骨髓微環(huán)境中的作用機制提供了生物信息學(xué)證據(jù)，為后續(xù)改善AML治療和預(yù)后提供了新的靶點，具有較好的理論指導(dǎo)價值。