劉怡婷，王 喆，馮 靜，高 敏，張秀偉*，張?jiān)世祝?*

（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，南京 211100；2.南京醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與信息學(xué)院，南京 211100；3.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)中心，南京 210029；4.南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，南京 211100）

肺癌的發(fā)病率和死亡率近年來已上升至全球第一位，年均患病人數(shù)超過200萬人，而每年因肺癌死亡的人數(shù)占癌癥死亡總?cè)藬?shù)的20%。在中國(guó)，肺癌患者的比例已上升至癌癥病人的30%，其中，80%～85%的肺癌病人患有非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer cell，NSCLC），患者的5年平均存活率低于20%［1-2］。這給人們帶來了沉重的生活和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。前瞻性的臨床研究表明，不同基因突變類型的肺癌發(fā)病率存在顯著的地區(qū)差異。例如，表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在亞洲的突變率明顯高于歐洲、美洲和非洲等其他地區(qū)［3］。這類具有T790M耐藥突變和致敏EGFR突變的患者，其主要特征是存在外顯子19缺失（del19）和外顯子21L858R點(diǎn)突變［4］。國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)（The International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC）、美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（American Society of Clinal Oncology，ASCO）和歐洲醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)會(huì)（European Society of Medical Oncology，ESMO）提出，根據(jù)患者分子亞型制定治療策略可以有效提高患者的總生存期（overall survival，OS）［5］。EGFR突變是NSCLC中最常見的突變類型。美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）的腫瘤學(xué)臨床實(shí)踐指南推薦，將奧希替尼作為轉(zhuǎn)移性NSCLC和EGFR敏感突變患者的首選一線治療藥物［6］。奧希替尼是第三代口服表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI），具有雙重抑制突變的能力，能夠在EGFR的TK結(jié)構(gòu)域內(nèi)的第797位點(diǎn)不可逆地共價(jià)結(jié)合半胱氨酸殘基［7］，可將患者的無進(jìn)展生存率（progression-free survival，PFS）提高至19個(gè)月，同時(shí)有效克服第一、二代EGFRTKI因T790M陽性突變產(chǎn)生的獲得性耐藥問題。但由于腫瘤自身的適應(yīng)性和高度的異質(zhì)性，在進(jìn)行臨床用藥時(shí)發(fā)生的二次耐藥突變加速了奧希替尼獲得性耐藥問題的出現(xiàn)［8-9］。因此，如何降低奧希替尼獲得性耐藥的發(fā)生率并解決NSCLC耐藥性的問題，對(duì)于提高臨床NSCLC的治療效率具有重要意義。本研究選用具有EGFR突變的NSCLC細(xì)胞系HCC827，通過間歇性大劑量沖擊和梯度遞增相結(jié)合的方式建立奧希替尼耐藥細(xì)胞株HCC827OR，為研究奧希替尼的耐藥機(jī)制提供可靠的細(xì)胞模型；通過觀察和分析耐藥細(xì)胞株的生物學(xué)特性初步探索奧希替尼的耐藥機(jī)制，可以輔助臨床用藥方案的制定，降低和延緩腫瘤耐藥。同時(shí)，奧希替尼耐藥細(xì)胞株的建立為新的分子靶向藥物的篩選及耐藥機(jī)制的研究提供了重要的體外細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 主要材料

NSCLC HCC827細(xì)胞購于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection）；Quick BlockTMWestern封閉液、二抗稀釋液、CCK8試劑購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基購于武漢塞維爾生物科技有限公司；青霉素和鏈霉素購于蘭杰柯科技有限公司；細(xì)胞凍存液、胰酶和小牛血清購于南京生航生物技術(shù)有限公司；Hoechst33342購于Sigma；鬼筆環(huán)肽（phalloidin）熒光染料購于蘇州宇恒生物科技有限公司；EGFR、p-EGFR、AKT、p-AKT和GADPH抗體購于Abcam；甲磺奧希替尼（泰瑞沙）由阿斯利康公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HCC827細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%小牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，并置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。

1.2.2 耐藥細(xì)胞株的建立

通過間歇性大劑量沖擊和梯度遞增相結(jié)合的方法誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞株HCC827，按每孔5×105個(gè)細(xì)胞將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期收集的細(xì)胞鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)24 h。先通過CCK8法測(cè)得細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度（half inhibition concentration，IC50），將無藥培養(yǎng)基換成含有100 nmol/L奧希替尼的培養(yǎng)基，作用12～24 h，觀察細(xì)胞狀態(tài)。如初期有大量漂浮的死細(xì)胞，則及時(shí)更換濃度為IC50（45 nmol/L）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直到存活的細(xì)胞重新恢復(fù)正常增殖。當(dāng)細(xì)胞在含有45 nmol/L奧希替尼的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好并連續(xù)傳代3次以上時(shí)，再用含有100 nmol/L奧希替尼的培養(yǎng)基沖擊培養(yǎng)12～24 h，之后更換為含有45 nmol/L奧希替尼的培養(yǎng)基（上述為一個(gè)培養(yǎng)循環(huán)）。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)歷3個(gè)循環(huán)且處于較為穩(wěn)定的狀態(tài)后，可按50 nmol/L的藥物濃度差提升藥物濃度，作用12～24 h，觀察細(xì)胞狀態(tài)，并更換為含有45 nmol/L奧希替尼的培養(yǎng)基再培養(yǎng)24～72 h。當(dāng)貼壁細(xì)胞在含藥培養(yǎng)基中的密度低于20%～30%或出現(xiàn)大量漂浮的死細(xì)胞時(shí)，及時(shí)采取撤藥處理，給藥多次后，細(xì)胞即可在含藥環(huán)境中穩(wěn)定增殖。當(dāng)藥物篩選濃度達(dá)到IC50的5倍時(shí)，按100 nmol/L的濃度差提升，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)調(diào)整培養(yǎng)基的藥量，直至細(xì)胞能夠在設(shè)置的濃度下正常生長(zhǎng)。試驗(yàn)總計(jì)歷時(shí)7個(gè)月，建立的耐藥細(xì)胞株被命名為HCC827OR。

1.2.3 細(xì)胞核及骨架染色

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（每孔5×105個(gè)細(xì)胞），待孔內(nèi)的細(xì)胞密度達(dá)到60%時(shí)，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗2～3次，之后置于相差顯微鏡下放大100倍，對(duì)比觀察兩種細(xì)胞形態(tài)的差異并拍照記錄。拍照后，用PBS再次清洗細(xì)胞，并用3.75%甲醛在冰上固定細(xì)胞15 min。用PBS清洗3次，去除甲醛殘留液，加入0.5%Triton X-100，在室溫下透化處理10 min。用PBS清洗細(xì)胞，每孔加入100 μL 0.5%～4.0%的鬼筆環(huán)肽染色液，室溫下避光孵育20 min。用PBS清洗細(xì)胞，吸棄殘液，加入10 μg/mL的Hoechst33342染液，室溫避光染色5 min，通過熒光顯微鏡觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)。Hoechst33342與細(xì)胞核中的雙鏈DNA選擇性地結(jié)合，細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光，鬼筆環(huán)肽與細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白特異性結(jié)合，發(fā)出紅色熒光。

1.2.4 EGFR的基因突變檢測(cè)

細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后離心，棄上清液，用PBS清洗2次后用1 mL PBS重懸細(xì)胞，置于4℃冰箱保存，并送上海生工生物工程有限公司檢測(cè)肺癌EGFR的基因突變情況。

1.2.5 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCC827和HCC827OR細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液接種于96孔板中（每孔5×103個(gè)細(xì)胞）。培養(yǎng)18～24 h后加入不同濃度的奧希替尼（0、5、10、100和1 000 nmol/L），每個(gè)藥物濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白組（培養(yǎng)基中未接種細(xì)胞）和無藥對(duì)照組（接種細(xì)胞但未加入藥物）。培養(yǎng)72 h后，小心的移除培養(yǎng)液，每孔加入100 μL的細(xì)胞培養(yǎng)基和10 μL CCK8試劑，37℃避光孵育1 h后，使用酶標(biāo)儀（TECAN INFINITE，M200 pro）在450 nm波長(zhǎng)上檢測(cè)溶液的光密度值，采用Graphpad Prism 9.0軟件計(jì)算IC50，再按照此公式計(jì)算細(xì)胞耐藥指數(shù)（resistance index，RI）。計(jì)算公式為 ：RI=IC50（HCC827OR）/IC50（HCC827）。

1.2.6 Western blot分析細(xì)胞中EGFR及相關(guān)蛋白的表達(dá)

將HCC827和HCC827OR分別接種于6孔板中，于24 h后加入奧希替尼，濃度分別為0、1、10和100 nmol/L。作用48 h后，用預(yù)冷的PBS洗2遍，加入含磷酸酶抑制劑的RIPA（radio immunoprecipitation assay）裂解液，置于冰上裂解后提取細(xì)胞總蛋白，并用BCA（bicinchoninic acid assay）法測(cè)定蛋白濃度。利用4%～12%的聚丙烯酰胺梯度膠分離總蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，用Quick BlockTMWestern封閉液封閉1 h，用含有0.5% Tween-20的Tris-HCl緩沖液（Tris-Buffered Saline and Tween 20，TBST）漂洗后，加入對(duì)應(yīng)的抗體溶液（EGFR、p-EGFR、AKT、p-AKT和GAPDH），于4℃孵育過夜。TBST洗滌3次后與二抗溶液反應(yīng)，室溫孵育1 h，用TBST漂洗3次，加入發(fā)光液后于全自動(dòng)成像分析系統(tǒng)（protein simple，USA）中顯影拍照。

1.2.7 細(xì)胞周期分析

在HCC827和HCC827OR的細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，離心收集沉淀，用500 μL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，使細(xì)胞分散為單細(xì)胞懸液，快速加入到-20℃預(yù)冷的1.5 mL無水乙醇溶液中，冰上放置15 min。1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入200 μL 1 mg/mL的RNase A酶，于37℃孵育30 min，去除細(xì)胞中的RNA酶。上機(jī)前加入300 μL 100 μg/mL的碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液，室溫放置30 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)（CytoFLEX Flow cytometer, Beckman Coulter Inc.，Miami，F(xiàn)L，USA）細(xì)胞周期，使用Flowjo10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.8 劃痕試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCC827和HCC827OR細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于6孔板中（每孔5×105個(gè)細(xì)胞）。待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至85%時(shí)即可用于劃痕試驗(yàn)。用10 μL的一次性槍頭劃過直尺標(biāo)記的區(qū)域制造傷痕，用PBS重復(fù)漂洗3次，洗去漂浮的細(xì)胞后，加入無血清的RMPI1640培養(yǎng)基，再放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。分別于48和96 h通過光學(xué)顯微鏡拍攝圖片，并記錄劃傷區(qū)域的面積變化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用t檢驗(yàn)比較兩樣本間的均數(shù)，使用單因素方差分析法分析多組間的數(shù)據(jù)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 奧希替尼耐藥細(xì)胞株HCC827OR的建立及形態(tài)學(xué)變化

本研究通過間歇性大劑量沖擊和梯度遞增的方法，歷時(shí)7個(gè)月，成功將HCC827誘導(dǎo)成獲得性耐藥細(xì)胞株HCC827OR。在倒置顯微鏡下，HCC827和HCC827OR兩種細(xì)胞均貼壁生長(zhǎng)。其中，HCC827生長(zhǎng)無規(guī)則，細(xì)胞外觀以梭形為主（圖1a），而HCC827OR則呈現(xiàn)出團(tuán)簇狀生長(zhǎng)的狀態(tài)，細(xì)胞間互相鑲嵌，部分細(xì)胞偽足拉長(zhǎng)，邊緣出現(xiàn)不規(guī)則變化。根據(jù)鬼筆環(huán)肽和Hoechst熒光標(biāo)記后的結(jié)果可知，與HCC827細(xì)胞相比，在HCC827OR細(xì)胞中呈紅色熒光的細(xì)胞骨架部分，雖然其局部骨架的延展性增加，但總體積明顯減小。同時(shí)，對(duì)比兩者在同一拍攝區(qū)域面積內(nèi)的細(xì)胞核大小，HCC827OR的細(xì)胞核仁大小明顯不一，核漿比增大（圖1b）。這表明，HCC827細(xì)胞在耐藥后出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞形態(tài)變化，也意味著其胞內(nèi)的蛋白表達(dá)和細(xì)胞代謝等微觀生命活動(dòng)發(fā)生了顯著的變化。

圖1 HCC827和HCC827OR細(xì)胞的形態(tài)差異（200×）Fig.1 The morphological difference between HCC827 and HCC827OR cells (200×)

2.2 細(xì)胞耐藥性檢測(cè)

IC50是指對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)到50%效果時(shí)的藥物濃度，用于衡量藥物對(duì)藥物的耐受能力。根據(jù)測(cè)定的親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的IC50，計(jì)算RI，RI>5則認(rèn)為耐藥細(xì)胞系的耐藥性符合耐藥株的要求。根據(jù)上述評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，我們進(jìn)行了細(xì)胞增殖的檢測(cè)［10］。CCK8細(xì)胞增殖的檢測(cè)結(jié)果顯示，HCC827的IC50為（40.11±0.366 5）nmol/L，而HCC827OR的IC50為（747.90±0.453 8）nmol/L，RI為18.65，符合耐藥株的建立要求。藥物濃度與細(xì)胞抑制率曲線見圖2。

圖2 HCC827和HCC827OR的奧希替尼濃度-細(xì)胞抑制率曲線（48 h）Fig.2 Cytotoxicity of Osimertinib against HCC827 and HCC827OR (48 h)

2.3 耐藥細(xì)胞株EGFR基因的變化

第二代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）檢測(cè)結(jié)果表明，HCC827存在EGFR19外顯子缺失，HCC827OR細(xì)胞保留了該突變特性，但兩者EGFR的表達(dá)豐度不同，后者僅是前者的約二分之一（表1）。與此同時(shí)，在本次測(cè)序結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)EGFR耐藥機(jī)制中常見區(qū)域的繼發(fā)突變位點(diǎn)，如C797S、C797G、G798R、G796S、L718Q和L718V等［11-15］。這表明HCC827OR可能通過非EGFR途徑產(chǎn)生了耐藥。

表1 HCC827及HCC827OR相關(guān)基因測(cè)序結(jié)果Tab.1 The gene sequence result of HCC827 and HCC827OR

2.4 耐藥細(xì)胞株中p-AKT通路異常激活

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，在HCC827和HCC827OR細(xì)胞中，奧希替尼對(duì)細(xì)胞的抑制程度與p-EGFR和p-AKT的表達(dá)水平存在明顯的量效關(guān)系。與HCC827相比，HCC827OR細(xì)胞中的p-EGFR表達(dá)顯著下調(diào)，而p-AKT隨著奧希替尼的增高顯著上調(diào)，但HCC827細(xì)胞因無耐藥性，在100 nmol/L奧希替尼的條件下完全死亡（圖3）。在細(xì)胞增殖過程中，EGFR信號(hào)通路主要控制細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和凋亡，AKT通路則調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、周期長(zhǎng)短和存活能力［16-17］。因此，當(dāng)持續(xù)增加給藥濃度直至奧希替尼濃度大于IC50（100 nmol/L）時(shí)，HCC827的EGFR及下游的AKT磷酸化水平明顯下降，大量細(xì)胞失去增殖能力，并逐漸凋亡。而耐藥細(xì)胞株HCC827OR在在同一給藥濃度下，即使EGFR通路磷酸化水平較低無法調(diào)控細(xì)胞的增殖，通過p-AKT通路的激活，也能從旁路促進(jìn)耐藥細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，使得HCC827OR在100 nmol/L的奧希替尼給藥環(huán)境中保持良好的增殖活力。

圖3 在奧希替尼（0、1、10、100 nmol/L）作用48 h后，HCC827和HCC827OR細(xì)胞的關(guān)鍵信號(hào)通路蛋白的表達(dá)變化情況Fig.3 The effects of Osimertinib (0, 1, 10, 100 nmol/L) on the protein expression of HCC827 and HCC827OR cells after 48 h

2.5 細(xì)胞耐藥后增殖能力顯著增強(qiáng)

細(xì)胞周期是一個(gè)受到調(diào)控后發(fā)生有序活動(dòng)的過程。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，野生型HCC827細(xì)胞中G1期細(xì)胞的比例高達(dá)（55.07±4.71）%，S和M期的比例為（44.93±3.56）%。而奧希替尼耐藥的HCC827OR的G1期細(xì)胞的比例［（37.70±3.56）%］明顯減少，更多的細(xì)胞出現(xiàn)在S和M期，比例為（62.30±5.42）%。這說明HCC827細(xì)胞耐藥后出現(xiàn)了明顯的G2/M周期阻滯的特征，進(jìn)而表明其擁有了更強(qiáng)的增殖能力（圖4）。

圖4 HCC827和HCC827OR細(xì)胞的周期分布Fig.4 Cell cycle distribution of HCC827 and HCC827OR cells

2.6 細(xì)胞耐藥后遷移能力顯著增強(qiáng)

劃痕試驗(yàn)結(jié)果表明，與HCCC827細(xì)胞相比，HCC827OR在48和96 h后展示了更強(qiáng)的細(xì)胞遷移能力。我們推測(cè)，HCC827OR的這種高遷移能力與p-AKT的顯著上調(diào)密切相關(guān)（圖5）。NGS結(jié)果顯示，HCC827耐藥前后EGFR的基因豐度的降幅達(dá)到35.98%，導(dǎo)致HCC827OR的EGFR磷酸化通路的活化水平下降，對(duì)其調(diào)控的下游信號(hào)通路產(chǎn)生影響。Western blot試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EGFR下游p-AKT通路在HCC827OR中異常激活，而AKT是EGFR下游主要的信號(hào)通路之一。該通路不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，其磷酸化水平的增高還會(huì)顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移［18-19］，同時(shí)也是腫瘤細(xì)胞獲得性耐藥的機(jī)制之一，具備調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的能力。AKT通路磷酸化水平的顯著增加促使耐藥細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移能力。

圖5 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)比較親本細(xì)胞HCC827和耐藥株HCC827OR侵襲能力的差異（100×）Fig.5 Comparison of migration ability of HCC827 and HCC827OR cells in wound healing (100×)

3 討論

奧希替尼作為第三代EGFR-TKI抑制劑，給NSCLC患者特別是二代耐藥患者帶來了希望。但是，第三代耐藥細(xì)胞的出現(xiàn)警醒我們腫瘤細(xì)胞是復(fù)雜多變的。目前，市場(chǎng)上尚未有穩(wěn)定的奧希替尼耐藥細(xì)胞株出售。本研究通過篩選建立奧希替尼耐藥細(xì)胞株，為廣大科研工作者提供基因和表型穩(wěn)定的第三代EGFR-TKI抑制劑耐藥NSCLC細(xì)胞株。這對(duì)于探究腫瘤耐藥機(jī)制和尋找新的分子靶向治療藥物具有重要的意義。本研究選取NSCLC HCC827細(xì)胞株，通過間歇性大劑量沖擊和梯度遞增結(jié)合的方式誘導(dǎo)構(gòu)建奧希替尼獲得性耐藥株HCC827OR，在停止加藥誘導(dǎo)6個(gè)月后，細(xì)胞耐藥性未丟失［20］。與傳統(tǒng)的梯度遞增方法相比（10個(gè)月），本方法可以顯著縮短耐藥細(xì)胞株的篩選時(shí)間（7個(gè)月），所得細(xì)胞系具有穩(wěn)定耐藥的特點(diǎn)。本研究通過NGS測(cè)序分析了HCC827OR的EGFR基因突變情況，并通過Western blot檢測(cè)EGFR、AKT及其相應(yīng)磷酸化通路的蛋白表達(dá)情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，與HCC827相比，HCC827OR的EGFR基因突變的豐度下降，進(jìn)一步抑制了EGFR磷酸化通路。但是，其下游p-AKT通路被異常激活，使得在相同藥物濃度下，奧希替尼對(duì)耐藥細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制程度顯著降低。同時(shí)，耐藥細(xì)胞株的G2/M期阻滯以及細(xì)胞遷移能力的增加表明，HCC827OR耐藥細(xì)胞株具有更強(qiáng)的增值能力和侵襲性。

一代和二代EGFR-TKI抑制劑的耐藥性機(jī)制主要?dú)w因于EGFR20外顯子T790M突變，而第三代EGFR分子靶向藥奧希替尼的耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣?，F(xiàn)有的研究將奧希替尼細(xì)胞耐藥機(jī)制分為依賴EGFR的和非依賴EGFR的耐藥機(jī)制。依賴EGFR突變的耐藥途徑主要涉及EGFR的突變，擴(kuò)增和缺失，突變位點(diǎn)主要包括C797S、C797G、G798R、G796S、G796D、L718Q和L718V等區(qū)域的繼發(fā)性突變［11-15］，進(jìn)而降低藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性。非EGFR依賴的耐藥機(jī)制主要涉及旁路基因突變和表型轉(zhuǎn)變等，通過改變其他上下游肺癌驅(qū)動(dòng)基因的信號(hào)通路，如MET擴(kuò)增以及HER2、KARS、BRAF和P13K等基因突變［21-25］，借助其他通路的激活對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖起補(bǔ)償作用。本研究結(jié)果支持奧希替尼耐藥的HCC827是通過非EGFR依賴的旁路基因促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移的。

綜上所述，本研究通過間歇性大劑量沖擊和梯度遞增結(jié)合的方式篩選得到了奧希替尼耐藥細(xì)胞株HCC827OR，經(jīng)基因測(cè)序、關(guān)鍵蛋白檢測(cè)、細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移等方法鑒定，所得耐藥細(xì)胞株具有臨床奧希替尼耐藥的特點(diǎn)，這為后期耐藥機(jī)制的深度研究提供了有效的體外研究模型，為篩選和鑒定新的抗耐藥腫瘤分子靶向藥物提供了理想的靶標(biāo)。