黃桂香，李志偉，丁小鳳

（湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院基因功能與調(diào)控研究室，長(zhǎng)沙 410081）

肝癌是肝臟最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，占原發(fā)性肝癌的90%，是2020年全球癌癥相關(guān)死亡的第三大主要原因［1-3］。目前治療肝癌的主要方法包括手術(shù)切除、肝移植、放射線或化學(xué)藥物局部治療及綜合治療［4］。肝癌的典型特征是具有高度的細(xì)胞異質(zhì)性，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，這是導(dǎo)致治療反應(yīng)和預(yù)后不佳的主要原因。肝癌的異質(zhì)性特征主要?dú)w因于干細(xì)胞特征的干細(xì)胞亞群的存在。腫瘤組織中干細(xì)胞具有自我更新和分化的能力，進(jìn)而形成新的腫瘤［5-6］。由于肝癌發(fā)病隱秘，缺少特異性早期標(biāo)志物且進(jìn)展迅速，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)即被診斷為進(jìn)展期肝癌，即使采用最積極的治療，患者的生存率依然較低［7］。因此，進(jìn)一步研究肝癌腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移特性的分子機(jī)制對(duì)于尋找更好的治療策略來(lái)提高患者存活期具有重要的臨床意義。

轉(zhuǎn)錄因子是一類維持細(xì)胞生命活動(dòng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著非常重要的角色。AP-2轉(zhuǎn)錄因子家族由AP-2α、AP-2β、AP-2γ、AP-2δ和AP-2ε 5個(gè)成員組成，其表達(dá)具有組織和細(xì)胞特異性。在AP-2家族中，轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白2α（AP-2α）是最早被鑒定和研究的，是轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的重要調(diào)控因子，參與脊椎動(dòng)物的細(xì)胞黏附、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、組織分化、胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等多種生理病理過(guò)程［8-9］。轉(zhuǎn)錄因子AP-2的N端區(qū)域由一個(gè)激活域組成，C端包含一個(gè)約200個(gè)氨基酸的區(qū)域，負(fù)責(zé)DNA結(jié)合和二聚化［10］。其二聚化結(jié)構(gòu)域位于DNA結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)，包括富含脯氨酸/谷氨酰胺的結(jié)構(gòu)域以及堿性α-螺旋和堿性螺旋-跨度-螺旋（basic Helix-Span-Helix，bHSH）［11］。研究表明，AP-2α在多種腫瘤組織中存在異常表達(dá)，其表達(dá)程度與腫瘤類型、臨床分期、病理分化程度等有著密切的關(guān)系，并且AP-2α蛋白具有抑癌和促癌雙重作用。如AP-2α在黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌等多種類型的實(shí)體瘤中作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用，其表達(dá)的缺失與癌癥的進(jìn)展相關(guān)，并可預(yù)測(cè)不良預(yù)后［12-14］。但也有研究表明，AP-2α可以通過(guò)促進(jìn)可溶性因子的分泌和MMP-2的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)腫瘤、神經(jīng)嵴和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，引起腫瘤的發(fā)生［15-17］。

我們以前的研究發(fā)現(xiàn)：在肝癌細(xì)胞系中，AP-2α低表達(dá)或不表達(dá)；AP-2α過(guò)表達(dá)可降低肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，并且增加肝癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性［18］。研究發(fā)現(xiàn)，SOX9在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，并且可促進(jìn)肝癌的增殖、遷移和侵襲［19］。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道了AP-2α和SOX9在肝癌中的作用，但兩者之間的調(diào)控關(guān)系仍不清楚。本文主要探究AP-2α與SOX9之間的調(diào)控機(jī)制，以期為肝癌的臨床診治提供指導(dǎo)和新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

人類肝癌細(xì)胞系SMMC7721、人胚腎細(xì)胞HEK293均為實(shí)驗(yàn)室保存。pGL3-basic、pCMV-myc載體為實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo公司；T4連接酶、EX taq聚合酶購(gòu)自Vazyme公司。胎牛血清和Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco，DMEM）購(gòu)自Cellmax公司。DNA marker、蛋白marker購(gòu)自Thermo公司；轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000、青霉素/鏈霉素雙抗購(gòu)自Invitrogen公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購(gòu)自Milipore公司。AP-2α（3B5）單抗購(gòu)自Santa Cruz公司；SOX9抗體購(gòu)自ABclonal公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多抗購(gòu)自bioworld公司；羊抗鼠、羊抗兔二抗購(gòu)自正能生物技術(shù)有限公司。生物素標(biāo)記試劑盒、化學(xué)發(fā)光法凝膠遷移試驗(yàn)（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自Beyotim公司；谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferases，GST）純化凝珠購(gòu)自GE醫(yī)療公司；螢光試劑盒購(gòu)自Promega公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Vazyme公司；質(zhì)粒小量制備試劑盒、DNA膠回收試劑盒和組織細(xì)胞DNA/RNA提取試劑盒均購(gòu)自Magen公司；去內(nèi)毒質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出凍存的細(xì)胞，在37℃水浴鍋中快速凍融。所有細(xì)胞均在DMEM中培養(yǎng)，并添加10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素。將細(xì)胞置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 慢病毒穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立

在慢病毒試驗(yàn)操作中，將大約5×105個(gè)SMMC7721細(xì)胞接種于3.5 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度約至50%時(shí)進(jìn)行慢病毒感染。感染前將完全培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基，加入AP-2α過(guò)表達(dá)慢病毒或陰性對(duì)照慢病毒感染細(xì)胞，添加感染增強(qiáng)試劑HiTransG A以提高感染效率。感染12～16 h，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后，通過(guò)倒置熒光顯微鏡檢測(cè)感染效果，隨后對(duì)穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)行嘌呤霉素陽(yáng)性細(xì)胞篩選。

1.4 蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)

收集的細(xì)胞用補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解緩沖液提取蛋白質(zhì)。利用適當(dāng)濃度的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），上樣后進(jìn)行恒壓電泳，轉(zhuǎn)膜前先將聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜在甲醇中浸泡5 min左右，然后依次將海綿、濾紙、膠、PVDF膜、濾紙海綿夾在轉(zhuǎn)膜夾中恒壓轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)完膜后取出PVDF膜，用5%脫脂牛奶進(jìn)行室溫封閉1 h左右，然后孵育一抗，置于4℃的旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)子上旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。洗膜后根據(jù)一抗來(lái)源孵育相應(yīng)的二抗，通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)。

1.5 EMSA試驗(yàn)

構(gòu)建目的基因AP-2α的原核表達(dá)質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21細(xì)菌進(jìn)行異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)。配制適量的蛋白裂解液、清洗液和洗脫液，純化重組GST-AP-2α蛋白。合成覆蓋SOX9啟動(dòng)子區(qū)域AP-2α結(jié)合位點(diǎn)的特異性探針，參考碧云天試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行探針標(biāo)記。按照EMSA/凝膠轉(zhuǎn)移試劑盒的制造商說(shuō)明書，在含有GST-AP-2α和生物素標(biāo)記的野生型或突變序列的混合物中進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，在結(jié)合緩沖液中加入未標(biāo)記探針做為冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，室溫下孵育30 min。反應(yīng)混合物在4%非變性凝膠上電泳，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.6 螢光素酶試驗(yàn)

構(gòu)建目的基因SOX9啟動(dòng)子的螢光素酶報(bào)告載體pGL3-basic-SOX9，所用引物序列為：SOX9promoter F（CGCCCCCACTTTTGCTCTT）、SOX9promoter R（CCAGTCGTAGCCTTTGAGCA）。將HEK293細(xì)胞鋪于12孔板上，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%左右后，分別將pGL3-basic-SOX9、pCMV-Myc-AP-2α、pCMVMyc以及pCMV-LacZ共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，4～6 h后更換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，按照Promega公司的螢光素酶檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書測(cè)量熒光值。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR

利用細(xì)胞RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，利用細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，SOX9和AP-2α的mRNA表達(dá)水平通過(guò)β-actin標(biāo)準(zhǔn)化，所用引物序列如下。SOX9F：AGCGAACGCACATCAAGAC；SOX9R ：CTGTAGGCGATCTGTTGGGG ；AP-2αF ：AGGTCAATCTCCCTACACGAG ；AP-2αR ：GGAGTAAGGATCTTGCGACTGG ；β-actinF ：CACCATTGGCAATGAGCGGTTC ；β-actinR ：AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad、Image J軟件錄入數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)來(lái)自至少3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）。當(dāng)P<0.05時(shí)，結(jié)果被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 AP-2α抑制SOX9的轉(zhuǎn)錄活性

為了研究AP-2α對(duì)SOX9的調(diào)控作用，我們使用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合譜數(shù)據(jù)庫(kù)JASPAR預(yù)測(cè)了SOX9基因上游區(qū)域含有潛在的AP-2的結(jié)合位點(diǎn)，AP-2在進(jìn)化上保守的結(jié)合位點(diǎn)序列為GCCN3/4GGC。SOX9啟動(dòng)子區(qū)域含有2個(gè)AP-2的結(jié)合位點(diǎn)（圖1a）。一個(gè)潛在的AP-2結(jié)合位點(diǎn)（GCCCCGGGC）大約位于SOX9啟動(dòng)子區(qū)域中距離轉(zhuǎn)錄起始位-15～-7 bp的位置，另一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是GCCCCAGGA，位于+141～+149 bp的位置。

根據(jù)JASPAR預(yù)測(cè)結(jié)果，我們猜想AP-2α可能通過(guò)調(diào)控SOX9轉(zhuǎn)錄來(lái)影響其表達(dá)水平。接著，將包含預(yù)測(cè)的AP-2結(jié)合位點(diǎn)的SOX9啟動(dòng)子區(qū)域片段克隆到螢光素酶報(bào)告基因pGL3-basic中，分析AP-2α對(duì)SOX9轉(zhuǎn)錄活性的影響。螢光素酶結(jié)果顯示，在HEK293細(xì)胞中，隨著pCMV-Myc-AP-2α質(zhì)粒轉(zhuǎn)入量的增加，pGL3-basic-SOX9的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性相比對(duì)照組越來(lái)越低（圖1b）。說(shuō)明AP-2α抑制了SOX9的轉(zhuǎn)錄活性，并且呈劑量依賴性。

圖1 AP-2α抑制SOX9的轉(zhuǎn)錄活性Fig.1 AP-2α inhibition of SOX9 transcriptional activity

2.2 AP-2α與SOX9的啟動(dòng)子區(qū)域相互結(jié)合

為了進(jìn)一步探究AP-2α對(duì)SOX9的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式是直接結(jié)合還是間接結(jié)合，我們構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒GST-AP-2α，純化出GST-AP-2α蛋白（圖2a）。接著，利用EMSA試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)SOX9啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域與純化后的GST-AP-2α蛋白在體外的結(jié)合能力。EMSA結(jié)果顯示，生物素標(biāo)記的SOX9第一位點(diǎn)探針序列（F1：CCCCCTGCCCCGGGCCCGCGTAT ；R1 ：ATACGCGGGCCCGGGGCAGGGGG）與GST-AP-2α蛋白結(jié)合，在非變性SDS-PAGE中檢測(cè)到滯留的生物素信號(hào)，而第二個(gè)位點(diǎn)探針序列（F2：ACACGCGGCCCCAGGAGAACAC；R2：GTGTTCTCCTGGGGCCGCGTGT）未檢測(cè)到滯留的生物素信號(hào)，且突變位點(diǎn)探針序列（mut1 F：CCCCCTAATCCGGTACCGCGTAT ；mut1 R ：ATACGCGGTACCGGATTAGGGGG ；mut2 F ：ACACGCGAATCCATAAGAACAC ；mut2 R ：GTGTTCTTATGGATTCGCGTGT）均未檢測(cè)到滯留的生物素信號(hào)（圖2b）。以上結(jié)果說(shuō)明，AP-2α可以直接特異性地結(jié)合至SOX9的啟動(dòng)子區(qū)域。

圖2 AP-2α與SOX9的啟動(dòng)子區(qū)域直接結(jié)合Fig.2 AP-2α can directly bind to the promoter region of the SOX9 gene

2.3 在肝癌細(xì)胞中AP-2α下調(diào)SOX9的表達(dá)

前面的試驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證實(shí)了AP-2α可以直接調(diào)控SOX9，抑制SOX9的轉(zhuǎn)錄活性。為了檢測(cè)AP-2α對(duì)SOX9mRNA水平的影響，我們采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)了SOX9的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在AP-2α過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞中，SOX9的mRNA水平有顯著降低（圖3a）。為進(jìn)一步檢測(cè)AP-2α是否可以在蛋白水平上抑制SOX9的表達(dá)，用過(guò)表達(dá)AP-2α的慢病毒感染SMMC7721細(xì)胞，并篩選過(guò)表達(dá)AP-2α的陽(yáng)性細(xì)胞，用蛋白免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞內(nèi)SOX9的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)AP-2α可下調(diào)SOX9的表達(dá)（圖3b）。這些結(jié)果說(shuō)明，不管是在mRNA水平還是在蛋白水平上，AP-2α都抑制了SOX9的表達(dá)。

圖3 在SMMC7721肝癌細(xì)胞中AP-2α下調(diào)SOX9的表達(dá)Fig.3 AP-2α inhibits the expression of SOX9 in SMMC7721 hepatoma cell

3 討論

SOX9是SRY盒基因超家族的成員，屬于SOXE基因的一個(gè)亞組，是調(diào)節(jié)高遷移率族盒DNA結(jié)合和反式激活域的重要轉(zhuǎn)錄因子［20-21］。SOX9的失調(diào)已成為各種癌癥的驅(qū)動(dòng)因素，其表達(dá)被認(rèn)為是不同條件下的惡性生長(zhǎng)。SOX9既可以作為腫瘤抑制基因，也可以作為癌基因在癌癥中發(fā)揮作用。如其在宮頸癌、膀胱癌和黑色素瘤中起抑癌作用［22-24］，而在胃癌、乳腺癌和膠質(zhì)瘤等多種癌癥中是作為癌基因發(fā)揮作用的［25-27］。腫瘤抑制因子SOX9可調(diào)節(jié)腫瘤中的Wnt/β-catenin信號(hào)［28］；作為原癌基因，其可激活不同的信號(hào)通路，引起腫瘤的發(fā)生，增加癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，導(dǎo)致癌癥的預(yù)后不良［26-29］。

在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，SOX9在包括肝癌的多種類型腫瘤中上調(diào)，并作為癌基因在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［30-31］。其可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、衰老和自我更新。研究發(fā)現(xiàn)，SOX9在肝癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)肝癌的增殖、遷移和侵襲［19］。此外，SOX9還參與了包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤干細(xì)胞特異性基因網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，包括自我更新、分化和細(xì)胞外基質(zhì)重塑［32］。在肝癌中，SOX9作為癌基因發(fā)揮著促癌的作用，而AP-2α作為抑癌基因發(fā)揮著抑癌的作用。本文主要在體外研究肝癌中AP-2α與SOX9之間的調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)AP-2α可以與SOX9啟動(dòng)子區(qū)域直接結(jié)合，并且呈劑量依賴性抑制SOX9的轉(zhuǎn)錄活性。在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)AP-2α可以在mRNA水平和蛋白水平上抑制SOX9的表達(dá)。

有報(bào)道稱，SOX9可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移，它在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中的表達(dá)水平高于低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系［33］。SOX9在侵襲和遷移期間也促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），并賦予干細(xì)胞表型，導(dǎo)致化療藥物治療腫瘤的耐藥性。此外，肝癌中SOX9的高表達(dá)與降低無(wú)病生存率和降低總體生存率顯著相關(guān)［34］?；谇懊娴膱?bào)道以及我們的研究結(jié)果，我們推測(cè)肝癌的進(jìn)展與SOX9的上調(diào)和AP-2α的下調(diào)相關(guān)。一方面，肝癌中因缺少AP-2α對(duì)SOX9的負(fù)調(diào)控，導(dǎo)致SOX9表達(dá)異常增加，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，導(dǎo)致腫瘤向正常組織擴(kuò)散；另一方面，SOX9表達(dá)增加可賦予肝癌細(xì)胞干細(xì)胞特性，最終導(dǎo)致患者預(yù)后不良。提高肝癌中AP-2α的表達(dá)可能會(huì)逆轉(zhuǎn)這些結(jié)果，延長(zhǎng)患者的存活期。因此，針對(duì)SOX9及其上游AP-2α的治療策略可能有助于肝癌的臨床治療和患者預(yù)后。我們將繼續(xù)研究SOX9與AP-2α在肝細(xì)胞癌中的作用及調(diào)控信號(hào)通路。

總之，本文闡明了肝癌中轉(zhuǎn)錄因子AP-2α對(duì)SOX9的調(diào)控機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步探討肝癌臨床治療方案提供了理論依據(jù)和新思想。