方小雪，張鋮鋒，吳新勝

（寧波微萌種業(yè)有限公司 浙江寧波 305101）

蘿卜（Raphanus satirusL.）屬十字花科，一年或二年生草本植物，主要以膨大的肉質(zhì)直根作為產(chǎn)品器官，富含糖、維生素和蘿卜硫素等營養(yǎng)物質(zhì)，具有一定的藥用食療價值[1]。我國蘿卜種植區(qū)域遍布南北各省，常年種植面積達120 萬hm2，總產(chǎn)量約4000 萬t，是主要的大宗蔬菜作物之一[2]。蘿卜雜交品種兼具抗病性強、商品性好和產(chǎn)量高等優(yōu)點，有良好的經(jīng)濟效益，是目前我國栽培蘿卜的主要類型。圓都1 號蘿卜是由寧波微萌種業(yè)有限公司在2018 年培育的雜交新品種，具有肉質(zhì)脆甜爽口、不易糠心和耐抽薹等特點。至2021 年，圓都1 號蘿卜種子銷售量逐年增長，在浙江、江蘇、上海、安徽等地均有種植。蘿卜雜交種圓都1 號的進一步推廣需要更多優(yōu)質(zhì)種子作為保障，同時也需要高效精準的種子檢測技術(shù)作為支撐。

雜種優(yōu)勢在生物界普遍存在，是指雜合體在一種或多種性狀上優(yōu)于兩個親本的現(xiàn)象[3]。雜種優(yōu)勢利用作為遺傳應(yīng)用的典型代表，已在水稻、玉米和小麥等作物中取得了豐碩成果[4-6]。近年來，蘿卜的雜種優(yōu)勢利用逐漸受到重視，已有多個性狀優(yōu)良的蘿卜雜交新品種上市。在蘿卜雜交制種過程中，常因混入親本自交種子或其他品種種子等生物學(xué)混雜問題而降低種子純度，進而影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，種子純度鑒定是保證蘿卜雜交種質(zhì)量的必要檢測流程，也是蘿卜雜交種優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的堅實保障。目前，我國蘿卜種子純度鑒定主要以田間表型鑒定為主，該鑒定方法極易受環(huán)境因素干擾，存在田間表型特征不易把握和耗時過長等問題[7]。根據(jù)種子純度鑒定的發(fā)展方向，結(jié)合現(xiàn)有的技術(shù)手段，急需建立一種能快速精準鑒定蘿卜雜交種種子純度的方法。

InDel（Insertion/Deletion，InDel）多態(tài)性分子標(biāo)記是基于插入或缺失位點兩側(cè)的序列來設(shè)計特異性引物并進行PCR 擴增的標(biāo)記[8]。過去，SSR 分子標(biāo)記作為主要的分子標(biāo)記技術(shù)，早已在黃瓜、甜瓜和蘿卜等作物的純度鑒定中成功應(yīng)用[9-11]。但應(yīng)用SSR 分子標(biāo)記做純度鑒定的工作相對繁瑣，需要從大量的引物庫中篩選，會耗費大量時間和精力。相比SSR 標(biāo)記，InDel 標(biāo)記不僅設(shè)計引物的工作量明顯減少，而且擴增產(chǎn)物的帶型清晰簡單，穩(wěn)定性和分離效果更佳[12]。近年來，InDel 標(biāo)記已成功應(yīng)用于青梗菜、甘藍等作物的種子純度鑒定，檢測速度和準確性均得到驗證[13-14]。由此可知，應(yīng)用InDel 標(biāo)記開展蘿卜雜交種的純度鑒定工作是可行的。

筆者基于蘿卜全基因組數(shù)據(jù)（Raphanus sativus（assembly Rs1.0））對蘿卜雜交種圓都1 號親本（父本：2348M832，母本：V01A107238）進行全基因組重測序，通過對比分析父本與母本的重測序結(jié)果，利用二者間的差異性位點設(shè)計InDel 標(biāo)記引物，以此進行圓都1 號蘿卜的純度鑒定。通過與田間表型鑒定結(jié)果相互驗證，以期開發(fā)出具有實用性的InDel 分子標(biāo)記，為以后開展大規(guī)模蘿卜雜交種純度鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為圓都1 號蘿卜種子，由寧波微萌種業(yè)有限公司雜交制種后所得；父本2348M832 由福建省福州市閩侯縣的地方蘿卜品種原白蘿卜經(jīng)5 代自交分離、純化后所得；母本V01A107238 由浙江省上虞縣地方品種湖田蘿卜經(jīng)4 代自交分離、純化后所得。

1.2 器材與試劑

器材：離心管（規(guī)格：2.0 mL、1.5 mL）、鋼珠（直徑：2 mm）、多組織研磨儀、水浴鍋、離心機、移液槍、PCR 板、PCR 儀、電泳儀、電泳槽、BIO-RAD 凝膠成像儀。試劑：CTAB DNA 提取液、NaHSO3、異戊醇、CHCl3、ddH2O、異丙醇、75%乙醇、瓊脂粉、電泳液、2×TaqMaster Mix、Maker I。

1.3 方法

1.3.1 田間小區(qū)種植 2021 年11 月20 日將圓都1號雜交種播種于寧波微萌種業(yè)有限公司邱隘農(nóng)場設(shè)施大棚內(nèi)，父、母本各種25 株，株距和行距分別為15 cm 和20 cm，栽培面積約60 m2，共計360 株。植株生長期間有2 株缺失，剩余358 株作為試驗對象。

1.3.2 田間純度鑒定方法 田間358 株圓都1 號蘿卜植株播種后35 d 開始觀察植株田間表型性狀，3～5 d 觀察1 次，共3 次。

1.3.3 DNA提取 于2022 年1 月10 日，隨機選取圓都1 號蘿卜及其父、母本植株各10 株，用打孔器在植株新展開功能葉上取樣，獲得蘿卜圓都1號及其父、母本的混合樣品，并置于裝有鋼珠（直徑2 mm）的2 mL 離心管內(nèi)。離心管置于多樣品組織研磨儀內(nèi)，設(shè)置60 Hz 并運行90 s 獲得樣品勻漿。勻漿中加入700 μL 含有NaHSO3（NaHSO3濃 度10.4 g · L-1）的CTAB 溶液，并 以65 ℃水 浴30 min。水浴后，加入700 μL CHCl3和異戊醇混合液（CHCl3與異戊醇的體積比為24∶1）并離心（8000 r·min-1，10 min），提取400 μL 上清液置于1.5 mL 離心管。上清液加入預(yù)冷異丙醇（IPA）300 μL 并離心（12 000 r·min-1，10 min），倒出上清液留底，以75%乙醇漂洗后風(fēng)干，用ddH2O 溶解獲得DNA 水溶液，即混合基因池。

于2022 年1 月23 日，從待測的358 株圓都1號蘿卜的新葉上取樣，以CTAB 法提取DNA，純度檢測后以ddH2O 溶解稀釋至100～200 ng·μL-1，存放于-20 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.3.4 全基因組重測序及InDel 位點篩選 父、母本混合基因池送到天津諾禾致源科技股份有限公司進行全基因組重測序，獲得原始數(shù)據(jù)（raw data）。原始數(shù)據(jù)去除接頭序列和數(shù)據(jù)質(zhì)控后獲得clean data，并通過BWA 軟件比對蘿卜全基因組數(shù)據(jù)，對父、母本變異位點進行對比和篩選，其結(jié)果用SAMTOOLS 軟件去除重復(fù)并檢測InDel 位點，軟件ANNOVAR 對InDel 位點進行基因注釋[15]。

1.3.5 引物設(shè)計 根據(jù)重測序預(yù)測到的InDel位點，選取父本缺失、母本無變異的InDel＞40 bp 的位點，利用Primer Premier 5.0 軟件在差異位點兩側(cè)保守區(qū)設(shè)計引物。為確保擴增的特異性，引物設(shè)計參數(shù)特別考慮GC 含量40%～50%，退火溫度50～60 ℃，引物片段長度17～25 bp，引物PCR 擴增產(chǎn)物長度200～300 bp。

1.3.6 PCR 體系和電泳 PCR 擴增采用近岸蛋白質(zhì)科技有限公司的2×TaqMaster Mix。PCR體系為20 μL：DNA 模板1.5 μL（DNA 質(zhì)量濃度100～200 ng·μL-1），正反向引物各1.5 μL（引物質(zhì)量濃度10 ng·μL-1），2×TapMaster Mix 10 μL，超純水5.5 μL。PCR 擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性20 s，51.5 ℃退火20 s，72 ℃延 伸40 s，循 環(huán)35 次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。采用A3-1大型凝膠電泳系統(tǒng)，設(shè)置350 V 電壓和500 mA 電流，以4%瓊脂糖凝膠電泳50 min，最后通過BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.3.7 計算公式 純度/%=（檢測總量-雜株數(shù)量）/檢測總量×100； （1）

吻合率/%=（室內(nèi)結(jié)果/田間結(jié)果）×100。（2）

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

通過對圓都1 號蘿卜親本進行全基因組重測序，篩選InDel 位點并設(shè)計出6 對引物（表1）。6 對引物對圓都1 號蘿卜及其父、母本的DNA 樣品進行PCR擴增，其瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1 所示。根據(jù)電泳結(jié)果，引物L(fēng)-1 父本擴增不出條帶被淘汰；引物L(fēng)-5和L-6 親本間擴增條帶無多態(tài)性被淘汰。引物L(fēng)-2、L-3 和L-4 在父本和母本間的擴增條帶都存在特異性，雜交種圓都1 號可擴增出父、母本2 個條帶；但引物L(fēng)-3 父本和母本間的擴增條帶差異較小，電泳檢測時間長；引物L(fēng)-2 在雜交種圓都1 號存在非特異性擴增條帶，只有引物L(fēng)-4 帶型清晰且電泳檢測時間合理。因此，試驗最終選定引物L(fēng)-4 用于蘿卜雜交種圓都1 號的純度鑒定，其父本和母本擴增片段大小分別為254 bp 和297 bp。

表1 6 對蘿卜InDel 標(biāo)記信息

圖1 不同引物對圓都1 號蘿卜及其父、母親本DNA 樣品的瓊脂糖凝膠電泳

2.2 引物L(fēng)-4檢測圓都1號蘿卜植株純度

利用引物L(fēng)-4 對田間358 株圓都1 號蘿卜進行純度檢測，其中編號為26、85、121、257、284 的蘿卜植株均只擴增出母本條帶，其余353 株蘿卜均為F1型雙條帶，其中編號121～168 與241～288 蘿卜植株的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2 所示。因此，通過純度鑒定計算，可以獲得該批圓都1 號蘿卜的純度為98.60%。

圖2 引物L(fēng)-4 檢測圓都1 號蘿卜部分植株的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3 田間表型鑒定圓都1號蘿卜植株純度

圓都1 號蘿卜雜交種植株的田間表型為葉叢半直立、葉色綠、株幅大、裂刻中；蘿卜圓都1 號母本植株的田間表型為葉叢半直立、葉色深綠、株幅小、裂刻中；二者的肉質(zhì)根皮色和肉色均為白色。異花粉雜株無特定的田間表型性狀，需要與F1在葉色、株幅和肉質(zhì)根顏色等表型性狀上全面比較。通過對田間358 株蘿卜植株的長勢、葉色和株幅等性狀進行鑒定，有8 株因長勢較弱、葉色深綠、株幅小等特點被鑒定為母本或異花粉雜株，獲得純度為97.77%。圖3 中，白框內(nèi)的蘿卜相比其他植株葉色更深和株幅更小，因此被鑒定為雜株。

圖3 圓都1 號蘿卜與親本雜株田間表型鑒定

2.4 InDel標(biāo)記檢測與田間表型鑒定純度結(jié)果對比

通過引物L(fēng)-4 分子檢測與田間表型鑒定對358株蘿卜植株開展純度檢測，純度結(jié)果如表2 所示。引物L(fēng)-4 分子鑒定有5 株母本或異花粉雜株，純度為98.60%；田間表型鑒定有8 株雜株，純度為97.77%。引物L(fēng)-4 分子鑒定與田間鑒定的結(jié)果對比，編號為156、166、229 的3 株植株鑒定結(jié)果存在差異，其余350 株圓都1 號雜交種和5 株雜株的檢測結(jié)果一致，吻合度高達99.16%。

表2 圓都1 號蘿卜InDel 標(biāo)記與田間表型觀察鑒定純度結(jié)果對比

2.5 InDel標(biāo)記與田間表型鑒定結(jié)果差異分析

對編號為156、166、229 的3 株植株再通過引物L(fēng)-4 分子檢測，結(jié)果如圖4 所示，擴增出父本和母本2 條條帶。同時，留存編號156、166、229 植株繼續(xù)生長以待后續(xù)繼續(xù)觀察，3 周后其表型開始與F1一致。因此，引物L(fēng)-4 能夠代替田間表型鑒定對圓都1 號蘿卜做純度鑒定。

圖4 InDel 標(biāo)記對田間鑒定母本雜株的驗證

3 討論與結(jié)論

種子純度是雜交種質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，直接影響著農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。純度鑒定作為保障種子純度的必要流程，目前主要以田間表型鑒定和分子標(biāo)記等方式對種子純度做出鑒定[16]。

在田間表型鑒定過程中，需要在植株不同生長階段進行多人多次鑒定，從而降低人為主觀臆想和環(huán)境變化等因素對鑒定結(jié)果帶來的誤差。筆者試驗中，編號156、166、229 植株因長勢弱、葉色較深被鑒定為母本或異花粉雜株，與分子檢測結(jié)果不同。在實際蘿卜栽培中，無法為每個植株提供相同且適宜的生長環(huán)境，局部的土壤肥力缺失或病蟲害脅迫均會影響圓都1 號蘿卜的正常生長。已有大量的研究結(jié)果表明，不適宜的生長環(huán)境或脅迫條件下植株的生長會受到抑制，其葉面積大幅減小，葉色加深[17-18]。因此，可能是因局部不利的生長環(huán)境造成編號156、166、229 蘿卜植株的表型性狀與母本相似，從而影響田間表型的鑒定判斷。

SSR 分子標(biāo)記因引物廣譜性好、操作簡單和成本低等特點，一直是重要的DNA 分子標(biāo)記技術(shù)，已在水稻、油菜、西瓜和棉花等作物的種子純度鑒定中被廣泛應(yīng)用[19]。隨著全基因組測序技術(shù)的發(fā)展，InDel 標(biāo)記逐漸被人所熟知，并成功應(yīng)用于青梗菜、甘藍等蔬菜作物的純度鑒定。InDel 標(biāo)記的多態(tài)性相比SSR 標(biāo)記要低，其帶型簡單、分布較密，在遺傳分析或基因診斷中的重現(xiàn)性、準確性和分辨率大大提高[20]。目前，SSR 分子標(biāo)記已成功應(yīng)用于北斗75和七星蘿卜品種的雜交種純度鑒定[21-22]，但應(yīng)用In-Del 標(biāo)記開展蘿卜雜交種純度鑒定尚未見相關(guān)報道。筆者在圓都1 號蘿卜全基因組重測序的基礎(chǔ)上，利用父母本間的InDel 位點設(shè)計引物，以此利用InDel 分子標(biāo)記對蘿卜雜交種進行純度鑒定。結(jié)果顯示，InDel 標(biāo)記檢測與田間表型鑒定結(jié)果吻合度高達99.16%，且檢測結(jié)果直觀快速，無人為主觀臆想和環(huán)境因素的干擾。因此，InDel 標(biāo)記能夠應(yīng)用于蘿卜雜交種圓都1 號的純度鑒定，并兼具高效性和準確性等優(yōu)點。

高效準確的InDel 標(biāo)記純度檢測有助于圓都1號蘿卜的快速推廣，并顯著減少公司在純度鑒定中所需的時間和精力。在實際應(yīng)用中，考慮到分子標(biāo)記純度鑒定需要高通量快速進行，設(shè)計InDel 引物時應(yīng)綜合考量擴增產(chǎn)物的質(zhì)量、穩(wěn)定性和分離速度。筆者從引物設(shè)計、引物篩選、大規(guī)模檢測、田間表型鑒定結(jié)果比對和再驗證等流程出發(fā)，對如何應(yīng)用InDel 標(biāo)記開展蘿卜雜交種圓都1 號鑒定工作進行了系統(tǒng)性闡述，也為今后其他雜交種應(yīng)用InDel標(biāo)記提供了借鑒。