金 釗,張艷芳,周 華,紀(jì)雯雯,魏筱詩(shī),王 翀,茅慧玲

(浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院·動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州311300)

隨著全球變暖的加劇，近10年來(lái)環(huán)境溫度不斷上升[1]。動(dòng)物機(jī)體在嚴(yán)重的外界熱環(huán)境刺激下自身的產(chǎn)熱與散熱失衡，從而引起非特異性應(yīng)答反應(yīng)，即熱應(yīng)激。有調(diào)查指出58%以上的奶牛生活在溫濕度指數(shù)高達(dá)68以上的高溫亞熱帶地區(qū)，造成奶牛熱應(yīng)激[2]。

熱應(yīng)激能夠加劇活性氧(Reactive oxygen species，ROS)種類(lèi)的生成，打破自由基和抗氧化系統(tǒng)的平衡，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激[3-5]。且熱應(yīng)激狀態(tài)下，奶牛胃腸道收縮以重新分配外周血液來(lái)增加機(jī)體熱量的消耗，血流量減少導(dǎo)致腸上皮缺氧，從而損傷腸道的完整性，造成其生理功能下降，增加健康問(wèn)題的風(fēng)險(xiǎn)，最終降低奶牛產(chǎn)奶量[6]。因此，探索減輕奶牛痛苦，減少熱應(yīng)激引起經(jīng)濟(jì)損失的有效方法具有十分重要的意義。

本試驗(yàn)利用奶牛小腸上皮細(xì)胞系，構(gòu)建奶牛小腸上皮細(xì)胞體外熱應(yīng)激模型，為進(jìn)一步研究奶牛腸道在熱應(yīng)激狀態(tài)下的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收規(guī)律提供平臺(tái)和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

試劑：DMEM培養(yǎng)基和磷酸緩沖鹽溶液(上海生工生物工程有限公司)；胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司)；青鏈霉素和細(xì)胞凍存液(杭州昊天生物技術(shù)有限公司)；胰蛋白酶(Gibco公司)；活性氧試劑盒(碧云天生物)；抗氧化相關(guān)酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)；CCK-8試劑盒(MCE公司)。

儀器：CO2培養(yǎng)箱(THermo)、倒置顯微鏡(Motic)、酶標(biāo)儀(THermo)、T6 紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與試驗(yàn)處理

永生化奶牛小腸上皮細(xì)胞系(取自空腸段)購(gòu)自上海賽齊生物工程有限公司[7]。將奶牛小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 mg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2的無(wú)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。

試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，43 ℃處理奶牛小腸細(xì)胞0、2、4、8、12 h，其中0 h即為對(duì)照組(37 ℃)，測(cè)定細(xì)胞存活率及細(xì)胞活性氧含量，初步篩選適宜的作用時(shí)間。在篩選出適宜43 ℃作用時(shí)間的基礎(chǔ)上，再測(cè)定抗氧化指標(biāo)，進(jìn)一步確定建立奶牛小腸上皮細(xì)胞熱應(yīng)激模型的條件。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 細(xì)胞存活率檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的奶牛小腸上皮細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于96 孔板上，每孔100 μL，經(jīng)43 ℃分別處理0、2、4、8、12 h后，將試驗(yàn)孔更換為等體積新鮮培養(yǎng)液，加入10 μLCCK-8溶液，放回培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定試驗(yàn)孔在450 nm波長(zhǎng)下的吸光度。

細(xì)胞存活率% =(處理孔OD-空白OD)/(對(duì)照孔OD-空白OD)×100

1.4 細(xì)胞活性氧測(cè)定

細(xì)胞經(jīng)43 ℃分別處理0、2、4、8、12 h后，收集各孔細(xì)胞，超聲波破碎得到待測(cè)樣品。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)利用熒光探針DCFH-DA測(cè)定細(xì)胞ROS含量，數(shù)據(jù)以熒光值相對(duì)于0 h的倍數(shù)表示。

1.5 細(xì)胞抗氧化酶活性測(cè)定

細(xì)胞經(jīng)熱應(yīng)激(43 ℃)處理4 h后，收集各孔細(xì)胞，超聲波破碎得到待測(cè)樣品。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定總超氧化物歧化酶(total superoxid dismutase, T-SOD)、銅鋅超氧化物歧化酶(copper and zinc superoxide dismutase, CuZn-SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和丙二醛(malonaldehyde, MDA)。其中T-SOD活性采用WST-1法測(cè)定，單位定義為每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)SOD活力單位(U)，比色波長(zhǎng)為450 nm；CuZn-SOD采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)有2種SOD，即CuZn-SOD和Mn-SOD，二者相加等于T-SOD，樣本經(jīng)前處理后Mn-SOD活力喪失，但CuZn-SOD活力不變，比色波長(zhǎng)為550 nm；GSH-Px活性采用比色法測(cè)定，單位定義為每0.1 mL反應(yīng)液在37 ℃反應(yīng)5 min，扣除非酶促反應(yīng)作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為1個(gè)酶活力單位，比色波長(zhǎng)為412 nm；MDA采用硫代巴比妥酸法測(cè)定，比色波長(zhǎng)為532 nm。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行整理后用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件中的ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，其中熱應(yīng)激處理時(shí)間選擇的數(shù)據(jù)用Duncan氏方差分析進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果P<0.05表示差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞存活率及活性氧含量

由表1可見(jiàn)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)。2 h組存活率76.1%，接近80%，細(xì)胞損傷較??；4 h組細(xì)胞存活率顯著降低至62.6%，符合建立熱應(yīng)激模型的條件；8 h和12 h組存活率進(jìn)一步降低。

表1 熱應(yīng)激時(shí)間對(duì)奶牛小腸細(xì)胞存活率及活性氧含量的影響Table 1 Effects of heat stress on the cell viability andreactive oxygen species of cow intestinal epithelial cells

細(xì)胞內(nèi)ROS含量也隨著熱應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)顯著上升(P<0.05)。

2.2 熱應(yīng)激對(duì)奶牛小腸上皮細(xì)胞形態(tài)的影響

由圖1可見(jiàn)，對(duì)照組(37 ℃)細(xì)胞貼壁良好，形態(tài)正常且分布均勻；而熱應(yīng)激處理組(43 ℃)細(xì)胞間隙變大并出現(xiàn)脫落，且隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)胞死亡數(shù)增加，尤其在12 h處理組，細(xì)胞呈現(xiàn)大片的死亡。

圖1 熱應(yīng)激時(shí)間對(duì)奶牛小腸上皮細(xì)胞形態(tài)的影響(×100)Fig. 1 Effects of heat stress on the morphology of cow intestinal epithelial cells(×100)

2.3 熱應(yīng)激對(duì)奶牛小腸上皮細(xì)胞抗氧化相關(guān)酶活性的影響

由表2可見(jiàn)，與對(duì)照組(37 ℃)相比，熱應(yīng)激組(43 ℃)總超氧化物歧化酶活、銅鋅合超氧化物歧化酶活和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活顯著降低(P<0.05)，丙二醛含量顯著增加(P<0.05)。

表2 熱應(yīng)激對(duì)奶牛小腸上皮細(xì)胞抗氧化相關(guān)酶活性的影響Table 2 Effects of heat stress on the anti-oxidative enzyme activities U/mg prot

3 討 論

小腸是動(dòng)物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要器官，同時(shí)也是機(jī)體重要的防御屏障之一。當(dāng)動(dòng)物處于熱應(yīng)激時(shí)，機(jī)體動(dòng)用全身血液以維持自身的散熱功能，此時(shí)腸道便會(huì)因缺血缺氧而受到嚴(yán)重?fù)p傷[8]。小腸上皮細(xì)胞是一類(lèi)更新速度很快的細(xì)胞，目前，在細(xì)胞水平研究奶牛熱應(yīng)激的報(bào)道主要集中在乳腺[9-10]，對(duì)奶牛小腸上皮的研究較少。因此，建立奶牛小腸上皮細(xì)胞熱應(yīng)激模型，對(duì)于揭示熱應(yīng)激狀態(tài)下，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收代謝機(jī)制，研究開(kāi)發(fā)緩解熱應(yīng)激營(yíng)養(yǎng)添加劑等有著重要意義。

本研究前期設(shè)定3個(gè)溫度(41 ℃，42 ℃及43 ℃)下分別處理奶牛小腸上皮細(xì)胞1 h，2 h及 3h，以摸索熱應(yīng)激的適宜溫度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅在43 ℃處理下細(xì)胞存活率有影響，因此選擇43 ℃作為熱應(yīng)激的處理溫度(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。在熱應(yīng)激43 ℃處理下，細(xì)胞存活率與處理時(shí)間呈反比，處理時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞存活率越低。細(xì)胞存活率過(guò)高說(shuō)明外界刺激條件不顯著，相反，存活率過(guò)低則說(shuō)明細(xì)胞產(chǎn)生不可逆損傷。因此，選擇一個(gè)合適的細(xì)胞存活率作為建模參數(shù)至關(guān)重要。孔令聯(lián)等[7]認(rèn)為，不同細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型呈現(xiàn)的條件因細(xì)胞本身的耐受力不同而各異，選用細(xì)胞存活率的范圍在50%～70%為宜。細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除一旦發(fā)生失衡，過(guò)多的ROS使得機(jī)體自身的抗氧化系統(tǒng)處于過(guò)載狀態(tài)，破壞脂肪，蛋白質(zhì)及DNA的正常代謝，擾亂正常細(xì)胞的功能從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[11-12]。ROS的產(chǎn)生在熱應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用[13]。本研究選擇的熱應(yīng)激處理時(shí)間為4 h，該條件下細(xì)胞的存活率為62.6%且ROS產(chǎn)量與對(duì)照組相比顯著上升，說(shuō)明細(xì)胞發(fā)生了損傷且細(xì)胞存活率在建模適宜范圍之內(nèi)，符合建模條件。

正常狀態(tài)下，動(dòng)物機(jī)體內(nèi)氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基能被體內(nèi)的抗氧化酶及時(shí)清除。而當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生變化，如斷奶，熱應(yīng)激等，機(jī)體的這種動(dòng)態(tài)平衡便被打破，自由基不能被及時(shí)清除，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激[14]。機(jī)體內(nèi)，SOD是對(duì)抗自由基的第一道防線，GSH-Px可以清除超氧陰離子自由基，二者是機(jī)體抗過(guò)氧化能力的重要指標(biāo)，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起關(guān)鍵作用[15]。另一方面，自由基過(guò)量產(chǎn)生導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物MDA含量顯著增加[16]，最終造成細(xì)胞損傷[17]。本試驗(yàn)中，熱應(yīng)激處理細(xì)胞4 h后，抗氧化酶SOD，CuZn-SOD和GSH-Px的活性顯著下降，導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化防御能力下降，且MDA的含量顯著增加，說(shuō)明細(xì)胞的氧化-抗氧化平衡系統(tǒng)被打破，發(fā)生了氧化應(yīng)激。Wang等[12]研究報(bào)道奶牛卵巢顆粒細(xì)胞在40 ℃處理后顯著降低SOD和GSH-Px的酶活性，增加MDA的含量。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)，西門(mén)塔爾和秦川雜交牛的空腸上皮細(xì)胞經(jīng)43 ℃處理2 h后SOD、GSH-Px酶活力顯著降低，MDA含量顯著增加。這些結(jié)果均說(shuō)明細(xì)胞在熱應(yīng)激狀態(tài)下會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激，而熱應(yīng)激處理的溫度不同可能與研究的細(xì)胞不同有關(guān)，不同物種的不同細(xì)胞對(duì)溫度的耐受程度存在較大差異。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)中，43 ℃條件下作用奶牛小腸上皮細(xì)胞4 h，可成功構(gòu)建奶牛小腸上皮細(xì)胞熱應(yīng)激模型，為今后研究熱應(yīng)激狀態(tài)下奶牛腸道養(yǎng)分消化吸收提供平臺(tái)和基礎(chǔ)。