謝曉韋，孫雨晴，陸龍喜，霍進(jìn)喜，潘新平，胡桂燕＊

（1.浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 杭州 311215； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，浙江 杭州 310021；3.浙江省疾病預(yù)防控制中心，浙江 杭州 310051； 4.浙江菊絲明生物科技有限公司，浙江 嘉興 314500）

桑黃（Phellinus linteus.）是一種寄生在闊葉樹(shù)上非常珍貴的藥用真菌，有很高的藥用價(jià)值，作為中藥的應(yīng)用歷史悠久，在《神農(nóng)百草經(jīng)》和《本草綱目》中均有記載。中醫(yī)中主要用來(lái)治療婦科炎癥和脾虛泄瀉，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明桑黃具有調(diào)節(jié)免疫抗炎，抗癌等功效[1]；桑黃提取物具有多種生物有效活性成分，如桑黃多酚、多糖、黃酮等，在抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤、抗衰老、提高免疫力等生物功效[2-4]。痤瘡、濕疹等常見(jiàn)的有損美觀的皮膚癥狀，青少年痤瘡發(fā)病度接近60%，它是由遺傳、內(nèi)分泌、過(guò)敏原、微生物等多方面因素引發(fā)，其中細(xì)菌、真菌等致病菌在上述問(wèn)題皮膚中檢出率很高。林麟等對(duì)149例濕疹患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)121例攜帶細(xì)菌，其中金黃色葡萄球菌是最為常見(jiàn)的細(xì)菌（42.96%）[5]。昝文華等研究發(fā)現(xiàn)，痤瘡病損中葡萄球菌的檢出率與痤瘡丙酸桿菌接近，且應(yīng)用葡萄球菌菌苗治療痤瘡收到了良好的效果[6]。高峰等調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在痤瘡患者中馬拉色菌的帶菌率高達(dá)83.57%[7]。以上提示表明，痤瘡、濕疹等常見(jiàn)皮膚病癥與某些細(xì)菌感染有關(guān)。

本項(xiàng)目結(jié)合上述兩大因素，通過(guò)優(yōu)選提取方法提取人工培養(yǎng)桑黃子實(shí)體中桑黃多酚為主的有效活性成分，開(kāi)展桑黃有效物（多酚-桑黃醇溶組分中的主要成分）的抑菌作用及機(jī)理研究，并應(yīng)用在抑菌抗菌產(chǎn)品和化妝品中，研發(fā)了“菊絲明皮膚抑菌霜”和“桑黃祛痘護(hù)膚膜”，并分別進(jìn)行動(dòng)物抑菌試驗(yàn)和人體皮膚療效觀察試驗(yàn)，觀察產(chǎn)品的抑菌性能和問(wèn)題皮膚的治療效果，為桑黃有效物的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供更廣寬的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

桑黃由浙江省農(nóng)科院蠶桑與茶葉研究所提供，桑黃有效物由本學(xué)科的實(shí)驗(yàn)室提??；蠶繭由浙江省農(nóng)科院蠶茶研究所提供，絲膠蛋白液由本學(xué)科的實(shí)驗(yàn)室水解；聚乙烯醇、卡波爾、丙三醇、脂肪醇、脂肪酸酯、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、菌種、凈化水等輔料，由杭州仁裕貿(mào)易有限公司和杭州高琦化妝品有限公司提供。

1.1.2 儀器

主要實(shí)驗(yàn)儀器：臭氧發(fā)生器，廣州佳環(huán)電器科學(xué)有限公司；超聲波提取罐，昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申勝生物技術(shù)有限公司；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；灌裝設(shè)備，無(wú)錫市靈美日用化工機(jī)械廠；輔助設(shè)備：目篩、紫外線消毒燈、電子天平、水浴鍋、烘箱、培養(yǎng)箱等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)品制備工藝流程

利用浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主培育的桑黃子實(shí)體，經(jīng)粉碎，浸提，超聲波處理，過(guò)濾，濃縮后，得到精制桑黃多酚有效物；絲膠繭經(jīng)脫膠、生物降解，過(guò)濾，濃縮，得到精制的絲膠蛋白液；凈化水和輔料加熱溶解，然后加入桑黃多酚有效物和絲膠蛋白液，分別經(jīng)均質(zhì)乳化和混合攪拌，冷卻靜止，得到桑黃抑菌霜和桑黃絲膠蛋白祛痘膜產(chǎn)品。其工藝流程如圖1所示。

圖1 提取和應(yīng)用試驗(yàn)工藝流程Figure 1 Extraction and Application Test Process Flow

1.2.2 桑黃多酚的提取純化

將干燥桑黃子實(shí)體粉碎過(guò)80目篩，取樣本4份，分別用水、75%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯按1 g∶10 mL浸提，并在60℃水浴中超聲波（100 Hz）處理5 h，然后將不同溶劑處理獲得的提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，去除溶劑成份，至小體積獲得提取液，65℃烘箱中烘干，獲得桑黃多酚粗提物。桑黃多酚的純化方法如下：稱(chēng)取100 g活化的D101大孔樹(shù)脂加入錐形瓶中，加入無(wú)水乙醇浸過(guò)樹(shù)脂，完全吸收后補(bǔ)充去離子水，靜置15 min后傾倒醇水溶液，繼續(xù)加入去離子水后傾倒醇水溶液，此反復(fù)洗滌至無(wú)醇味，用濾紙吸干樹(shù)脂表面的水分。向錐形瓶?jī)?nèi)加入2 g/L的多酚提取物溶液，密封置于搖床內(nèi)室溫下120 r/min振蕩24 h。傾出上清，樹(shù)脂用超純水沖洗5遍，然后用95%乙醇洗脫樹(shù)脂，直至洗脫液顏色較為澄清。合并洗脫液，用旋蒸儀濃縮至小體積后置于65℃烘箱中烘干，獲得純化后的桑黃多酚。

1.2.3 總酚含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)量提取物100 mg，加入2 mL相應(yīng)提取試劑充分溶解，用水稀釋至10 mL后，取溶液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加入福林酚試劑1 mL，加水10 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min，離心，取上清液，以相應(yīng)的試劑為空白，在760 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品中的多酚含量用沒(méi)食子酸當(dāng)量表示。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 桑黃不同溶劑提取物的得率及多酚含量

由表1可知：采用水、75%乙醇為溶劑浸提，粗提物得率和多酚得率均較高；綜合提取成本、操作方便程度、環(huán)保等因素，以水、75%乙醇為溶劑浸提容易規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

表1 不同溶劑對(duì)桑黃多酚的提取效果Table1 Polyphenol Content of Different Solvent Extracts

2.2 桑黃乙醇提取物的抑菌作用

桑黃乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有明顯的抑制作用，在0.02 g/mL質(zhì)量濃度下對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率達(dá)到93.6%，對(duì)大腸桿菌的抑制率為89.9%；在0.0667 g/mL質(zhì)量濃度下對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率可達(dá)100%。

2.3 “菊絲明皮膚抑菌霜”的抑菌作用

依據(jù)GB15979—2002《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》的要求，產(chǎn)品抑菌率≥50%才符合標(biāo)準(zhǔn)。選用試驗(yàn)菌株為大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 6538、白色念珠菌ATCC 10231，中和劑為D/E中和肉湯，消毒液為原液。在檢測(cè)樣品“菊絲明皮膚抑菌霜”原液和對(duì)照樣品無(wú)菌水上滴加菌懸液0.1 mL，混勻作用至預(yù)定時(shí)間，適當(dāng)稀釋?zhuān)龌罹溆?jì)數(shù)。菊絲明皮膚抑菌霜樣品對(duì)試驗(yàn)菌株的抑菌效果見(jiàn)表2所示。采用添加了桑黃提取物的菊絲明?皮膚抑菌霜樣品原液，經(jīng)檢測(cè)，在作用時(shí)間為2 min、5 min、10 min、20 min時(shí)，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌抑菌率均大于99.9%，該樣品對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌均有較強(qiáng)抑菌作用。

表2 菊絲明皮膚抑菌霜的抑菌作用Table 2 Antibacterial Effect of Jusiming Skin Antibacterial Cream

2.4 桑黃絲膠蛋白祛痘護(hù)膚膜人體功效評(píng)價(jià)

2021～2022年期間，本課題組人員將實(shí)驗(yàn)室研制的桑黃絲膠蛋白祛痘護(hù)膚膜100余盒，免費(fèi)提供給我院內(nèi)外的粉刺、痤瘡患者試用，目前收回試用報(bào)告30余份，其中女性21名，男性9名，年齡最小的16歲，最大的83歲，粉刺、痤瘡患者在16～30歲之間，病期3年以上；色素沉著、黃褐斑、手足皸裂患者在30歲以上，病期大于10年。使用方法：洗臉后將桑黃絲膠蛋白祛痘護(hù)膚膜輕輕涂在面部和皮膚皸裂處，約30 min左右待膏體成膜后，用手揭去膜層；粉刺、痤瘡患者2 d～3 d使用一次，色素沉著、黃褐斑、手足皸裂患者每日使用一次；每周觀察一次，持續(xù)觀察一個(gè)月。療效判斷標(biāo)準(zhǔn)：顯效，癥狀明顯消退，自我感覺(jué)癥狀顯著減輕；有效，癥狀不同程度消退，自我感覺(jué)癥狀減輕；無(wú)效：癥狀無(wú)改善。經(jīng)初步觀察，試用效果總結(jié)如表3所示。桑黃絲膠蛋白祛痘護(hù)膚膜對(duì)粉刺、痤瘡色素沉著、黃褐斑、手足皸裂均有一定的效果。

表3 桑黃絲膠蛋白祛痘護(hù)膚膜人體療效觀察結(jié)果Table3 Human Skin Efficacy Observation Results of Phellinus Anti-acne Skin Care Mask

3 結(jié)論

綜合提取成本、操作便易程度、環(huán)境保護(hù)、提取物安全性能等因素，我們最后選擇75%乙醇為溶劑浸提，這套工藝方法容易規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。試驗(yàn)結(jié)果表明桑黃乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有明顯的抑制作用。研制成功的抗（抑）菌產(chǎn)品菊絲明?皮膚抑菌霜具有抑菌性能，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌均有較強(qiáng)抑菌作用。痤瘡、粉刺是年輕人面部常見(jiàn)的皮膚疾病，因青春期人體內(nèi)雄性激素水平較高，從而引起皮膚皮脂分泌過(guò)多，毛孔中堵塞，排泄不暢，導(dǎo)致細(xì)菌感染，發(fā)生皮膚炎癥。桑黃有效物多酚等成份，具有消炎、抗炎、活血、生肌的作用。本研究經(jīng)人體功效評(píng)價(jià)結(jié)果表明，桑黃絲膠蛋白祛痘護(hù)膚膜對(duì)粉刺、痤瘡色素沉著、黃褐斑、手足皸裂有一定的效果。外用桑黃絲膠蛋白祛痘護(hù)膚膜后，液體面膜使用后滲透入毛孔內(nèi)，留在表面的部份在30分鐘內(nèi)慢慢干燥，讓皮膚表面形成局部“封包”狀態(tài)，促進(jìn)面膜中的桑黃等有效成人的吸收；液體面膜干燥后，洗除或撕掉時(shí)，同時(shí)去除了皮膚表面和毛孔中的不潔物質(zhì)，保持毛孔暢通，最終使痤瘡、粉刺慢慢治愈。因此，結(jié)合桑黃的實(shí)際特性，筆者認(rèn)為桑黃乙醇提取物在抑菌產(chǎn)品和護(hù)膚品中添加應(yīng)用存在較大的可能性，可以進(jìn)一步研究，以擴(kuò)大桑黃的應(yīng)用范圍，延伸桑黃多元化利用產(chǎn)業(yè)鏈，創(chuàng)造更多更大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。