張秋林，林慧婷，周格，溫紫凌，李書穩(wěn)，甘海寧

（1.廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)工程技術(shù)研究院），廣東廣州 510095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510006）

糖尿病是由多因素引起的、胰島素分泌或作用不足所致的、以高血糖為主要特征的慢性代謝紊亂性疾病，其對(duì)人類健康的影響巨大，若不加以控制或控制不佳，可引發(fā)心腦血管、肝臟、腎臟、神經(jīng)等其他系統(tǒng)的急慢性并發(fā)癥，是繼心腦血管疾病和惡性腫瘤之后的第三大危害人類健康的重要慢性非傳染性疾病[1]。隨著人們生活水平的提高、飲食條件和習(xí)慣的改變及人口老齡化的快速加劇，該病的患病率正在逐年上升，并已成為全球性的公共衛(wèi)生問題之一。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟發(fā)布的糖尿病地圖集顯示：至2017年，全球糖尿病患者已達(dá)到4.51億人，并且至2045年將增加至6.93億人[2]；而在我國，糖尿病人數(shù)早已超過了1.4億，其中以2型糖尿病為主要類型，相關(guān)報(bào)道顯示其可占90%以上[3-4]。由此可見，2型糖尿病的防控形勢(shì)嚴(yán)峻，但其病因病機(jī)卻至今尚未完全闡明，因此建立可靠的、能較好地模擬2型糖尿病的動(dòng)物模型對(duì)其發(fā)病機(jī)制、防治及藥物開發(fā)具有重要意義。

目前，在高糖高脂飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上進(jìn)行鏈脲佐菌素腹腔注射是建立大鼠2型糖尿病模型常見而成熟的方法，具有操作簡(jiǎn)單、短周期、性價(jià)比高等優(yōu)點(diǎn)，但不同文獻(xiàn)所報(bào)道的注射劑量差異較大，范圍多在30～65mg/kg[5-8]。由于具體制作方法常常會(huì)影響到模型制作的成效、血糖穩(wěn)定性、死亡率等，甚至成為決定實(shí)驗(yàn)?zāi)芊耥樌M(jìn)行的關(guān)鍵因素，因此在制作大鼠2型糖尿病模型時(shí)如何選擇鏈脲佐菌素的注射劑量、第一次注射量不足時(shí)如何處理等問題就顯得極其重要。本研究擬探索制作大鼠2型糖尿病模型的鏈脲佐菌素腹腔注射方式及劑量，以及第一次注射量不足時(shí)的處理方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)成年（6～8周齡）雄性SD大鼠，體重200±20g，購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：XCXK（粵）2018-0002。飼養(yǎng)于廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院）SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)房籠子喂養(yǎng)，飼以高糖高脂飼料，自由攝食飲水，環(huán)境溫度20℃～25℃、濕度45%～55%，12h光照周期，每天75%乙醇消毒。所有動(dòng)物相關(guān)的實(shí)驗(yàn)過程均經(jīng)過廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)工程技術(shù)研究院）倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合倫理學(xué)要求。

1.1.2 喂養(yǎng)飼料 常規(guī)飼料為SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：粵飼證（2019）05073，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：GB14924-2010，成分：粗蛋白≥180g/kg、粗纖維≤50g/kg、粗脂肪≥40g/kg。高糖高脂飼料購自常州鼠一鼠二生物科技有限公司（貨號(hào)：D12451i），其中含蛋白質(zhì)20%、碳水化合物35%、脂肪45%。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 鏈脲佐菌素購自北京索萊寶科技有限公司（型號(hào)：S8050，規(guī)格：1g/瓶），-20℃保存；0.1mol/L、pH 4.5無菌檸檬酸緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司（型號(hào)：C1013，規(guī)格：500mL/瓶）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 本實(shí)驗(yàn)在廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院）SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，許可證號(hào)：SYXK（粵）2020-0059。

1.2.1 藥品及制備 使用0.1mol/L、pH 4.5無菌檸檬酸緩沖液兌入鏈脲佐菌素粉劑配置成30mg/mL、20mg/mL、10mg/mL三種規(guī)格的鏈脲佐菌素溶液，隨用隨配，配置完成后即時(shí)使用。

1.2.2 第一批大鼠 選取100只大鼠在飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)1周，并隨機(jī)分為正常對(duì)照組（20只）和糖尿病模型組（80只），均在造模前稱體重及查血糖、尿常規(guī)、腎功能等指標(biāo)，留取標(biāo)本前一天禁食不禁水，尿液在代謝籠中留取。模型組大鼠高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素50mg/kg，每天觀察其狀態(tài)、測(cè)量微量血糖（尾部取血）、記錄死亡情況等，72h后以血糖值高于16.7mmol/L作為成模標(biāo)準(zhǔn)。正常對(duì)照組則自始至終喂養(yǎng)常規(guī)飼料，腹腔注射相當(dāng)容積的0.1mol/L、pH 4.5無菌檸檬酸緩沖液。

1.2.3 第二批大鼠 由于第一批大鼠注射鏈脲佐菌素3天后開始死亡，至注射4周后80只大鼠死亡達(dá)52只，故購買了第二批84只大鼠再次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組8只、模型組76只。正常對(duì)照組處理方式與第一批大鼠相同；模型組大鼠則高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素30mg/kg，觀察大鼠狀態(tài)、每天測(cè)量微量血糖等，72h后血糖未達(dá)16.7mmol/L者，自小劑量至較大劑量分別補(bǔ)充注射鏈脲 佐 菌 素10mg/kg、15mg/kg、35mg/kg，直 至 血 糖≥16.7mmol/L。

1.3 觀察指標(biāo)每天測(cè)量微量血糖，統(tǒng)計(jì)微量血糖≥16.7mmol/L的比例，以及造模成功情況和死亡率。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均值加減標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均值比較采用兩獨(dú)立樣本t/t′檢驗(yàn)。無序計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)（f）、構(gòu)成比（P）表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 第一批大鼠 采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（50mg/kg）的80只大鼠在72h后微量血糖≥16.7mmol/L的大鼠有75只，其中7只微量血糖超過33.3mmol/L，平均24.70±5.67mmol/L，顯著高于正常對(duì)照組的5.86±0.93mmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），造模成功率達(dá)93.75%。然而，大鼠造模后精神狀態(tài)變差，不活躍，毛發(fā)不柔順，出現(xiàn)腹瀉、脫水，進(jìn)食減少，部分大鼠出現(xiàn)陰囊水腫、血尿等；造模3天后，大鼠開始出現(xiàn)死亡，至注射鏈脲佐菌素4周時(shí)，大鼠死亡率達(dá)65.00%（52/80）。

2.2 第二批大鼠 采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（30mg/kg）的76只大鼠在72h后微量血糖多數(shù)升高，但最高僅有14.9mmol/L，雖與正常對(duì)照組血糖值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但造模成功率為0；于1周后第二次補(bǔ)充腹腔注射鏈脲佐菌素（10mg/kg），72h后僅有1只大鼠微量血糖超過16.7mmol/L，達(dá)到20.6mmol/L；于第3周給血糖未達(dá)標(biāo)的大鼠第三次補(bǔ)充腹腔注射鏈脲佐菌素（15mg/kg），72h后測(cè)定大鼠微量血糖無明顯變化，無大鼠血糖值達(dá)到16.7mmol/L，且均在5.3～7.9mmol/L；于第4周給血糖未達(dá)標(biāo)的大鼠第四次補(bǔ)充腹腔注射鏈脲佐菌素（35mg/kg），72h后有70只大鼠微量血糖≥16.7mmol/L，造模成功率達(dá)92.11%；兩組各階段血糖情況比較見表1。在死亡情況方面，第一次注射鏈脲佐菌素（30mg/kg）后第6天及第四次補(bǔ)充注射鏈脲佐菌素（35mg/kg）后3天、第8周后分別死亡1只（血糖14.7mmol/L）、2只（血 糖26.9mmol/L和20.7mmol/L）和2只（血 糖27.8mmol/L和29.6mmol/L），共5只大鼠死亡，死亡率為6.58%，顯著低于第一批的65.00%；而成功率為92.11%，與第一批的93.75%相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表2。

表1 第二批大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素各階段的微量血糖情況比較（±s）

表1 第二批大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素各階段的微量血糖情況比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，⑴P＜0.01

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表2 兩批大鼠造模結(jié)果比較（f，P）

3 討論

2型糖尿病是人體內(nèi)胰島素缺乏或相對(duì)缺乏所致的、以高血糖為主要特征的慢性內(nèi)分泌代謝性疾病，其中胰島素抵抗在其發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，內(nèi)臟脂肪過度堆積可促使脂肪細(xì)胞因子的分泌，與葡萄糖代謝、胰島素敏感性相關(guān)的瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素、鋅-α2-糖蛋白等在糖脂代謝中發(fā)揮特定作用的脂肪細(xì)胞因子的失調(diào)致使胰島素抵抗的發(fā)生[9]，從而使胰島素作用下降，體內(nèi)代償性分泌胰島素而出現(xiàn)高胰島素血癥；加之長期、過量高糖高脂飲食易損傷胰島細(xì)胞，影響胰島β細(xì)胞對(duì)胰島素抵抗的代償能力，糖耐量迅速惡化，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生[10]。2型糖尿病具有發(fā)病率和致殘率高、并發(fā)癥多等特點(diǎn)，且其發(fā)病率越來越高，但其病因病機(jī)及有效的防治措施仍在探索當(dāng)中，因此穩(wěn)定的糖尿病動(dòng)物模型的建立對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制、藥物的療效及其作用機(jī)制等方面的研究具有重要的科研和臨床意義。

目前，在高糖高脂飼料喂養(yǎng)基礎(chǔ)上聯(lián)合鏈脲佐菌素注射是糖尿病動(dòng)物模型構(gòu)建的主流方法。鏈脲佐菌素是一種DNA烷基化試劑（氨基葡萄糖-亞硝基脲），其亞硝基脲部分是胰島β細(xì)胞毒性的關(guān)鍵，可通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（GLUT-2）進(jìn)入胰島β細(xì)胞并發(fā)揮破壞作用，影響糖代謝水平，從而誘導(dǎo)糖尿病的發(fā)生[11-12]。與其他藥物相比，鏈脲佐菌素?fù)p傷胰島β細(xì)胞的威力大且具有高選擇性，對(duì)肝腎的危害較小，其誘發(fā)的2型糖尿病更好地模擬了人類的發(fā)病過程，故被大范圍使用[13]；但其在水溶液中見光會(huì)因變旋而失效，成模率會(huì)隨著時(shí)間延長而逐漸降低，相關(guān)研究顯示鏈脲佐菌素放置1.5h后成模率僅為60%[14]，因此應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。

盡管鏈脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病模型已經(jīng)非常成熟且廣泛應(yīng)用，但如何有效提高建模的成功率、降低死亡率且血糖能長期穩(wěn)定在較高水平，在實(shí)際操作中還是存在困難，其涉及的因素較多，如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和方法的選擇，以及注射的方式、時(shí)機(jī)及劑量等等。首先，大鼠是鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病最常用的動(dòng)物模型，而大鼠的品種、年齡、性別等均會(huì)對(duì)建模產(chǎn)生影響：根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?，國?nèi)通常會(huì)選擇SD或Wistar大鼠，實(shí)踐結(jié)果顯示SD大鼠對(duì)于實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的癥狀有比Wistar大鼠更強(qiáng)的抵抗力和更低的病死率，且自發(fā)緩解現(xiàn)象更少[5]；此外，成年大鼠、雄性大鼠的成模率分別高于幼鼠和雌性大鼠，雄性大鼠還可以避免受孕對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的影響[15]，因此選用了成年雄性SD大鼠構(gòu)建動(dòng)物模型。其次，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，隨著高糖高脂飼料喂養(yǎng)的時(shí)間延長，成模率也會(huì)降低，喂養(yǎng)周期大多在4～8周內(nèi)[13]。為了提高成模率，本實(shí)驗(yàn)在高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后即開始行鏈脲佐菌素注射。另外，鏈脲佐菌素注射通常有腹腔注射或尾靜脈注射兩種方式，雖然尾靜脈注射所誘導(dǎo)的糖尿病模型更穩(wěn)定且重復(fù)性較好[16]，但其操作難度更大，且若注射過快可能會(huì)對(duì)心臟造成負(fù)擔(dān)，甚至導(dǎo)致心力衰竭[17]，因此選擇操作更簡(jiǎn)便、方法更易掌握的腹腔注射。

鏈脲佐菌素的注射劑量是對(duì)大鼠糖尿病模型成模率影響最大的因素，盡管有大量文獻(xiàn)報(bào)道可供借鑒，但依照其造模方法在實(shí)踐過程中也常常會(huì)遇到一些問題，如本實(shí)驗(yàn)注射鏈脲佐菌素劑量稍大則一次性成模率非常高，但大鼠死亡率隨之升高，對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)帶來了不良影響，甚至難以為繼；若注射劑量太小，一次性成模率又很低，也會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如前所述，鏈脲佐菌素一次性腹腔注射劑量范圍多在30～65mg/kg，也有分次注射不同劑量造模者[18]，聯(lián)合高糖高脂飼料喂養(yǎng)可在減少注射量的同時(shí)提高成模率。

本實(shí)驗(yàn)第一批大鼠采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素50mg/kg，成模率高達(dá)93.75%，但造模后第3天即開始大量死亡，死亡率高達(dá)65.00%，以至于研究無法繼續(xù)進(jìn)行。很顯然，50mg/kg的注射劑量明顯過大，雖然成模率高，但會(huì)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞大量破壞，使血糖迅速升高，引起酮癥酸中毒而死亡[19-20]，致使大鼠死亡率過高，不可取。

在吸取第一批大鼠的教訓(xùn)后，第二批大鼠在同等條件下一次性腹腔注射鏈脲佐菌素30mg/kg，雖然造模后血糖明顯升高，但無一達(dá)到成模標(biāo)準(zhǔn)，顯然該劑量太低，亦不可?。浑S后分別補(bǔ)充注射10mg/kg、15mg/kg的鏈脲佐菌素，血糖均無法達(dá)標(biāo)。因此，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素30mg/kg無法達(dá)到造模要求，1周內(nèi)補(bǔ)充注射10mg/kg、15mg/kg劑量也不能成功造模。第四次注射35mg/kg劑量72h后，大鼠成模率達(dá)到了92.11%，成模率與第一批相近，但大鼠死亡率大幅下降，至第8周僅為6.58%。由此推測(cè)，在高糖高脂飼料喂養(yǎng)基礎(chǔ)上間隔1周兩次腹腔注射鏈脲佐菌素30～35mg/kg是比較理想的造模方法，與Zhang M等[18]間隔1周、連續(xù)2周注射鏈脲佐菌素30mg/kg的報(bào)道一致。

曾有文獻(xiàn)報(bào)道[21]，高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周、注射鏈脲佐菌素30mg/kg的成模率最高（80%～85%）且死亡率低，而60mg/kg劑量死亡率最高（可達(dá)75%）。但本實(shí)驗(yàn)30mg/kg劑量的成模率很低，須在二次注射35mg/kg劑量后才將成模率提升至92.11%、死亡率降至6.58%。由此推測(cè)，同樣小劑量腹腔注射鏈脲佐菌素，一次性腹腔注射可能其穩(wěn)定性并不高，而分次注射可以彌補(bǔ)該缺陷。因此，高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周、間隔1周兩次腹腔注射鏈脲佐菌素30～35mg/kg可能是建立大鼠2型糖尿病模型較為合適的方法，其成模率較高、大鼠死亡率低，還可規(guī)避大劑量注射引起胰島β細(xì)胞廣泛破壞（大鼠未死亡的情況下）而向1型糖尿病模型轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)[12]，有利于今后2型糖尿病發(fā)病機(jī)制與治療干預(yù)研究工作的開展。