陳燁，孫治雷，吳能友，劉昌嶺，徐翠玲，辛友志，曹紅，耿威，張喜林，翟濱，孫運(yùn)寶，李晶，張棟，閆大偉，呂泰衡

1.自然資源部天然氣水合物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國地質(zhì)調(diào)查局青島海洋地質(zhì)研究所，青島 266237

2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家試點(diǎn)海洋實(shí)驗(yàn)室海洋礦產(chǎn)資源評價(jià)與探測技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室，青島 266237

甲烷是二氧化碳之外最重要的溫室氣體，在百年尺度上的增溫潛能是CO2的28倍（IPCC, 2014）[1]。一般認(rèn)為，甲烷的成因包括生物成因和非生物成因兩種。非生物成因形成的甲烷是指在油頁巖的高溫加熱分解或在熱液系統(tǒng)水巖反應(yīng)等過程中無機(jī)碳與氫氣高溫合成的熱成因甲烷，而大氣中80%的甲烷來自生物成因甲烷，該過程是在微生物的參與下完成的[2]。海洋占全球表面積的70%，每年產(chǎn)生的甲烷量為85～300 Tg，90%的甲烷在釋放到大氣圈之前會被由微生物參與的AOM所消耗[3-4]。甲烷厭氧氧化過程分為以SO42-為電子受體的硫酸鹽還原型甲烷厭氧氧化[5]（sulfate-reduction dependent anaerobic methane oxidation, S-AOM）、以NO3-/NO2-為電子受體的反硝化型甲烷厭氧氧化[6]（denitrificationdependent anaerobic methane oxidation, D-AOM）以及后來發(fā)現(xiàn)的以Fe3+和Mn4+為最終電子受體的甲烷厭氧氧化(metal (Fe3+and Mn4+)-Dependent Anaerobic Methane Oxidation, Metal-AOM)[7]。AOM 在調(diào)控全球甲烷收支平衡以及緩解因甲烷引起的溫室效應(yīng)等方面扮演著十分重要的角色，已成為微生物生態(tài)學(xué)和生物地球化學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

海洋沉積物是一個(gè)重要的生物地球化學(xué)反應(yīng)器，有機(jī)質(zhì)在運(yùn)移、沉降、降解及埋藏的過程中，會伴隨著一系列的生化反應(yīng)。海洋沉積物中蘊(yùn)藏著豐富的微生物，據(jù)估計(jì)，海洋沉積物大約含有2.9×1029個(gè)微生物細(xì)胞，相當(dāng)于4.1 PgC，占地球總活體生物量的0.6%[8]。棲居在沉積物表層的微生物，利用氧氣作為電子受體將復(fù)雜有機(jī)質(zhì)進(jìn)行降解。氧氣在表層范圍內(nèi)被快速耗盡后，亞硝酸鹽/硝酸鹽、鐵錳等金屬離子和硫酸根成為微生物代謝的主要電子受體，將有機(jī)質(zhì)進(jìn)行厭氧降解，產(chǎn)生二氧化碳或甲烷。游離甲烷氣以及溶解甲烷在高壓低溫的條件下，與水聚合成一種類似冰的具有籠型結(jié)構(gòu)的晶體——天然氣水合物，較為穩(wěn)定地儲存在沉積物中。當(dāng)海底溫度和壓力條件發(fā)生改變時(shí)，海底水合物會發(fā)生分解，產(chǎn)生的甲烷氣體在向上運(yùn)移的過程中，與孔隙水中的硫酸根發(fā)生AOM反應(yīng)，并在沉積物中形成硫酸鹽-甲烷轉(zhuǎn)換帶（sulfate methane transition zone，SMTZ）（圖1）。此外，ANME 古菌還可以利用NO3-、Fe3+以及Mn4+電子受體，將甲烷氧化成二氧化碳（圖1）。AOM過程將產(chǎn)生HCO3-和HS-，這兩種產(chǎn)物和孔隙水中的Ca2+和Fe2+結(jié)合，生成碳酸鹽巖、黃鐵礦、重晶石、石膏等多種礦物質(zhì)。

圖1 海洋沉積物中甲烷的遷移與轉(zhuǎn)化過程Fig.1 The process of methane migration and transformation in marine sediments

隨著分子生物學(xué)技術(shù)和海底勘探技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，近些年來關(guān)于海洋環(huán)境中甲烷代謝過程的研究有了長足的發(fā)展，尤其是新的甲烷代謝方式和新的甲烷代謝微生物不斷的被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)，人們對甲烷代謝微生物在海洋環(huán)境中的分布模式有了新的認(rèn)識。深入了解和研究海洋生境中微生物介導(dǎo)的甲烷代謝過程及其機(jī)理，對進(jìn)一步理解海洋碳循環(huán)和控制甲烷氣體的排放都有重要意義。本文主要對海洋環(huán)境中參與甲烷產(chǎn)生和氧化的微生物的種類及其在海洋環(huán)境中的分布特征進(jìn)行了總結(jié)，此外，還對不同類型的產(chǎn)甲烷代謝途徑和甲烷氧化途徑進(jìn)行了梳理，最后對未來的研究方向做出了展望。

1 產(chǎn)甲烷菌及產(chǎn)甲烷途徑

1.1 產(chǎn)甲烷菌的種類

產(chǎn)甲烷菌是一類嚴(yán)格的厭氧古菌，生成的甲烷是厭氧呼吸的最終產(chǎn)物[9]。傳統(tǒng)上，科學(xué)界認(rèn)為產(chǎn)甲烷菌只屬于廣古菌門，可分為2大類6大目，第1 類 ClassⅠ，包括甲烷球菌目（Methanococcales）、甲烷桿菌目（Methanobacteriales）、甲烷超高溫菌目（Methanopyrales）；第 2 類 Class Ⅱ則包括甲烷胞菌目（Methanocellales）、甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales）以及甲烷微菌目（Methanomicrobiales）[10-11]。然而，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，許多新型產(chǎn)甲烷古菌類群被發(fā)現(xiàn)。這些新型產(chǎn)甲烷古菌包括隸屬于廣古菌門的產(chǎn)甲烷菌馬賽球菌目（Methanomassiliicoccales ）[12]、Methanofastidiosa(WSA2)[13]和Methanonatronarchaeia[14]及深古菌門（Bathyarchaeota）[15]、 韋 斯 特 古 菌 門 （Verstraetearchaeota）[16]以及地古菌門（Geoarchaeota）[17]等。

1.2 產(chǎn)甲烷菌代謝途徑

產(chǎn)甲烷菌依賴于其他微生物將復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為簡單的小分子化合物（氫、二氧化碳、乙酸鹽、甲基類化合物），因而作用于厭氧氧化分解有機(jī)質(zhì)的最后環(huán)節(jié)。有機(jī)質(zhì)的厭氧分解需要一系列具有食物鏈關(guān)系的微生物群落完成。首先，水解細(xì)菌通過向胞外分泌水解酶，將蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類物質(zhì)等大分子化合物分解為簡單的有機(jī)化合物如葡萄糖、脂肪酸單體。隨后發(fā)酵細(xì)菌將簡單有機(jī)化合物轉(zhuǎn)化為一些活躍的化學(xué)小分子物質(zhì)，如脂肪酸、醇類、氨、二氧化碳、氫氣和硫化氫等。最后產(chǎn)甲烷菌利用乙酸、氫氣、二氧化碳和一碳化合物產(chǎn)生甲烷（圖2）。傳統(tǒng)的3種產(chǎn)甲烷代謝途徑已被學(xué)術(shù)界廣泛認(rèn)可：H2/CO2還原型、乙酸發(fā)酵型和甲基營養(yǎng)型（圖2）[9]。在 H2/CO2還原途徑中，CO2首先被甲酰甲烷呋喃脫氫酶（Fdh）還原為甲?；S后甲?；c甲基呋喃（MFR）結(jié)合形成甲?；谆秽–HO-MFR），此時(shí)甲?；D(zhuǎn)移到四氫甲烷蝶呤（H4MPT）上形成次甲基復(fù)合物，次甲基復(fù)合物再依次被還原為次甲基（≡CH）、亞甲基（=CH）和甲基（-CH3），隨后甲基在CoM甲基轉(zhuǎn)移酶（Mtr）作用下轉(zhuǎn)移至還原態(tài)的輔酶M（HS-CoM）上，最后，在甲基輔酶M還原酶（MCR）催化下生成甲烷。絕大多數(shù)產(chǎn)甲烷菌均可以利用H2/CO2還原產(chǎn)生甲烷。乙酸發(fā)酵型途徑是乙酸鹽的碳——碳鍵被打開，裂解為甲基基團(tuán)和羧基基團(tuán)，隨后羧基基團(tuán)被氧化成二氧化碳并產(chǎn)生電子供體H2，甲基基團(tuán)被H2還原為甲烷。目前為止只發(fā)現(xiàn)Methanosarcina和Methanosaeta這兩個(gè)屬的產(chǎn)甲烷菌可以利用乙酸產(chǎn)甲烷[9]。兼性營養(yǎng)型Methanosarcina利用范圍比較廣，除了利用乙酸鹽外，CO2、H2、甲基都可以作為底物生成甲烷。Methanosaeta則是專性乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，只能利用乙酸鹽作為底物生成甲烷。此外，Methanosaeta只能利用低濃度的乙酸，而Methanosarcina能夠利用的乙酸濃度較高[18-19]。甲基營養(yǎng)型途徑則是一種典型的歧化反應(yīng)，以甲醇、含甲基的硫化物（甲硫醇和二甲基硫）、含甲基的胺類（一甲胺、二甲胺、三甲胺和四甲基胺）為底物。反應(yīng)過程中，四份甲基化合物經(jīng)過Mtr的激活，一份甲基化合物被氧化為CO2，這一過程產(chǎn)生的H2將甲基化合物中的甲基基團(tuán)還原為甲烷[9]。自然界中，只有甲烷桿菌目的Methanosphaera以及甲烷八疊球菌目能夠利用甲基營養(yǎng)途徑產(chǎn)甲烷[9]。隨著微生物組學(xué)的快速發(fā)展，新型產(chǎn)甲烷途徑——H2還原甲基化合物產(chǎn)甲烷代謝途徑和烷基型產(chǎn)甲烷代謝途徑相繼被發(fā)現(xiàn)。在H2還原甲基化合物產(chǎn)甲烷途徑中，甲基化合物以外源H2作為電子供體，還原甲基化合物中的甲基基團(tuán)產(chǎn)甲烷。該途徑最先發(fā)現(xiàn)于甲烷桿菌目和甲烷微菌目，隨后又相繼在新型產(chǎn)甲烷菌馬賽球菌目（Methanomassiliicoccales），Methanofastidiosa，深古菌門（Bathyarchaeota）和韋斯特古菌門（Verstraetearchaeota）中被發(fā)現(xiàn)[20]。最近，研究人員在油藏的培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)了一種新型產(chǎn)甲烷古菌Ca.Methanoliparum，并證實(shí)其可直接氧化長鏈烷基烴，并通過β-氧化、伍德-永達(dá)爾（Wood-Ljungdahl）途徑進(jìn)入產(chǎn)甲烷代謝，使得產(chǎn)甲烷作用不再通過多種細(xì)菌和古菌互營代謝來完成[21]。這種產(chǎn)甲烷途徑的發(fā)現(xiàn)突破了產(chǎn)甲烷古菌只能利用簡單化合物進(jìn)行生長的傳統(tǒng)認(rèn)知，拓展了對產(chǎn)甲烷古菌碳代謝途徑的認(rèn)識，完善了碳素循環(huán)的生物地球化學(xué)過程，同時(shí)為開發(fā)綠色可持續(xù)的低碳技術(shù)提供了新的路徑選擇。

圖2 海洋沉積物中低分子化合物的生成和產(chǎn)甲烷途徑 [22]Fig.2 The generation of low-molecular-weight substrates and methanogenic pathways in marine sediments [22]

硫酸根含量豐富的海洋生境中，硫酸鹽還原菌（Sulfate-reducing bacteria, SRB）在與產(chǎn)甲烷菌競爭共同底物乙酸鹽和H2上占優(yōu)勢，因此傳統(tǒng)上認(rèn)為，甲烷的合成只能發(fā)生在SO42-被“耗竭”的產(chǎn)甲烷帶。然而，近幾年越來越多的研究表明，在硫酸鹽豐富的淺層沉積物中產(chǎn)甲烷作用也可以發(fā)生，這是因?yàn)楫a(chǎn)甲烷菌能夠利用硫酸鹽無法利用的甲胺類、甲硫醇類和甲醇等一碳化合物生成甲烷[23-25]。這些非競爭性基質(zhì)在海洋環(huán)境中普遍存在，來源于甜菜堿、膽堿、木質(zhì)素、果膠和肌酸等物質(zhì)的降解或細(xì)菌還原三甲胺氧化物[25-26]。Li等[27]在對南海福爾摩沙冷泉的研究中發(fā)現(xiàn)甘氨酸甜菜堿是甲烷生成的主要前體，細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌在甘氨酸甜菜堿還原產(chǎn)生甲烷途徑中發(fā)揮著協(xié)同作用，細(xì)菌Oceanirhabdus將甜菜堿還原成三甲胺，隨后產(chǎn)甲烷菌Methanococcoides利用三甲胺產(chǎn)生甲烷。此外，通過種間氫轉(zhuǎn)移，產(chǎn)甲烷菌與SRB可能發(fā)生互養(yǎng)共生，從而使得硫酸鹽還原區(qū)也能產(chǎn)生甲烷[28-29]。Xiao等[24]利用放射性同位素14C標(biāo)記法對來自丹麥Aarhus Bay沉積物中甲烷產(chǎn)生速率進(jìn)行測定表明，表層沉積物中產(chǎn)甲烷速率最高（＞200 pmol·cm-3·d-1），甲基營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷作用是沉積物中甲烷產(chǎn)生的主要貢獻(xiàn)方式，這暗示著在硫酸鹽豐富的表層沉積物中存在一個(gè)長期被忽略的“隱形甲烷循環(huán)”。Zhuang等[25]評估了西地中海表層和次表層沉積物中不同產(chǎn)甲烷底物和產(chǎn)甲烷途徑對甲烷生成的貢獻(xiàn)，表明表層沉積物中98%的甲烷來源于甲醇的代謝，而在硫酸根“耗竭”的深層沉積物中，H2/CO2還原型是主要的產(chǎn)甲烷途徑，占甲烷總產(chǎn)生速率的67%～98%。Chen等[30]發(fā)現(xiàn)，向厭氧培養(yǎng)的南黃海沉積物中添加三甲胺會引起大量的甲烷產(chǎn)生，并導(dǎo)致甲基營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌Methanococcoide迅速增加。由此可見，甲基營養(yǎng)型和甲基營養(yǎng)型微生物在SO42-含量高的海洋沉積物中發(fā)揮著重要作用。

2 甲烷好氧氧化菌及好氧氧化過程

根據(jù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的不同，甲烷好氧氧化菌（aerobic methane-oxidizing bacteria,MOB）可分為Type Ⅰ型和Type Ⅱ型2類，分別屬于變形桿菌綱（Proteobacteria）的γ亞綱和α亞綱。Type Ⅰ型MOB利用核酮糖單磷酸（RuMP）途徑同化甲醛，主要含16-C磷脂脂肪酸，胞內(nèi)膜呈束狀分布；Type Ⅱ型MOB則通過絲氨酸（Serine）途徑同化甲醇，其占優(yōu)勢的磷脂脂肪酸為18-C脂肪酸，胞內(nèi)膜沿著細(xì)胞質(zhì)膜排列。Ⅹ型甲烷氧化菌同時(shí)具有Ⅰ型和Ⅱ型的一些特征，代謝途徑既有絲氨酸途徑也具有核酮糖單磷酸途徑，偶爾也存在1，5-二磷酸磷核酮糖途徑，磷脂脂酸碳的長度為16個(gè)碳，生長溫度往往高于Ⅰ型和Ⅱ型甲烷氧化菌[31]。在分子氧存在的情況下，甲烷首先在甲烷單加氧酶（methane monooxygenase, MMO）的作用下氧化成甲醇（CH3OH），甲醇在甲醇脫氫酶（methanol dehydrogenase, MDH）的作用下生成甲醛（HCHO），甲醛通過絲氨酸（Serine）途徑或核酮糖單磷酸（RuMP）途徑進(jìn)入碳同化途徑，同時(shí)甲醛（HCHO）在甲醛脫氫酶（formaldehyde dehydrogenase, FADH）的作用下生成甲酸（HCOOH），甲酸在甲酸脫氫酶（formate dehydrogenase, FDH）的作用下產(chǎn)生二氧化碳和水[26]。圖3為AeOM的代謝途徑。其中，甲烷單加氧酶是參與AeOM的關(guān)鍵酶，可分為2類：一種是游離在細(xì)胞質(zhì)中的可溶性甲烷單加氧酶（soluble methane monooxygenase, sMMO），存在于部分MOB中；另一種是與細(xì)胞膜結(jié)合，顆粒性的甲烷單加氧酶（particulate methane monooxygenase, pMMO），存在于除Methylocella、Methyloferula以外的所有已發(fā)現(xiàn)的MOB中[32-33]。

圖3 MOB的代謝途徑Fig.3 The metabolic pathway of aerobic methane-oxidizing bacteria

海洋生境中MOB的研究主要集中在深海中的冷泉系統(tǒng)和富含天然氣水合物的上層水體和沉積物中。區(qū)別于傳統(tǒng)的MOB類型，研究者利用pmoA和16S rRNA基因?qū)Ｑ蟓h(huán)境中MOB多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)新型MOB OPU1、OPU3和Group-X是深海水體和沉積物中占主導(dǎo)地位的MOB[34-36]，其中OPU1、OPU3與Ⅰ型MOB（Methylocladum和Methylococcus）親緣關(guān)系較近[34-36]，而Group-X與I型和II型MOB親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 甲烷厭氧氧化古菌

3.1 硫酸鹽依賴型甲烷厭氧氧化（sulphatedependent anaerobic methane oxidation，S-AOM）

從熱力學(xué)角度出發(fā)，SO42-、Mn4+、Fe3+、NO3-都能作為電子受體將甲烷氧化（表1），其中S-AOM是海洋沉積物中甲烷消耗的主要途徑。海洋水體中含有大量的硫酸鹽，通過擴(kuò)散作用，使海底淺層沉積物也富含SO42-。甲烷在海底深處形成，當(dāng)甲烷向上遷移至厭氧層時(shí)，與向下擴(kuò)散的SO42-相遇，在ANME古菌和SRB的共同作用下，發(fā)生S-AOM。參與S-AOM反應(yīng)的微生物包括ANME和SRB，為盡可能減少能量的流失，這兩類微生物通常以聚集體的形式存在[37]。ANME古菌屬于廣古菌門，基于16S rRNA基因進(jìn)化分析，可分為3個(gè)類群：ANME-1、ANME-2和ANME-3（圖4）。ANME-1分為ANME-1a、ANME-1b 2個(gè)亞群，與甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales）和甲烷微菌目（Methanomicrobiales）有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系[38]。ANME-2劃分為ANME-2a、ANME-2b、ANME-2c和 ANME-2d 4個(gè)亞群，其中ANME-2a、-2b、-2c屬于甲烷八疊球菌目，ANME-2d隸屬于一個(gè)新的類群Methanoperedenaceae[39]。ANME-3則與擬甲烷球菌屬（Methanococcoides）親緣關(guān)系較近。3種類型的ANME古菌類群的16S rRNA基因序列差異較大，其基因同源性約為75%～92%[40]。在ANME-2中，亞群ANME-2a和ANME-2b來自一個(gè)連貫的進(jìn)化枝，并與ANME-2c進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，因此，常將ANME-2a和ANME-2b合并歸為ANME-2a/b[41]。除了ANME古菌以外，研究人員在南海神狐海域A27和SH1站位沉積物中發(fā)現(xiàn)Bathyarchaeota一些類群和產(chǎn)甲烷菌也可能參與了AOM反應(yīng)[42]。此外，ANME古菌的新功能不斷被發(fā)現(xiàn)。如上海交通大學(xué)張宇團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在深海沉積物中，ANME（ANME-2a）在氧化CH4產(chǎn)生無機(jī)碳的同時(shí)產(chǎn)生乙酸，為生態(tài)系統(tǒng)中的異養(yǎng)微生物提供碳源[43]。Metcalfe等[44]則發(fā)現(xiàn)參與深海沉積物中AOM作用的ANME古菌（ANME-2b）和SRB細(xì)菌（SEEP-SRB1g）共生聚集體還具有固氮的能力。

圖4 基于mcrA序列的ANME古菌系統(tǒng)發(fā)育樹 [40]Fig.4 The phylogeny of mcrA gene in anaerobic methanotrophic archaea[40]

表1 不同電子受體類型甲烷氧化反應(yīng)的吉布斯自由能[45-46]Table 1 Standard Gibbs free energies with different electron acceptors for methane oxidation [45-46]

海底冷泉是指富含甲烷及其他富碳?xì)浠衔锏牡蜏亓黧w從海底表面噴溢的區(qū)域。其中，由ANME古菌和SRB介導(dǎo)的AOM過程，為化能合成生物群落繁衍提供了碳源和能量，成為冷泉生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者。ANME各個(gè)亞群在不同地化環(huán)境的沉積物中具有不同的分布特征。其中ANME-1和ANME-2廣泛分布于各種天然冷泉環(huán)境中，而ANME-3分布在有大量甲烷釋放的冷泉區(qū)，如水合物脊（Hydrate Ridge）、Sonara Margin冷泉、Haakon Mosby泥火山[49]。垂向分布上，ANME-1在缺氧、富含甲烷和硫酸鹽含量低的深層沉積物中占優(yōu)勢主導(dǎo)地位，相比之下，ANME-2a和ANME-3則出現(xiàn)在硫酸鹽濃度較高而溶解硫化物和甲烷濃度較低的淺層沉積物中[47-48]。ANME-1a與ANME-1b的生態(tài)位分化仍存在疑問，我們在對沖繩海槽冷泉沉積物ANME古菌群落的研究中發(fā)現(xiàn)，ANME-1a在垂向上的分布受Fe2+的影響[49]。ANME古菌亞群生態(tài)位的分化，意味著其代謝和功能的多樣性[50]。在一項(xiàng)最新的研究中，研究者以連續(xù)培養(yǎng)十余年的深海泥火山ANME-2a為富集物，運(yùn)用流動高壓培養(yǎng)系統(tǒng)模擬冷泉系統(tǒng)，探究冷泉的噴發(fā)對有機(jī)碳循環(huán)和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。研究表明，在噴發(fā)狀態(tài)下，ANME古菌和SRB含量降低，產(chǎn)甲烷古菌Methanolobus取代ANME-2a成為優(yōu)勢古菌類群，甲基營養(yǎng)型細(xì)菌Pseudomonas、Halomonas和Methylobacter取代SRB轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)勢細(xì)菌類群[51]。同時(shí)，在噴發(fā)條件下，有機(jī)物的轉(zhuǎn)化途徑以及群落的代謝網(wǎng)絡(luò)變得更加復(fù)雜[51]。

甲烷的厭氧氧化過程普遍被認(rèn)為是產(chǎn)甲烷反應(yīng)的逆反應(yīng)過程。1994年，Hoehler等[52]正式提出了甲烷氧化的逆甲烷生成途徑：甲烷經(jīng)ANME的作用通過甲烷生成的逆反應(yīng)途徑最終生成CO2，在這個(gè)過程中產(chǎn)生的電子傳遞給SRB，將硫酸鹽還原。2004年，Hallam等[53]應(yīng)用全基因組鳥槍測序和基因組文庫，發(fā)現(xiàn)ANME-1基因組中除了缺少參與甲基和亞甲基氧化還原反應(yīng)的Mer基因外，包含了幾乎所有甲烷產(chǎn)生途徑所需的基因，從而支持了逆甲烷生成途徑的推測。陳穎[54]對僅由古菌ANME-2a構(gòu)成的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行了高通量測序和序列組裝分析，發(fā)現(xiàn)ANME-2a的基因組中包含有一套經(jīng)典的完整七步甲烷產(chǎn)生途徑所需的基因，并且轉(zhuǎn)錄組分析顯示這些基因都是活躍表達(dá)的，這其中包括了兩套先前報(bào)道在ANME-1中缺失的Mer基因和亞甲基氧化還原反應(yīng)的mer基因，這一研究支持了前人關(guān)于ANME氧化甲烷可能采用逆向甲烷產(chǎn)生途徑的假說，還表明不同的甲烷氧化古菌（ANME-1，ANME-2）采用了不同的甲烷氧化代謝途徑。除了逆甲烷生成途徑外，S-AOM發(fā)生的途徑還存在Valentine和Reeburgh[55]提出的乙酸化理論模型和Moran[56]提出的甲基化理論模型。其中乙酰生成途徑有2種方式，一種是甲烷被水氧化生成乙酸和氫氣，生成的氫氣將硫酸鹽還原（反應(yīng)式（1）-（3））；第二種途徑是CO2和甲烷在ANME的作用下產(chǎn)生乙酸，SRB利用乙酸將硫酸鹽還原成HS-，同時(shí)生成 CO2（反應(yīng)式（4）和（5））。甲基生成途徑是甲烷和HS-通過ANME古菌生成甲硫醚，CH3SH被SRB 利用，生成 HS-和 HCO3-(反應(yīng)式（6））。

乙酰生成途徑第1種方式：

乙酰生成途徑第2種方式：

甲基生成途徑：

3.2 反硝化型甲烷厭氧氧化（denitrifying anaerobic methane oxidation, D-AOM）

從熱力學(xué)的角度推斷，NO3-/NO2-比SO42-更適合成為甲烷厭氧氧化的電子受體（表1）。直至2004年，Islas-Lima等[6]首次在反硝化污泥中證明了D-AOM過程的存在，但并未對其參與的功能微生物菌群進(jìn)行分析。2006年Raghoebarsing等[57]應(yīng)用同位素標(biāo)記研究發(fā)現(xiàn)D-AOM過程是由古菌和細(xì)菌共同作用完成，16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育表明細(xì)菌屬于NC10門，Ettwig等[46]將此類新發(fā)現(xiàn)的微生物命名為Candidatus Methylomirabilis oxyfera(M.oxyfera)；而古菌屬于ANME古菌，隨后由Haroon等[39]證實(shí)其隸屬于ANME-2d，將其命名為“Candidatus Methanoperedens nitroreducens(M.Nitroreducens)”。Ettwig等[58]研究發(fā)現(xiàn)，以NO2-為氮源的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)后，隨著富集時(shí)間的推移，ANME古菌數(shù)量不斷減少直至完全消失，推測DAMO過程可由M.oxyfera細(xì)菌獨(dú)立承擔(dān)完成，而ANME-2d則在以NO3-為基質(zhì)的DAMO過程中起關(guān)鍵作用。

海洋環(huán)境中普遍存在的AOM是與硫酸鹽相耦聯(lián)的，也是海洋沉積物中甲烷消耗的主要途徑，對其研究比較深入。但是對海洋中的N-AOM的研究起步較晚，Chen等[59]在南海表層和次表層沉積物樣品中檢測到了D-AOM細(xì)菌的16S rRNA和pmoA基因序列，這是首次在海洋生境中發(fā)現(xiàn)了D-AOM細(xì)菌，進(jìn)而推測海洋沉積物中可能發(fā)生D-AOM反應(yīng)。Padilla等[60]在墨西哥北部和哥斯達(dá)黎加以外低氧區(qū)（OMZ）發(fā)現(xiàn)了隸屬于NC10門的細(xì)菌，并且具有轉(zhuǎn)錄活性，其豐度在亞硝酸鹽和甲烷濃度升高的區(qū)域達(dá)到了最高值。表明NC10門的細(xì)菌對于OMZ地區(qū)的氮、氧、甲烷的循環(huán)發(fā)揮著重要的作用。

D-AOM反應(yīng)機(jī)理包括M.oxyfera細(xì)菌通過內(nèi)部產(chǎn)氧機(jī)制耦合亞硝酸鹽還原與甲烷的厭氧氧化，以及M.Nitroreducens古菌通過逆向產(chǎn)甲烷途徑耦合硝酸鹽還原與甲烷的厭氧氧化[61]。Ettwig等[46]利用宏基因組揭示了M.oxyfera的內(nèi)部產(chǎn)氧DAOM途徑，即NO2-在亞硝酸鹽還原酶（Nir）作用下生成NO，生成的NO被未知的NO歧化酶分解為N2和O2，生成的O2一部分用于催化AeOM途徑，最終生成CO2，剩余O2用于正常的呼吸作用（圖5）。Haroon等[39]運(yùn)用宏基因組學(xué)、單細(xì)胞基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)等分子技術(shù)結(jié)合13C、15N的同位素標(biāo)記，證實(shí)參與D-AOM的ANME-2d古菌通過反向產(chǎn)甲烷途徑氧化甲烷，獲得的電子用于硝酸鹽的部分反硝化。在M.nitroreducens基因組中包含了所有編碼甲基輔酶M還原酶的基因（mcrABCDG）和編碼輔酶F420型甲基輔酶M轉(zhuǎn)移酶的基因（mer）。與此同時(shí)，在其基因組中也發(fā)現(xiàn)了NO3-還原酶編碼基因，但是并未在M.nitroreducens細(xì)胞內(nèi)檢測到參與反硝化后續(xù)步驟的相關(guān)編碼基因。因此M.nitroreducens只能完成將NO3-還原成NO2-的部分反硝化[39]。

圖5 Methylomirabilis oxyfera 的DAMO理論途徑[46]Fig.5 Theoretical approach of DAMO in Methylomirabilis oxyfera[46]

3.3 鐵錳依賴型甲烷厭氧氧化（manganese-and iron-dependent anaerobic methane oxidation, Metal-AOM）

Metal-AOM是發(fā)現(xiàn)相對較晚的一種AOM類型。研究發(fā)現(xiàn)在一些海洋沉積物SMTZ底部或產(chǎn)甲烷帶（methane zone, MZ）中，盡管硫酸鹽、氧氣、NO3-/NO2-等電子受體被耗盡，甲烷仍然以相當(dāng)快的速度進(jìn)行氧化[62-65]。此外，在一些AOM與硫酸鹽還原（Sulfate reduction，SR）共存的環(huán)境樣品中，AOM的反應(yīng)活性明顯高于SR反應(yīng)活性，表明體系中AOM很可能部分依賴于其他可用的電子受體[66-67]。Beal等[7]對加利福尼亞Eel River盆地甲烷滲漏區(qū)進(jìn)行了長時(shí)間的富集培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)沉積物中的微生物在缺乏硫酸鹽的條件下，能夠利用錳（水鈉錳礦）和鐵（水鐵礦）進(jìn)行甲烷氧化，這是首次通過實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物的方法證實(shí)海洋環(huán)境中AOM的發(fā)生可以以直接或間接的方式和金屬化合物相耦聯(lián)。已有的研究表明，與甲烷代謝相關(guān)的微生物如ANME-1、ANME-2a、ANME-2c、ANME-3、ANME-2d、Candidatus Methanoperedens ferrireducens、產(chǎn)甲烷古菌（Methanosarcina acetivorans,Methanobacterium）和MOB均有可能直接或間接參與了Fe-AOM過程[7,68-74]。此外，某些細(xì)菌如脫硫單胞菌屬（Desulfuromonas）、脫硫弧菌（Desulfovibrio）、擬桿菌屬（Bacteroides）、疣微菌（Verrucomicrobia）、酸桿菌（Acidobacteria）、纖維單胞菌屬（Cellulomonas）、暗桿菌屬（Pelobacter）、放線纖絲菌屬（Actinotalea）等微生物可能作為它們的合作伙伴，對金屬還原起重要作用[7,73]。但是，環(huán)境樣品的復(fù)雜性使得介導(dǎo)Metal-AOM發(fā)生的功能微生物類群尚未獲得一致的認(rèn)識，需要進(jìn)一步開展研究進(jìn)行探索。

Metal-AOM反應(yīng)的具體機(jī)制尚不明確，目前根據(jù)研究所得可能的機(jī)制有3種[75]（圖6）：第1種是ANME 古菌（如ANME-2a、2c、2d）單獨(dú)負(fù)責(zé)Metal-AOM的整個(gè)過程[68-69]；第2種反應(yīng)機(jī)制類似于硫酸鹽還原作用耦合甲烷厭氧氧化機(jī)制，首先ANME氧化甲烷，并將產(chǎn)生的電子直接傳遞至金屬還原微生物（Metal-reducing microorganism, MRM），進(jìn)而將金屬氧化物進(jìn)行還原，是兩種微生物合作進(jìn)行Metal-AOM的模式[76]；第3種是以硫化物存在為前提形成零價(jià)硫，以FeS為例的反應(yīng)方程為：Fe(OH)3+FeS+6H+→3Fe2++S0+6H2O。零價(jià)硫通過一個(gè)隱藏的硫循環(huán)過程反應(yīng)生成負(fù)二價(jià)硫和硫酸鹽，產(chǎn)生的硫酸鹽可以與甲烷發(fā)生S-AOM，進(jìn)而氧化甲烷，這種AOM的發(fā)生是以間接的方式和金屬化合物相耦聯(lián)[77]。

圖6 微生物介導(dǎo)Metal-AOM的不同反應(yīng)機(jī)制[76]a.ANME單獨(dú)負(fù)責(zé)Metal-AOM， b.ANME與合作伙伴MRM的合作進(jìn)行Metal-AOM， c.金屬氧化物促進(jìn)S-DAOM的Metal-AOM。Fig.6 Different mechanisms of microbe-mediated metal-AOMa.metal-AOM by ANME alone, b.metal-AOM by cooperation between ANME and partner MRM, c.apparent metal-AOM by the stimulation of metal oxides on sulfate-AOM.

Metal-AOM（以Fe-AOM為例）可能是海洋生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在的過程，在調(diào)節(jié)深海沉積物甲烷通量方面發(fā)揮著重要作用[78]。此外，F(xiàn)e-AOM過程的產(chǎn)物Fe2+和CO2影響著硫和磷的地球化學(xué)循環(huán)以及自生礦物的形成[78]。因此，F(xiàn)e-AOM過程對全球碳、硫、磷以及金屬元素的循環(huán)發(fā)揮著重要的作用[78]。

4 展望

（1）深海屬于極端環(huán)境，理化環(huán)境的特點(diǎn)是高壓、黑暗、缺氧、不同環(huán)境溫度差異大，在這種環(huán)境下海底深部生物圈容納了類型多樣、生物量巨大并且代謝獨(dú)特的微生物。以深海不同環(huán)境中的微生物為研究對象，利用同位素標(biāo)記對功能微生物進(jìn)行室內(nèi)富集培養(yǎng)，同時(shí)結(jié)合單細(xì)胞測序、宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組和宏蛋白組等分子研究手段，將會極大促進(jìn)對參與甲烷代謝過程新型菌種及新代謝途徑的認(rèn)識。

（2）Metal-AOM在近幾年越來越吸引學(xué)者的注意，這不僅由于Metal-AOM可以消耗沉積物中的甲烷，而且Metal-AOM在生物地球化學(xué)循環(huán)和地質(zhì)演化中具有重要作用。雖然不斷有地球化學(xué)與分子證據(jù)顯示海洋沉積物中存在微生物參與的Metal-AOM，但對有關(guān)該過程的微生物作用機(jī)制和所涉及的微生物群落成員還應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的探索。

（3）產(chǎn)甲烷和甲烷氧化聯(lián)系著海洋中的碳、氮、硫、金屬等循環(huán)過程，如硫酸鹽的還原過程與AOM相結(jié)合，形成S-AOM反應(yīng)；硝酸鹽的還原過程與AeOM相結(jié)合，形成N-AOM反應(yīng)；金屬的還原過程與AOM相結(jié)合，形成Metal-AOM反應(yīng)，但是這些過程中涉及的微生物之間的相互作用以及其中的生命代謝過程還不夠明晰，揭示這些元素循環(huán)過程與甲烷代謝過程的耦合效應(yīng)，是將來海洋生境生物地球化學(xué)循環(huán)的重要研究方向。