于 博，陸蘭芳，余海忠，湯尚文，豁銀強，吳進菊，閆 毅

（1.湖北文理學院食品科學技術學院，湖北 襄陽 441053；2.襄陽三珍食品有限公司，湖北 襄陽 441053）

Pickering 乳液是固體顆粒穩(wěn)定的乳液，其顯著優(yōu)點在于體系中無表面活性劑成分，不僅不會像傳統(tǒng)乳液因含表面活性成分出現(xiàn)皮膚刺激、溶血行為或環(huán)境污染等問題，而且在抗聚結合和奧斯特瓦爾德熟化上表現(xiàn)出更強的穩(wěn)定性[1-5]。淀粉顆粒是自然界大量存在的多糖分子，不僅來源廣泛，而且具有良好的生物降解性、安全穩(wěn)定性、環(huán)境相容性等突出優(yōu)點，淀粉顆粒穩(wěn)定Pickering 乳液的研究近年來受到了國內外學者越來越多的關注[6-7]。影響淀粉顆粒穩(wěn)定Pickering 乳液的因素較多，就淀粉本身而言，主要是淀粉顆粒的粒徑大小和顆粒表面的潤濕特性。不同來源淀粉因粒徑、直鏈/支鏈淀粉比例、顆粒表面形狀、結晶結構、電位等差異，導致淀粉顆粒形成Pickering 乳液能力、穩(wěn)定Pickering 乳液能力各不相同。一般來說，小顆粒淀粉在形成和穩(wěn)定Pickering 乳液上表現(xiàn)更好；但是，由于自身組成的多羥基結構，天然淀粉的乳化穩(wěn)定性較差，常采用疏水改性方法改善淀粉顆粒的潤濕特性。辛烯基琥珀酸酸酐是最常用的疏水改性試劑之一，通過酯化反應在淀粉分子中接枝疏水性長烯基鏈，增大了淀粉顆粒在油/水界面的空間位阻，比原淀粉表現(xiàn)出更好的乳化性，在淀粉基O/W 型Pickering 乳液及功能因子遞送體系中應用前景廣闊[8-11]。目前，研究主要聚焦于各種預處理包括濕熱、酸解、熱堿等[12-14]或制備過程輔助手段包括擠壓、超聲、球磨等[15-17]來提高疏水改性效率和制品兩相界面親和特性。

小米淀粉是小米的主要成分，占小米質量分數(shù)62.8%～70.5%，是一種低成本、易獲取、可持續(xù)且未充分利用的淀粉資源。小米淀粉顆粒大小約為6～12 μm，屬于小粒淀粉，而且淀粉顆粒表面存在孔隙和凹痕，這有助于分子修飾、消化等靶向反應，能夠拓展小米淀粉的應用范圍。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，辛烯基琥珀酸改性的小米淀粉在Pickering 乳液體系有較好的乳化效果，但是儲存一段時間后會出現(xiàn)相分離現(xiàn)象[18]。為提高辛烯基琥珀酸小米淀粉（以下簡稱OSA 小米淀粉）制備效率，并進一步提高其乳化能力和乳化穩(wěn)定性，作者采用超聲處理技術改變小米淀粉結構，研究超聲對小米淀粉酯化反應效率、取代度及取代基團分布的影響；采用球磨處理技術改善OSA 小米淀粉結構，研究球磨對OSA 小米淀粉微觀形貌、結晶結構、乳化能力及穩(wěn)定性的影響，為小米淀粉顆粒形成更加穩(wěn)定的Pickering 乳液提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米淀粉：作者所在實驗室自制；辛烯基琥珀酸酐（OSA）：阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品；中鏈甘油三酯（MCT）：上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、溴化鉀、苯酚、乙醇等：均為分析純試劑，國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設備

JY88-IIN 超聲波細胞粉碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；Emax 高能球磨儀（含控溫功能）：德國Retsch 責任有限公司產(chǎn)品；S-4800 型掃描電子顯微鏡：日本Hitachi 公司產(chǎn)品；D8 Advance X 射線衍射儀：德國Bruker 公司產(chǎn)品；Malvern3000 激光粒度儀：英國Malvern 公司產(chǎn)品；Nexus470 傅立葉紅外變換光譜儀：美國Thermo Nicolet 公司產(chǎn)品；IKA T18 高速分散機：德國IKA 儀器設備有限公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 超聲輔助OSA 小米淀粉的制備小米淀粉配置成20 g/dL 淀粉乳，置于超聲細胞破碎儀，超聲功率0、25、50、100、150、200、250 W，時間40 min，每次超聲作用5 s、間隔5 s，超聲后抽濾洗滌，40 ℃烘干后備用。以超聲預處理的小米淀粉為原料，配制35 g/dL 淀粉乳，在1 h 內滴加淀粉干基3 倍的OSA（95%乙醇稀釋5 倍），控制體系pH 8.5、溫度35 ℃。反應完成后，調節(jié)pH 至6.5 左右，用70%乙醇和蒸餾水分別離心洗滌2 次后，40 ℃鼓風干燥，研磨過100 目篩，得到OSA 小米淀粉。

1.3.2 取代度及反應效率的測定稱取1.5 g OSA小米淀粉，加入50 mL 體積分數(shù)95%乙醇溶液磁力攪拌10 min，再加入15 mL 2.0 mol/L 的鹽酸-乙醇溶液酸化處理30 min，用體積分數(shù)90%乙醇抽濾洗滌至無Cl-為止，再將樣品移入錐形瓶中，加100 mL去離子水，沸水浴20 min 后取出，趁熱用0.1 mol/L NaOH 標準溶液滴至粉紅色，以酚酞做指示劑[19-20]。取代度 （Degree of Substitution，DS）和反應效率（Reaction Efficiency，RE）見式（1）～（2）。

式中：c為NaOH 標準溶液濃度，0.1 mol/L；V為滴定消耗NaOH 體積，mL；W為OSA 小米淀粉質量，g；DS 為取代度、DS實際為實際取代度、DS理論為理論取代度；RE 為反應效率。

1.3.3 OSA 小米淀粉的酸水解稱取OSA 小米淀粉100 g，用體積分數(shù)5%鹽酸溶液配制質量濃度為40 g/dL 淀粉乳（1.0 g 淀粉/1.27 mL 鹽酸），置于55℃恒溫振蕩水浴中酸水解不同時間后，堿中和反應并離心處理，去離子水抽濾洗滌干凈，至pH 6 左右，40 ℃恒溫干燥24 h 后過100 目標準篩備用。采用文獻[21]的方法，測定OSA 小米淀粉水解度。

1.3.4 結晶結構分析采用X 射線衍射儀測定OSA 小米淀粉系列樣品的結晶結構。測試參數(shù)：銅靶，管電壓和電流分別為40 kV 和30 mA，掃描速率為8°/min，掃描范圍為3°～40°（2θ），步長0.02°。用JADE6.0 軟件分析并計算相對結晶度。

1.3.5 特征官能團分析采用傅立葉紅外光譜儀測定OSA 小米淀粉系列樣品的特征官能團。取少量OSA 小米淀粉樣品和溴化鉀（質量比約為1∶100）置于紅外燈下研磨混勻，壓片后用傅立葉紅外光譜儀掃描，掃描范圍為400～4 000 cm-1，掃描32 次，分辨率為4 cm-1。

1.3.6 球磨處理球磨轉速400 r/min，控制球磨溫度25～32 ℃，球磨處理0.25、0.5、1、2、3 h。球磨OSA小米淀粉置于4 000 r/min 離心15 min，冷凍干燥24 h，過100 目篩制得球磨OSA 小米淀粉。

1.3.7 微觀形貌分析采用電子掃描顯微鏡觀察球磨OSA 小米淀粉的微觀形貌。取適量球磨OSA小米淀粉樣品均勻涂布于掃描電子顯微鏡載物臺上，真空噴金后送入樣品室，在不同放大倍數(shù)下進行觀察。

1.3.8 Pickering 乳液的制備用蒸餾水配制不同質量濃度（1.0、1.5、2.5、3.5、5.0 g/dL）的球磨OSA 小米淀粉分散液，以MCT 為油相，油相比例50%。將球磨OSA 小米淀粉分散液與油相預混合，再用高速分散機20 000 r/min 均質2 min，分4 次進行，每次作用30 s，間隔60 s。

1.3.9 Pickering 乳液粒徑的測定采用MS3000 激光粒度分析儀測定乳液粒徑，以體積粒度D4，3 表示乳液平均粒徑，D3，2 為表面積平均粒徑，參數(shù)設置為樣品折光率1.450、水折光率1.333、吸光值0.001、循環(huán)水轉速2 400 r/min。

1.3.10 Pickering 乳液乳化指數(shù)的測定將乳液于25 ℃環(huán)境靜置儲存，觀察乳液相分離情況，記錄乳液乳化指數(shù)，見式（3）。

式中：ESI 為乳化指數(shù)；VE為乳液的乳化層體積，mL；VT為乳液總體積，mL。

1.3.11 數(shù)據(jù)處理每個實驗重復3 次，使用SPSS 22 軟件數(shù)據(jù)統(tǒng)計并進行顯著性分析（P＜0.05）；采用Origin 9.0 繪制圖。

2 結果與分析

2.1 超聲對小米淀粉酯化反應的影響

不同功率超聲處理對小米淀粉酯化反應的影響見圖1。未經(jīng)過超聲處理的小米淀粉制備OSA 小米淀粉時，反應4 h 后體系pH 不再發(fā)生變化，達到平衡狀態(tài)，此時OSA 小米淀粉取代度為0.016 6。超聲處理小米淀粉后，隨著超聲功率的增加，OSA 小米淀粉取代度及反應效率隨之增大，反應時間明顯縮短。250 W 超聲處理的小米淀粉，在酯化反應2.5 h 后達到平衡，取代度達到0.021 8，接近理論取代度0.023 1，反應效率從71.62%增大到94.22%，相比未超聲處理制備的OSA 小米淀粉取代度提高了32%。這主要是因為在小米淀粉與辛烯基琥珀酸酐（OSA）反應時，由于溶解性差異以及淀粉結構的復雜性，酯化反應主要集中在小米淀粉顆粒表面，OSA在小米淀粉顆粒上的分布并不均勻；而超聲空化和機械作用破壞了小米淀粉顆粒的聚集態(tài)結構及形態(tài)，內部結構變得疏松，顆粒表面出現(xiàn)更多空隙和凹槽，比表面積增大，同時暴露出了更多酯化反應的位點，這與Chen、Hu 研究結果一致[22-23]。也有研究表明，超聲可能會導致少量小米淀粉的降解，產(chǎn)生的直鏈淀粉也有助于酯化反應的進行，從而提高了酯化反應的效率和取代度[24-25]。

圖1 超聲功率對OSA 小米淀粉取代度及反應效率的影響Fig.1 Effects of ultrasonic power on the degree of starch substitution and reaction efficiency of OSA millet

2.2 OSA 小米淀粉的取代基團分布

取代基團在淀粉顆粒的分布情況與淀粉乳化能力及穩(wěn)定性有關。為探究取代基團在小米淀粉顆粒上的分布情況，采用鹽酸水解方法進行研究。酸解過程中OSA 小米淀粉取代度、水解度與酸解時間的關系見圖2。由圖2可知，隨著酸解時間的延長，3種OSA 小米淀粉水解度均較大程度增大，且變化速率相近，說明酸水解對非結晶區(qū)的破壞速度相近，8 h 后水解度趨于平穩(wěn)。3 種OSA 小米淀粉取代度均較大程度下降，與未超聲制備OSA 小米淀粉相比，2種超聲制備的OSA 小米淀粉取代度下降趨勢相近，經(jīng)過2 h 酸水解后取代度急劇下降，然后趨于緩慢，在8 h 后趨于平緩，未超聲制備OSA 小米淀粉經(jīng)水解后取代度下降趨勢相對緩慢。由于酯化反應時OSA 基團主要分布在淀粉顆粒無定形區(qū)，因此推測酸水解優(yōu)先發(fā)生在無定形區(qū)域，破壞了該區(qū)域中接枝的OSA 基團，取代度下降明顯。隨著酸水解反應的不斷進行，無定形區(qū)接枝的OSA 越來越少，當酸水解12 h 時，3 種OSA 小米淀粉水解度趨于一致，但OSA 基團含量分別是250 W 超聲制備OSA 小米淀粉最多、150 W 超聲制備OSA 小米淀粉次之、未超聲制備OSA 小米淀粉最少，這說明隨著超聲功率的增加，更多OSA 基團進入了小米淀粉的結晶區(qū)域。

圖2 酸水解時間對OSA 小米淀粉取代度及水解度的影響Fig.2 Effects of acid hydrolysis time on degree of substitution and hydrolysis rate of OSA millet starch

2.3 OSA 小米淀粉的結晶結構與特征官能團變化

圖3是OSA 小米淀粉經(jīng)過不同時間酸水解后的X 射線衍射圖譜，由圖3可知，不同水解度的OSA 小米淀粉均保持了典型的A 型淀粉衍射圖譜，在15°、17°、18°、23°有明顯的衍射峰，且17°和18°處呈肩峰[26]。水解度為0 的OSA 小米淀粉和不同水解度的OSA 小米淀粉都保持了原有的晶體結構，這說明酸水解并未改變淀粉顆粒的晶型結構，上述試驗中被破壞的OSA 基團主要分布在無定形區(qū)域。

圖3 不同水解度OSA 小米淀粉的X 射線衍射圖譜Fig.3 X ray diffraction patterns of OSA millet starch with different degrees of hydrolysis

用傅立葉紅外光譜表征OSA 小米淀粉酸水解后的特征官能團結構變化，見圖4。由圖4可知，不同水解度OSA 小米淀粉的紅外光譜特征吸收峰基本保持不變。3 300～3 800 cm-1區(qū)域有較大吸收峰，來源于O—H 伸縮振動；993 cm-1處出現(xiàn)深特征帶，表明存在α-1，4 糖苷鍵和C—O—C 伸展；2 900 cm-1附近吸收峰與C—H 伸展振動有關；1 640 cm-1處的吸收峰與淀粉分子中的結合水有關；1 724 cm-1是酯類物質C=O 伸縮振動特征峰，表明小米淀粉分子上仍然存在OSA 官能團；1 570 cm-1處出現(xiàn)的特征峰對應于RCOO-的不對稱伸縮振動，這是由于小米淀粉與辛烯基琥珀酸酐在堿性條件下反應后以辛烯基琥珀酸淀粉鈉的形式存在。在水解度達20.83%時，酯類物質C=O 伸縮振動特征峰仍非常明顯，隨著水解度繼續(xù)增大，1 724 cm-1處的酯鍵吸收峰略微減弱，但并未完全消失。這也說明小米淀粉顆粒經(jīng)過超聲處理產(chǎn)生的裂縫和孔隙有助于OSA 進入淀粉顆粒的內部，接近結晶區(qū)域或者水解不易達到的區(qū)域。

圖4 不同水解度OSA 小米淀粉的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of OSA millet starch with different degrees of hydrolysis

2.4 球磨對OSA 小米淀粉微觀形貌的影響

球磨前后OSA 小米淀粉的微觀形貌見圖5。由圖5可知，未經(jīng)球磨處理OSA 小米淀粉呈多面體形，顆粒完整、棱角分明，表面相對光滑，與原小米淀粉微觀形貌基本一致[27]。球磨0.25 h 的OSA 小米淀粉仍保持顆粒結構，但可觀察到淀粉顆粒開始出現(xiàn)輕微的變形，淀粉顆粒表面出現(xiàn)褶皺凹陷。球磨0.5 h 后，部分淀粉顆粒出現(xiàn)崩解現(xiàn)象，嚴重崩解的顆粒失去了多面體形態(tài)。隨著球磨時間的延長，淀粉顆粒經(jīng)過反復摩擦、剪切，表面破損嚴重，顆粒棱角逐漸模糊，部分淀粉顆粒崩解，溶脹的淀粉顆粒黏結成不規(guī)則的團塊。球磨2 h 后，淀粉顆粒的形態(tài)完全改變，顆粒表面變得粗糙且呈現(xiàn)不規(guī)則的塊狀分布，導致OSA 小米淀粉的界面吸附性增加。

圖5 不同球磨時間OSA 小米淀粉掃描電鏡圖（1 000×和3 000×）Fig.5 SEM of OSA millet starch prepared through different ball-milling time（1 000× and 3 000×）

2.5 球磨對OSA 小米淀粉結晶結構的影響

球磨前后OSA 小米淀粉的X 射線衍射圖見圖6。由圖6可知，球磨前后OSA 小米淀粉與原小米淀粉晶體結構類似，都是A 型晶體結構，球磨處理并未改變OSA 小米淀粉的晶體類型。隨著球磨的進行，OSA 小米淀粉的特征衍射峰強度逐漸減弱，逐漸由尖峰衍射變?yōu)閺浬⒎逖苌?，這主要是因為球磨產(chǎn)生的機械撞擊、剪切和摩擦作用破壞了維持淀粉結晶結構穩(wěn)定的支鏈淀粉側鏈團簇間的氫鍵，晶體變形和晶格缺失導致相對結晶度由最初的33.00%降低到球磨0.25 h 的27.60%，直至降低到球磨1 h的19.84%，結晶結構趨于穩(wěn)定。

圖6 不同球磨時間OSA 小米淀粉的X 射線衍射圖譜Fig.6 X ray diffractograms of OSA millet starch prepared through different ball-milling times

2.6 球磨對OSA 小米淀粉Pickering 乳液的影響

乳液粒徑是乳化性能的重要指標，圖7顯示了球磨時間與樣品乳液平均粒徑和儲存7 d 乳化指數(shù)的關系。從圖7可以看出，乳液平均粒徑大小隨OSA 小米淀粉球磨時間的延長呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，乳液平均粒徑從未球磨OSA 小米淀粉的41.20 μm 增大到球磨0.5 h OSA 小米淀粉的66.60 μm，表明短時間球磨處理對OSA 小米淀粉乳化能力是不利的。隨球磨時間延長至1 h，乳液平均粒徑開始降低；球磨2 h 后OSA 小米淀粉制備的Pickering 乳液平均粒徑降低到最低值24.50 μm，較未球磨樣品降低了約41%，表明長時間的球磨可有效改善OSA 小米淀粉的乳化能力，這主要是由于球磨處理導致界面吸附性增加和結晶結構的破壞。乳液平均粒徑的降低也有利于小米淀粉顆粒在界面的吸附和有序排列，從而表現(xiàn)出更加優(yōu)良乳化能力和穩(wěn)定性。

圖7 球磨時間對OSA 小米淀粉Pickering 乳液的影響Fig.7 Effects of ball-milling times on Pickering emulsion stabilized by OSA millet starch

2.7 球磨OSA 小米淀粉質量濃度對其Pickering乳液的影響

淀粉顆粒質量濃度與Pickering 乳液穩(wěn)定性密切相關。表1是球磨OSA 小米淀粉質量濃度與Pickering 乳液儲存穩(wěn)定性的關系。由表1可以看出，不同顆粒質量濃度的Pickering 乳液在6 h 后呈現(xiàn)出不同的乳化效果，放置1 d 后乳化趨于穩(wěn)定。當OSA 小米淀粉質量濃度為1 g/dL 時，6 h 后的乳化指數(shù)為74%；1 d 后乳化指數(shù)穩(wěn)定在70%，與其他質量濃度形成的Pickering 乳液相比，分層現(xiàn)象最嚴重；隨著球磨OSA 小米淀粉質量濃度的增加，Pickering 乳液乳化層體積逐漸增加，分層現(xiàn)象逐漸減弱，乳化指數(shù)不斷增大。顆粒質量濃度增大到3.5 g/dL 時，乳化相體積達最大值，7 d 后乳化指數(shù)仍保持在99%，表明乳液穩(wěn)定性處于很好的狀態(tài)。

表1 球磨OSA 小米淀粉添加質量分數(shù)對Pickering 乳液穩(wěn)定性的影響Table 1 Effects of ball-milled OSA millet starch addition on the stability of Pickering emulsion

表2是球磨OSA 小米淀粉質量濃度與Pickering 乳液粒徑分布的關系。由表2可以看出，隨著淀粉顆粒質量濃度的增加，Pickering 乳液平均粒徑和表面積平均粒徑呈降低趨勢。當顆粒質量濃度為1.0 g/dL 時，乳液平均粒徑為244 μm，由于此時粒徑較大，淀粉顆粒難以在油滴表面形成致密完整的吸附層，兩相界面強度不高，液滴在碰撞時容易絮凝形成大油滴，這正是1 g/dL OSA 小米淀粉形成Pickering 乳液能力和乳化穩(wěn)定性不足的原因。顆粒質量濃度為3.5 g/dL 的乳液平均粒徑為48.6 μm，約為1 g/dL 的乳液平均粒徑的20%。此時由于更多的小米淀粉顆粒吸附在油/水界面上，通過毛細管力有序排列，形成較為致密的界面顆粒膜，阻止乳液液滴間相互聚結，這也是3.5 g/dL OSA 小米淀粉形成Pickering 乳液能力和乳化穩(wěn)定性良好的原因。

表2 球磨OSA 小米淀粉添加質量分數(shù)對Pickering 乳液粒徑的影響Table 2 Effect of ball-milled OSA millet starch addition on the particle size of Pickering emulsion

3 結 語

在超聲-球磨輔助制備辛烯基琥珀酸小米淀粉酯的過程中，超聲處理不僅提高了OSA 小米淀粉的制備效率，而且提高了有助于乳化的酯化基團取代度；球磨處理通過改變顆粒微觀形態(tài)和晶體結構，降低了OSA 小米淀粉所形成的Pickering 乳液粒徑，增強了小米淀粉顆粒在油水界面的吸附能力，從而賦予了小米淀粉顆粒更加優(yōu)良的乳化能力和乳化穩(wěn)定性。超聲、酯化和球磨聯(lián)用的復合改性技術是提高小米淀粉穩(wěn)定Pickering 乳液的有效方法，未來可深入探討復雜食品體系對小米淀粉Pickering 乳液的影響因素和機制，為拓展小米淀粉應用場景提供更多理論和實踐依據(jù)。