劉定斌

南開大學(xué)化學(xué)學(xué)院，天津 300071

體外診斷是指在人體之外，通過對人體樣本(血液、體液、組織等)中的待測物進(jìn)行檢測，從而獲取臨床診斷信息，進(jìn)而對疾病或機(jī)體功能做出判斷[1]。近年來，在解決危害人類的重大健康問題方面，體外診斷已經(jīng)成為疾病預(yù)防、診斷和療效評估的重要工具和手段[2]。

膠體金在體外診斷方面已得到廣泛的應(yīng)用[3]。比色法是通過比較或測量有色物質(zhì)溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法，由于其具有簡便性，已成為分析化學(xué)中較為常用的分析手段之一。膠體金是比色法的優(yōu)良底物，其具有超高的消光系數(shù)，通常是有機(jī)染料的1000倍[4]。因此，膠體金常被用作試紙條的顯色劑。

1 出題依據(jù)

過去三年，新冠肺炎疫情在全世界擴(kuò)散，導(dǎo)致數(shù)億人感染，數(shù)百萬人死亡。發(fā)展快速簡單的新冠病毒檢測方法、實(shí)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)早隔離，是抗擊疫情的有效武器。目前，新冠病毒核酸檢測方法主要基于熒光PCR (polymerase chain reaction)法，需要依賴昂貴儀器設(shè)備，且需送到專業(yè)醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測，無法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測。2020年2月，南開大學(xué)化學(xué)學(xué)院分析科學(xué)研究中心利用膠體金技術(shù)，成功研制出新冠病毒IgM/IgG抗體聯(lián)合檢測試劑盒，為疫情防控提供了有效的檢測方法[5]。

第54屆國際化學(xué)奧林匹克試題第1題中，我們以膠體金可視化快速檢測為主要內(nèi)容，考查了其在新冠病毒核酸檢測中所涉及的分析化學(xué)基本概念和分析方法。

2 題目及解析

2.1 題目

發(fā)展快速、簡便的新冠病毒檢測方法極為重要，膠體金輔助的檢測方法具有良好的應(yīng)用前景。由于其具有較高的摩爾消光系數(shù)，膠體金被廣泛用作試紙條的顯色劑，目前已有大量商品化膠體金快速檢測試劑盒，應(yīng)用于新冠抗原抗體檢測、早孕快檢、食品添加劑檢測等。膠體金的外觀顏色與其尺寸和分散性緊密相關(guān)。通常來講，膠體金的尺寸越大，顯示的顏色越偏紅。一旦金納米粒子發(fā)生聚集，顏色就會變?yōu)樗{(lán)色或紫色。

當(dāng)膠體金的表面被兩種單鏈核酸片段a和b修飾后，其在目標(biāo)核酸(a'b')的存在下發(fā)生聚集，溶液的顏色會在幾分鐘內(nèi)從紅色變?yōu)樗{(lán)色(如圖1.1所示)。基于這一原理，可以檢測到樣品中源自新冠病毒的目標(biāo)核酸片段。

圖1.1 膠體金的分散與聚集及顏色顯示

1-1 (1分) 請選出代表分散的膠體金的吸收帶區(qū)域的字母(參照圖1.2的色輪，從a-f中選擇)。

圖1.2 色輪

1-2 (1分) 指出膠體金聚集后吸收光譜的變化。與分散的膠體金相比，聚集的膠體金的吸收波長：

(a) 變長；(b) 變短；(c) 不變

1-3 (4分) 膠體金由金原子組成，在本題中，可認(rèn)為金原子緊密排列成金顆粒(密度ρ = 19.3 g·cm-3)。請計算直徑為30.0 nm的球形膠體金中金原子的數(shù)目(N)。

膠體金的合成依賴于氯金酸(HAuCl4·3H2O，Mw= 394)與還原性物質(zhì)(如檸檬酸鈉)的氧化還原反應(yīng)。在100.0 mL溶液中，5.2 mg氯金酸完全轉(zhuǎn)化為直徑為30.0 nm的球形納米粒子。用紫外-可見光譜儀測得所得紅色溶液在530 nm處的吸光度為0.800。

1-4 (4分) 請計算所得膠體金在530 nm處的摩爾消光系數(shù)。使用的比色皿光程為1 cm。若1-3中未計算出金原子數(shù)(N)，請使用N = 1.00 × 105進(jìn)行本題的計算。

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對目標(biāo)核酸片段進(jìn)行比色檢測。采集的原始咽拭子樣品被平均分成兩份。加入探針溶液和水(如下表所示)后，分別測量所得到的兩種溶液在600 nm處的吸光度。

序號 咽拭子樣品體積(mL)核酸片段修飾的膠體金溶液的體積(mL)含有2.0 μg·mL-1目標(biāo)核酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)水的體積(mL) 吸光度1 0.10 0.80 0.00 0.10 0.400 2 0.10 0.80 0.10 0.00 0.900

1-5 (4分) 請計算原始咽拭子樣品中病毒核酸片段的濃度。

2.2 答案與解析

本題主要涉及膠體金基礎(chǔ)知識及其在核酸檢測方面的應(yīng)用。本題為分析化學(xué)計算題，根據(jù)題目提供的信息結(jié)合分析化學(xué)知識，對相關(guān)問題做出判斷和計算。接下來我們對此題進(jìn)行解析。

1-1 & 1-2 這兩個題目主要考查物質(zhì)顏色與吸收光的關(guān)系，結(jié)合題目中色輪提供的信息，可以做出判斷。題目中說膠體金在分散狀態(tài)時呈現(xiàn)紅色，根據(jù)色輪判斷，其吸收帶應(yīng)位于d區(qū)域，故1-1的答案為d；膠體金聚集時呈現(xiàn)藍(lán)色，結(jié)合色輪可以得出聚集態(tài)的吸收帶應(yīng)位于b區(qū)域(600 nm-650 nm)，和分散態(tài)吸收帶d區(qū)域(490 nm-560 nm)相比，吸收波長變長，故1-2的答案為a。

1-3 題目的前提條件是“認(rèn)為金原子緊密排列”，則可以用膠體金的體積(或質(zhì)量)除以一個金原子的體積(或質(zhì)量)，計算出膠體金中金原子的數(shù)目N。

3 膠體金快速檢測方法的拓展

本考題對應(yīng)于第54屆國際化學(xué)奧林匹克預(yù)備試題第12題“利用膠體金快速測定維生素C”[6]，在預(yù)備題中，我們對膠體金及相關(guān)知識背景做了更充分的介紹。

貴金屬膠體是具有歷史悠久的古老顏料。一個典型的例子就是著名的萊氏杯(Lycurgus Cup)[7]，其制造于公元4世紀(jì)，現(xiàn)存于大英博物館。萊氏杯的玻璃具有神奇的二色性：在自然光照條件下，玻璃是綠色的(如圖1.3左)；如果將光源放在杯子里面，杯子就會顯示紅色(如圖1.3右)。利用現(xiàn)代分析方法，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，萊氏杯含有金屬膠體顆粒，電子顯微技術(shù)和X射線分析發(fā)現(xiàn)，膠體顆粒大小為50-100 nm，主要組分是組成為金銀比3 : 7的合金，含有少量的金屬銅。萊氏杯的二色性與膠體納米顆粒的類型、大小和分散性密切相關(guān)。

圖1.3 萊氏杯(Lycurgus Cup)

膠體金是典型的貴金屬膠體，由于其具有超高的消光系數(shù)、易于合成的特點(diǎn)，被廣泛用于分析化學(xué)(如免疫膠體金技術(shù))。一般來說，膠體金的合成是基于氯金酸和還原性物質(zhì)(如維生素C)之間的氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生由若干金原子組成的納米顆粒。當(dāng)膠體金顆粒大小在幾到幾十納米之間，常常在可見區(qū)有吸收，產(chǎn)生各種顏色。在預(yù)備題中，給出的膠體金體系及要求解決的問題如下：

1) 氯金酸(分子量= 394)投料為41 mg，反應(yīng)體積為100 mL，測得吸光度為0.8。若氯金酸完全轉(zhuǎn)化為膠體金，請計算尺寸為10 nm的膠體金中的金原子個數(shù)和消光系數(shù)。

2) 植物提取液中含有大量還原性物質(zhì)(如維生素C)，可用于膠體金的合成。取植物提取液0.20 mL，與過量的氯金酸反應(yīng)生成尺寸為10 nm的膠體金溶液，用水稀釋至1 mL，測得其吸光度為0.3。另取0.2 mL樣品，加入相同體積的維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度為5 μg·mL-1)，與過量氯金酸反應(yīng)生成相同尺寸的膠體金，用水稀釋至1 mL，測得其吸光度為1.0。試計算植物提取液中的維生素C的含量。

這兩個問題的解答過程就留給讀者自行完成。答案如下：10 nm的膠體金中含3.1×104金原子，該溶液的摩爾消光系數(shù)ε=2.37×107L·mol-1·cm-1；植物提取液中維生素C的含量Cx=2.14 μg·mL-1。

4 結(jié)語

本題結(jié)合新冠肺炎病毒快速檢測這一熱點(diǎn)難點(diǎn)問題，考查了膠體金相關(guān)基礎(chǔ)知識及其在核酸檢測中的應(yīng)用。主要涉及的知識點(diǎn)包括分析化學(xué)中物質(zhì)顏色與吸收波長的關(guān)系、Lambert-Beer定律、標(biāo)準(zhǔn)加入法等。該題所涉及到的大部分知識點(diǎn)，都包含在預(yù)備題——利用膠體金快速測定維生素C中。