熱依蘭木·買賽地，韓莉莉

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦科，烏魯木齊 830001)

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在全球女性惡性腫瘤中均處于第四位[1]。宮頸癌的致病因素已明確，通過篩查可早期發(fā)現(xiàn)癌前病變，但我國宮頸癌篩查尚未廣泛普及[2]，大部分病例就診時已處于晚期，術(shù)后復(fù)發(fā)率也較高。中晚期宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案是以放射治療聯(lián)合以順鉑為基礎(chǔ)的同步化學(xué)療法為主[3]，但腫瘤細(xì)胞耐藥性阻礙了疾病的治療，造成晚期宮頸癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。因此，制定宮頸癌個體化治療方案，克服化療耐藥性，研究開發(fā)作用于特定靶點(diǎn)的高選擇性的新型抗癌藥物已成為宮頸癌研究的熱點(diǎn)[4]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)作為肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤的抗腫瘤藥物的靶基因，其在宮頸癌中的機(jī)制也成為研究熱點(diǎn)[5]。本研究對EGFR在宮頸癌中的作用及其機(jī)制進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 宮頸癌SiHa細(xì)胞株(上海中喬新舟生物科技有限公司)，微量移液器、超凈工作臺(蘇州集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(SANYO)，低速離心機(jī)(Eppendorf)，酶標(biāo)儀(Thermo)，細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning)，小鼠單抗EGFR(160kD)。武漢俊杰JT-12J電腦生物組織脫水機(jī)，德國Leica RM 2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，日本羽毛R35一次性刀片，武漢俊杰JK-6生物組織攤烤片機(jī)，載玻片及蓋玻片(江蘇世泰實(shí)驗器材有限公司)，抗原修復(fù)用電陶爐(SKG)，奧林巴斯BX53型生物顯微鏡，包埋機(jī)(武漢俊杰JB-P5)，無水乙醇、二甲苯、蘇木素、包埋石蠟、中性樹膠均來自國藥集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)染 宮頸癌SiHa置于DMEM+10%FBS+1%(Penicillin-Streptomycin Solution)培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞培養(yǎng)至78%匯合度時，根據(jù)實(shí)驗分組參照說明書將EGFR過表達(dá)和敲除載體和空載體轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞。分組：正常組(無添加載體)、過表達(dá)對照組(OE-NC)、過表達(dá)組(OE)、敲除組(395、1211、1499：針對靶基因，設(shè)計并合成3條siRNA采用PCR篩選出一條最佳序列，構(gòu)建干擾質(zhì)粒)，敲除對照組(si-NC)，對過表達(dá)質(zhì)粒、干擾質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞順時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24h后進(jìn)行檢測。轉(zhuǎn)染5h后以新鮮培養(yǎng)液替換原培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)，48h后以胰蛋白酶消化收集各組細(xì)胞，實(shí)時熒光定量PCR和Western blot法檢測各組細(xì)胞中EGFR表達(dá)水平以評價轉(zhuǎn)染效果。EGFR-siRNA由上海中喬新舟生物科技有限公司合成,其干擾序列見表1。

表1 干擾序列表

1.2.2 檢測宮頸癌SiHa細(xì)胞生物學(xué)行為 轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48、72h，MTT檢測細(xì)胞增殖能力，酶標(biāo)儀測定各孔490nm波長下的OD值。細(xì)胞侵襲實(shí)驗檢測各組細(xì)胞的侵襲能力，劃痕試驗檢測各組細(xì)胞的遷移行為，流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞周期。

1.2.3 Western blot檢測SiHa中STAT3、EGFR、PKM2表達(dá) 將PBS洗凈細(xì)胞中加120μL含PMSF裂解液，于冰上裂解30min，4℃ 12000r/min離心5min，取適當(dāng)稀釋的上清液，BCA法來測定蛋白濃度。調(diào)整蛋白質(zhì)濃度，Western blot法檢測細(xì)胞中STAT3、EGFR、PKM2表達(dá)，結(jié)果用Quantity-one圖像軟件分析并進(jìn)行光密度值掃描，分別計算目的蛋白條帶與GAPDH強(qiáng)度比值(%)。

2 結(jié) 果

2.1 EGFR轉(zhuǎn)染效果驗證 RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，過表達(dá)組的EGFR mRNA和蛋白相對表達(dá)量顯著高于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。3條EGFR敲除組中EFGR mRNA相對表達(dá)量顯著低于空白對照組和EGFR NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中395組效果最好，后期細(xì)胞實(shí)驗選擇該干擾組，見圖1。

圖1 RT-PCR和Western blot驗證EGFR過表達(dá)和敲除的效果

2.2 EGFR轉(zhuǎn)染后對宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖能力的影響 MTT檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)組的SiHa細(xì)胞增殖活性顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。低表達(dá)EGFR組的SiHa細(xì)胞增殖活性較空白對照組明顯降低，P<0.05。提示，抑制EGFR表達(dá)可顯著抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖，且具有時間依賴效應(yīng)，見圖2。

2.3 EGFR轉(zhuǎn)染后對宮頸癌SiHa細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響 侵襲實(shí)驗結(jié)果顯示，EGFR過表達(dá)組的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著高于空白對照組和空載組，敲除組的侵襲細(xì)胞數(shù)明顯降低。劃痕實(shí)驗結(jié)果顯示，EGFR過表達(dá)組的SiHa細(xì)胞遷移能力顯著高于其余對照組。敲除組的細(xì)胞遷移能力明顯降低，見圖3。

圖2 MTT檢測細(xì)胞增殖活性

圖3 侵襲和遷移實(shí)驗

2.4 Western blot法檢測PKM2、STAT3、EGFR蛋白表達(dá) 過表達(dá)EGFR組的EGFR、PKM2、STAT3蛋白表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。EGFR敲除組的EFGR、PKM2、STAT3蛋白表達(dá)顯著低于空白對照組和EGFR NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 Western blot檢測PKM2、STAT3、EGFR蛋白表達(dá)

2.5 EGFR轉(zhuǎn)染后對宮頸癌SiHa細(xì)胞周期的影響 EGFR過表達(dá)組的G1期細(xì)胞數(shù)顯著減少、S期顯著升高，EFGR敲除組的G1期細(xì)胞數(shù)增加，G2期和S期相對減少。表明EGFR過表達(dá)組的宮頸癌SiHa細(xì)胞生長失控，分裂活躍，S期和G2期細(xì)胞明顯增多。見圖5。

圖5 EGFR轉(zhuǎn)染后對宮頸癌SiHa細(xì)胞周期的影響

3 討 論

人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus,HPV)持續(xù)感染是宮頸癌的致病因素。HPV感染可增加細(xì)胞膜上暴露的EGF受體數(shù)量[6]。研究發(fā)現(xiàn)，HPV感染與未感染細(xì)胞比較時，作為HPV病毒主要轉(zhuǎn)化蛋白的E5、E6與E7都通過EGFR通路增強(qiáng)增殖信號[7]。各研究報道，宮頸癌細(xì)胞中EGFR表達(dá)上調(diào)6%～90%，這可能與檢測方法不一致有關(guān)[8]，且EGFR高表達(dá)與宮頸癌進(jìn)展[9-10]及低生存率相關(guān)[11]。EGFR被認(rèn)為是一種參與宮頸癌進(jìn)展的受體，但具體機(jī)制仍不清楚。

魏莉等[12]通過體內(nèi)外實(shí)驗證實(shí)，EGFR是miR-186的下游靶因子之一，miR-186通過下調(diào)EGFR來抑制宮頸癌SiHa、HeLa細(xì)胞的增殖。有研究發(fā)現(xiàn)[13]，轉(zhuǎn)染miR-134-5模擬物的宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞的EGFR mRNA和EGFR蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，其中SiHa細(xì)胞下調(diào)41%，該變化間接影響SiHa細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例顯著上升，細(xì)胞凋亡率顯著增加。研究發(fā)現(xiàn)[14]，HeLa細(xì)胞在低糖高乳酸環(huán)境中的存活狀況更好，且EGFR和mTOR基因表達(dá)水平升高。多項研究表明，EGFR高表達(dá)與宮頸癌的多重惡性生物學(xué)行為有關(guān)。這與本研究結(jié)果類似，EGFR高表達(dá)能促進(jìn)SiHa宮頸癌細(xì)胞生長、增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為，抑制EGFR表達(dá)可影響宮頸癌細(xì)胞的增殖。目前關(guān)于EGFR下游蛋白分子及其機(jī)制的研究較少，且與EGFR相關(guān)的信號通路繁雜[15]。本研究還發(fā)現(xiàn)，PKM2、STAT3與EGFR表達(dá)存在正相關(guān)，EGFR可能通過PKM2/STAT3途徑參與宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展。

EGFR在肺癌中研究最為廣泛，EGFR抑制劑在肺癌的應(yīng)用更使其成為癌癥化療的關(guān)鍵靶標(biāo)之一[16]。深入探討EGFR介導(dǎo)的PKM2-STAT3信號通路在宮頸癌中的作用機(jī)制，進(jìn)而探尋EGFR對宮頸癌細(xì)胞的作用及其與下游PKM2、STAT3受體、癌細(xì)胞增殖抑制與功能蛋白表達(dá)的關(guān)系，明確其作用機(jī)制，為臨床開展相關(guān)藥物提供理論基礎(chǔ),是一個極具臨床應(yīng)用價值的研究領(lǐng)域。