鄧玲玲 陳穎 宮藝其 付煒 王偉 鄭吉建 張軍 鄭潔 楊禮

人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源心肌細(xì)胞(hiPSC-CMs)已逐漸應(yīng)用于構(gòu)建心肌疾病模型,篩選藥物等領(lǐng)域并顯示出易獲取、無(wú)倫理問(wèn)題等優(yōu)勢(shì)。目前研究顯示hiPSC-CMs仍表現(xiàn)為不成熟心肌細(xì)胞,在結(jié)構(gòu)功能代謝方面與正常人體心肌細(xì)胞仍有一定差距[1-2]。其中自律性,動(dòng)作電位形態(tài)等電生理指標(biāo)是評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞是否成熟的一項(xiàng)重要指標(biāo)[2]。而hiPSC-CMs的自律性和動(dòng)作電位形態(tài)除了與細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間和環(huán)境相關(guān)外,還受到細(xì)胞記錄電生理指標(biāo)前的處理方式的影響。既往hiPSC-CMs進(jìn)行膜片鉗電生理分析前較多采用胰蛋白酶消化后控制培養(yǎng)環(huán)境使細(xì)胞處于低密度狀態(tài)的方法[3-4],但其合適的濃度不易制備及保存,并且需要控制培養(yǎng)條件。有研究發(fā)現(xiàn)使用Accutase酶對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞有較好分離效果[5],而且消化后存活率高于胰蛋白酶[6],在筆者前期的研究中也使用過(guò)稀釋的Accutase酶進(jìn)行膜片鉗細(xì)胞處理[7],證實(shí)了該酶的可行性。本研究采用相對(duì)溫和的Accutase酶原液,在實(shí)施膜片鉗記錄前對(duì)hiPSC-CMs進(jìn)行消化處理。通過(guò)設(shè)置不同的消化時(shí)間,分析不同消化時(shí)間對(duì)hiPSC-CMs電生理記錄的影響,探尋hiPSC-CMs建立膜片鉗全細(xì)胞記錄模式前的Accutase酶的最佳消化時(shí)間,以便后期更合理的評(píng)價(jià)藥物等對(duì)hiPSC-CMs的成熟度以及電生理的影響。

1 材料與方法

1.1 主要藥品、試劑及溶液 Accutase酶(加拿大Stemcell公司7920),肌鈣蛋白(c TNT)抗體(Proteintech公司,美國(guó))),α-輔肌動(dòng)蛋白(α-Actinin)抗體(Sigma-Aldrich 公司,美國(guó)),心肌細(xì)胞消化液(北京賽貝生物技術(shù)公司),PBS 緩沖液體(Hyclone公司,美國(guó))。動(dòng)作電位電極內(nèi)液(mmol/L):NaCl 5、KCl 150、CaCl22、EGTA 5、Mg ATP 5、HEPES 10(使用KOH 調(diào)節(jié)p H 值至7.2);動(dòng)作電位細(xì)胞外液(mmol/L):NaCl 140、KCl 5、MgCl21、CaCl21、HEPES 10、Glucose 10(使用NaOH 調(diào)節(jié)p H 值至7.4);動(dòng)作電位的電極內(nèi)外液配方試劑(生工生物工程上海股份有限公司)[8]。

1.2 心肌細(xì)胞分化方法 用Accutase酶(7920,STEMCELL Technologies,Canada)將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(上海兒童醫(yī)學(xué)中心王偉教授課題組提供)消化成單個(gè)細(xì)胞后,在鋪有基質(zhì)膠的12孔板上以1×106個(gè)/孔進(jìn)行接種,具體的培養(yǎng)方法同之前發(fā)表文獻(xiàn)[9]。

1.3 hiPSC-CMs分子生物學(xué)鑒定 hiPSCs 分化28～32天后,室溫(25℃)下依次使用心肌細(xì)胞消化液Ⅰ、Ⅱ消化10、20 min,在均勻鋪有基質(zhì)膠的24 孔板玻璃爬片上以1×105個(gè)/孔進(jìn)行接種,鏡下觀察細(xì)胞完全貼附于基質(zhì)膠后,依次使用4%多聚甲醛固定30 min,0.5%Triton X-100 破膜30 min,5%牛血清白蛋白封閉2 h,添加心肌細(xì)胞 標(biāo) 志 物c TNT 抗 體 和α-Actin 抗 體(1:200),之后4℃下孵育8 h,PBS清洗3 遍后,添加相應(yīng)熒光二抗(1:1 000)室溫下再避光孵育2 h,最后用DAPI(1:1 000)核染10 min[9-10],熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.4 單個(gè)心肌細(xì)胞提取 將35 mm 孔徑培養(yǎng)皿中狀態(tài)良好的培養(yǎng)28～32天的hiPSC-CMs通過(guò)簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法抽取5組分別用含Accutase酶消化液1 ml(37℃)消化0.5 min(A組)、1 min(B組)、2 min(C組)、5 min(D組)、10 min(E組),消化后使用動(dòng)作電位細(xì)胞外液恒速灌流,另一端使用負(fù)壓泵吸引?？刂曝?fù)壓泵吸力,使培養(yǎng)皿內(nèi)的液面保持在穩(wěn)定水平。單個(gè)培養(yǎng)皿細(xì)胞室溫(25℃)下記錄時(shí)間不超過(guò)6 h[9]。

1.5 電生理記錄 選擇單個(gè)完整貼壁的心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每組至少記錄5個(gè)細(xì)胞。使用P-97微電極拉制儀(SUTTER 公司,美國(guó))拉制電極,微電極內(nèi)注入配置的動(dòng)作電位電極內(nèi)液避免微電極尖端出現(xiàn)氣泡,可在微電極入液之前通過(guò)1ml注射器施加一定正壓,入液后記錄微電極的電極電阻。顯微鏡觀察下,使用微操縱儀將微電極推向細(xì)胞直至緊貼于細(xì)胞表面,同時(shí)持續(xù)觀測(cè)微電極電阻的變化,等待細(xì)胞與微電極封接,當(dāng)阻抗大于1 GΩ 時(shí),記錄微電極接觸細(xì)胞后的巨阻封接形成時(shí)間,穩(wěn)定1 min后使用負(fù)壓破膜,補(bǔ)償電容電流和串聯(lián)阻抗(40%以上)后形成全細(xì)胞記錄模式,同時(shí)記錄串聯(lián)阻抗以及膜電容,期間間斷使用“Y-tube”系統(tǒng)持續(xù)灌流細(xì)胞,灌流速度保持在3 ml/min[11]。

1.6 自發(fā)動(dòng)作電位記錄 hiPSC-CMs自發(fā)動(dòng)作電位的記錄采用電流鉗(gap-free)模式[700B 膜片鉗放大器(Axon公司,美國(guó))和Digidata 1 550 A 膜片鉗數(shù)模轉(zhuǎn)換器(Axon公司,美國(guó))];記錄動(dòng)作電位信號(hào)的采樣頻率為1 k Hz,低通Bessel濾波頻率為0.5 k Hz[9]。記錄到自發(fā)動(dòng)作電位后穩(wěn)定1 min,再記錄自發(fā)動(dòng)作電位的頻率、靜息電位、閾電位、振幅、最大去極化速率、復(fù)極時(shí)間(30%、40%、70%、80%和90%動(dòng)作電位時(shí)程)[12]、超極化電位和最大自動(dòng)除極速率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Clampfit 10.5和Origin 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 hiPSC-CMs的分子生物學(xué)鑒定 免疫熒光鑒定顯示hiPSC-CMs高表達(dá)心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物肌鈣蛋白c TNT 以及肌動(dòng)蛋白α-actin。

圖1 hiPSC-CM 細(xì)胞特異性標(biāo)志物鑒定

2.2 顯微鏡下hiPSC-CMs消化前后的形態(tài)變化顯微鏡下肉眼觀察,hiPSC-CMs消化前呈圓柱狀,有分支,緊密貼附在培養(yǎng)皿中,融合和分離的細(xì)胞同時(shí)可見(jiàn)自發(fā)收縮;Accutase酶消化0.5 min(A 組)、1 min(B組)、2 min(C組)后細(xì)胞自發(fā)收縮減弱,細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯變化,使用動(dòng)作電位外液沖洗后,A、B、C組細(xì)胞呈圓形或橢圓形,顯微鏡下折光度增強(qiáng),單個(gè)細(xì)胞逐漸恢復(fù)跳動(dòng)。而消化5 min(D 組)、10 min(E組)后細(xì)胞自發(fā)收縮不明顯,細(xì)胞逐漸變成圓形或橢圓形,使用動(dòng)作電位外液沖洗后,細(xì)胞進(jìn)一步變圓,部分細(xì)胞破碎,顯微鏡下觀察未能恢復(fù)明顯的自發(fā)跳動(dòng)(圖2)。

圖2 不同消化時(shí)間下的顯微鏡下hiPSC-CM 形態(tài)(10×10倍)

2.3 hiPSC-CMs電 生 理 記 錄 Accutase 酶 消 化后,各組全細(xì)胞記錄模式建立前的細(xì)胞膜電容及串聯(lián)電阻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(表1)。相比A 組(0.5 min),其他組更易找到合適的細(xì)胞形成巨阻封接,容易破膜,隨著消化時(shí)間延長(zhǎng)巨阻封接形成時(shí)間變短(P＜0.05)(表1)。

表1 各組巨阻封接形成時(shí)間、膜電容以及串聯(lián)電阻

2.4 hiPSC-CMs自發(fā)動(dòng)作電位參數(shù) hiPSC-CMs動(dòng)作電位有明顯平臺(tái)期,30%至40%動(dòng)作電位時(shí)程之差與70%至80%動(dòng)作電位時(shí)程之差的比值(APD30-40/APD70-80)均大于1.5(表2),提示為心室肌樣細(xì)胞(圖3)[12]。隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng),hiPSCCMs自發(fā)動(dòng)作電位的頻率有增快趨勢(shì)(P＜0.01)、振幅逐漸減小趨勢(shì)(P＜0.01)(表2)。盡管無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng),hiPSCCMs自發(fā)動(dòng)作電位的最大去極化速率在數(shù)值上有降低趨勢(shì)(表2)。

圖3 不同消化時(shí)間記錄的動(dòng)作電位

表2 各組hiPSC-CMs自發(fā)動(dòng)作電位的電生理參數(shù)

3 討論

本研究顯示,Accutase酶預(yù)先處理hiPSC-CMs 1 min可有效的建立全細(xì)胞模式進(jìn)行電生理記錄。消化時(shí)間過(guò)短或不消化,hiPSC-CMs分離不充分,成團(tuán)細(xì)胞較多,同時(shí)易激惹,細(xì)胞間相互影響且跳動(dòng)幅度較大,不易尋找合適的單細(xì)胞,并且不易形成封接及破膜難度大;而進(jìn)一步延長(zhǎng)消化時(shí)間則在一定程度上影響hiPSC-CMs的活性,改變記錄的自發(fā)動(dòng)作電位形態(tài),影響hiPSC-CMs成熟度的電生理評(píng)價(jià)。

hiPSC-CMs的制備研發(fā)過(guò)程根據(jù)細(xì)胞不同成熟水平使用的酶有胰蛋白酶、膠原酶、EDTA、Tryp LETMExpress等[13]。Accutase酶常用于分離干細(xì)胞,同時(shí)具有膠原酶和蛋白酶的活性。相較胰蛋白酶,Accutase酶作用溫和,消化時(shí)間要求相對(duì)寬松,分離細(xì)胞時(shí)對(duì)細(xì)胞表面損傷相對(duì)較小且消化較徹底。研究表明,Accutase酶用于神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng),與胰酶同期相比有神經(jīng)球直徑更大、細(xì)胞形態(tài)及功能損傷小、存活率高的優(yōu)勢(shì)[14],在人胚胎干細(xì)胞分離傳代中使用具有不產(chǎn)生異種分化、對(duì)單細(xì)胞的活力及增殖影響小的特點(diǎn)[15],但未在電生理水平上進(jìn)行對(duì)比。近年來(lái),Accutase酶已經(jīng)在hiPSCCMs的傳代和制備中應(yīng)用[3]。本研究將Accutase酶用于hiPSC-CMs細(xì)胞電生理評(píng)價(jià)前的準(zhǔn)備,在進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)前無(wú)需嚴(yán)格控制細(xì)胞處于低密度狀態(tài)培養(yǎng)。Accutase酶處理后的細(xì)胞肉眼下觀察其自發(fā)跳動(dòng)減弱,但其自發(fā)動(dòng)作電位仍可被記錄。在保證細(xì)胞基本活性的前提下,使用Accutase酶預(yù)先消化hiPSC-CMs,可使細(xì)胞收縮變圓,細(xì)胞膜變薄更易于建立全細(xì)胞模式。本研究顯示Accutase酶處理1 min形成巨阻封接的時(shí)間是(2.10±0.55)min,顯著低于未消化直接封接的時(shí)間(大部分細(xì)胞不能形成巨阻封接或破膜失敗)或消化0.5 min組(4.80±1.10)min,消化1 min對(duì)細(xì)胞形態(tài)也影響較小,另外隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng),形成巨阻封接時(shí)間相對(duì)減少,但能保持穩(wěn)定記錄動(dòng)作電位的細(xì)胞變少。

研究顯示,hiPSC-CMs在構(gòu)建心臟疾病模型,評(píng)價(jià)藥物毒性反應(yīng)和心肌修復(fù)等方面日益受到關(guān)注,但與正常人體心肌細(xì)胞相比仍有差距[1]。故促進(jìn)hiPSC-CMs更成熟,縮小其與正常人體心肌細(xì)胞的差距已成為目前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前報(bào)道的促進(jìn)hiPSC-CMs更加成熟的方法有延長(zhǎng)培育時(shí)間、外加電機(jī)械刺激、生化因子干預(yù)以及與非心肌細(xì)胞共培養(yǎng)等[5]。相對(duì)成熟的hiPSC-CMs電生理檢測(cè)表現(xiàn)為更低的超極化電位、更慢的自發(fā)跳動(dòng)節(jié)律、具有更明顯的平臺(tái)期,對(duì)兒茶酚胺類藥物具有更好的反應(yīng)性[16]。本研究所記錄細(xì)胞的自發(fā)動(dòng)作電位均具有平臺(tái)期,APD30-40/APD70-80＞1.5提示為心室肌樣hiPSC-CMs[12]。目前報(bào)道的hiPSC-CMs心室肌樣細(xì)胞超極化電位在-30～-75 m V,0期最大去極化速率在2 000～15 000 m V/s,自發(fā)動(dòng)作電位的頻率在5～85 次/分,動(dòng)作電位的振幅在79～112 m V[2,8,16]。本研究采用同一培養(yǎng)環(huán)境和同一培養(yǎng)周期的hiPSC-CMs,減少了培養(yǎng)條件和時(shí)間的影響,其中A、B、C、D、E 組hiPSC-CMs動(dòng)作電位參數(shù)與上述研究結(jié)果相符。結(jié)合Robertson 等[16]提出的將hiPSC-CMs依據(jù)成熟度分為早期的hiPSCCMs和晚期的hiPSC-CMs,D、E 組hiPSC-CMs動(dòng)作電位的參數(shù)更接近早期的hiPSC-CMs,說(shuō)明延長(zhǎng)Accutase酶消化時(shí)間對(duì)其動(dòng)作電位形態(tài)可能有一定的影響。

本研究所選細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為28～32天,而培養(yǎng)時(shí)間是影響hiPSC-CMs 成熟度的一個(gè)重要因素[16],培養(yǎng)時(shí)間更長(zhǎng)的細(xì)胞可能存在不同的研究結(jié)果。研究顯示hiPSC-CMs培養(yǎng)一周左右即可出現(xiàn)自發(fā)收縮,包含不同類型的細(xì)胞,如心室肌樣細(xì)胞,心房肌樣、竇房結(jié)樣細(xì)胞[12]。筆者前期研究顯示,培養(yǎng)30天左右的hiPSC-CMs,在全細(xì)胞模式下的動(dòng)作電位形態(tài)基本屬于心室肌樣細(xì)胞,其他類型的心肌細(xì)胞極少,故筆者選擇了培養(yǎng)28～32天的細(xì)胞進(jìn)行研究。同時(shí)由于未將細(xì)胞控制在低密度狀態(tài),細(xì)胞密度相對(duì)較高,細(xì)胞間連接更緊密,故在未消化狀態(tài)直接進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)絕大部分細(xì)胞不能形成巨阻封接或破膜失敗,未記錄到相應(yīng)動(dòng)作電位。另外本研究顯示隨著消化時(shí)間延長(zhǎng),hiPSC-CMs的自動(dòng)除極速率加快。目前認(rèn)為自律細(xì)胞的自動(dòng)除極可能與起搏電流或細(xì)胞內(nèi)周期性的鈣釋放有關(guān)[4],Accutase酶是否對(duì)起搏電流或細(xì)胞內(nèi)周期性的鈣釋放有作用,還有待進(jìn)一步的研究。Accutase酶與胰蛋白酶相比,兩者對(duì)hiPSC-CMs在細(xì)胞電生理水平的影響是否有區(qū)別,目前尚未進(jìn)行比較。本研究探究了Accutse酶預(yù)處理hiPSC-CMs進(jìn)行膜片鉗紀(jì)錄的合適的消化時(shí)間,可為后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。有研究表明胰蛋白酶對(duì)動(dòng)物心肌細(xì)胞消化傳代處理后對(duì)心肌表面的KATP通道有一定影響[17],而accutase酶未有影響離子通道的相關(guān)報(bào)道,需要未來(lái)更多的研究和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)探究。