李振坤 ，白團(tuán)麗 ，楊璘宇 ，王 穎

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650101;2）昆明醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500）

肺栓塞（pulmonary embolism）是一種常見(jiàn)且可能致命的肺血管疾病[1]，尋找新的藥物一直是臨床研究熱點(diǎn)。急性右心衰竭是肺栓塞患者主要死亡原因，右心的炎癥因子改變?cè)诜嗡ㄈl(fā)病中非常重要，可以作為肺栓塞的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后評(píng)估指標(biāo)[2]。肺栓塞與中性粒細(xì)胞趨化因子（cytokine-induced neutrophil chemoattractants，CINC）相關(guān)的炎癥效應(yīng)密切相關(guān)[3-4]，中性粒細(xì)胞相關(guān)的炎癥在肺栓塞后的多種并發(fā)癥中發(fā)揮作用。燈盞花素廣泛用作治療心血管疾病，具有強(qiáng)大的心血管藥理作用。多項(xiàng)藥理研究表明，燈盞花素對(duì)缺血性疾病及肺外的血栓性疾病具有治療作用[5-6]。本課題前期研究顯示：燈盞花素有抗急性肺栓塞的作用，燈盞花素可以下調(diào)肺組織單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant-1，MCP-1）、白細(xì)胞介素-13（interleukins-13，IL-13）基因、蛋白水平發(fā)揮肺栓塞保護(hù)作用[7]，但燈盞花素對(duì)右心的炎癥因子影響如何還不得而知。本研究擬通過(guò)大鼠肺栓塞模型評(píng)估燈盞花對(duì)其右心室的保護(hù)作用，并通過(guò)檢測(cè)右心室 CINC-1、CINC-2 基因及蛋白表達(dá)水平，驗(yàn)證燈盞花對(duì)肺栓塞后右心室炎癥損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

燈盞花素購(gòu)自廣東彼迪藥業(yè)有限公司（批號(hào)：20180101）；醫(yī)用低分子肝素購(gòu)自河北常山生化藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)：F402180807）；PCR 引物設(shè)計(jì)：Beacon Designer 7.90；引物合成：廣州invitrogen Trizol Reagent：Lifetech 15 596026；WB試劑：RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（6X）均購(gòu)自碧云天，內(nèi)參一抗：β-actin 抗體購(gòu)自 abcam 生物醫(yī)藥公司，CINC1 抗體批號(hào) ab86436、CINC2 抗體批號(hào)ab 220431；檢測(cè)二抗：山羊抗小鼠（HRP 標(biāo)記）通用型二抗，購(gòu)自美國(guó) CST 公司，批號(hào) cst 7074，7076。

1.2 動(dòng)物

SD 雄性大鼠30 只，周齡7～9 周，體重250～300 g，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)，許可證號(hào)：SCXK（滇）K2015-0002，標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)室 溫 20 ℃，濕度 60%。本研究符合昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn) 。

1.3 儀器

上海UNICO 全波長(zhǎng)分光光度計(jì)；Thermo 酶標(biāo)儀；ABI StepOne 定量PCR 儀；BIO-RAD 凝膠成像儀；BIO-RAD 垂直電泳槽；BIO-RAD 濕式轉(zhuǎn)膜槽；威恒電子天平；其林貝爾靜音混合儀。

1.4 方法

1.4.1 制備自體血栓每組大鼠標(biāo)記稱(chēng)重并記錄，大鼠尾靜脈取血 600 μL，立馬注入外徑 1 mm 導(dǎo)管，37 ℃溫箱進(jìn)行孵育 30 min，放入-20 ℃冰箱中 1 min，進(jìn)行血栓凝固，30 min 后將導(dǎo)管置入 70 ℃水浴鍋 10 min。取出導(dǎo)管并將導(dǎo)管用刀片切成 2 mm 長(zhǎng)度，顯微鑷取出血栓，放入裝有0.002 L 生理鹽水離心管中，制備自體靜脈血栓。

1.4.2 肺栓塞模型建立及給藥處理（1）SD 大鼠隨機(jī)分為 5 組（每組6只）：假手術(shù)組（Control），模型組（Model），燈盞花素低劑量組（Bre10 g/L），燈盞花素高劑量組（Bre 20 g/L），低分子肝素陽(yáng)性藥組（LMWH 10.250 IU/L），使用小動(dòng)物生理儀監(jiān)測(cè)大鼠的心率與呼吸次數(shù)。（2）造模 用 2% 戊巴比妥鈉進(jìn)行動(dòng)物麻醉后，所有組均沿頸前正中線做長(zhǎng)約 2 cm 的切口，鈍性分離大鼠右側(cè)的頸總靜脈，并用導(dǎo)管將混有自體血栓 20 個(gè)栓子的0.002 L生理鹽水注入到頸總靜脈，縫合切口。假手術(shù)組：右側(cè)頸總靜脈注射0.002 L 生理鹽水；模型組及給藥各組：右側(cè)頸總靜脈注射0.002 L 生理鹽水+血栓塊（20 個(gè)）。（3）給藥處理 經(jīng)大鼠肺栓塞燈盞花素量效實(shí)驗(yàn)確定燈盞花素最佳低、高劑量分別為10 g/L 及20 g/L（表1），于建立模型前 2 h，假手術(shù)組與模型組腹腔注射0.002 L 生理鹽水，燈盞花素低劑量、高劑量與低分子肝素陽(yáng)性藥組腹腔分別注射低劑量燈盞花素（10 g/L）、高劑量燈盞花素（20 g/L）及低分子肝素（10.250 IU/L）。血栓輸注 24 h 后，再次記錄大鼠的心率與呼吸次數(shù)，觀察大鼠一般情況。打開(kāi)腹腔切斷下腔動(dòng)靜脈放血處死動(dòng)物，取右下肺組織 HE 染色；右心室組織放入 0.001 L trizol 裂解液（-80 ℃保存），后期進(jìn)行 Q-PCR 及 WB。

表1 燈盞花素對(duì)大鼠肺栓塞影響的量效關(guān)系（ ）Tab.1 Dose-effect relationship of breviscapine on pulmonary embolism in rats（）

表1 燈盞花素對(duì)大鼠肺栓塞影響的量效關(guān)系（ ）Tab.1 Dose-effect relationship of breviscapine on pulmonary embolism in rats（）

與假手術(shù)組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與模型組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

1.4.3 HE 染色右下肺組織放入 50 mL 4% 多聚甲醛（常溫固定備用），脫水包埋制備切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色后于顯微鏡下觀察肺組織的病理變化，普通光學(xué)顯微鏡下觀察顯色結(jié)果并分別在4 倍鏡、10 倍鏡下拍照。每組6例大鼠，每張切片隨機(jī)選5 個(gè)高倍視野。

1.4.4 Q-PCR 檢測(cè)mRNA 表達(dá)Q-PCR 引物序列如下（F 代表上游引物forward；R 代表下游引物reverse），見(jiàn)表2。

表2 Q-PCR 引物序列Tab.2 Q-PCR primer sequences

取20 mg 大鼠右心室組織，液氮研磨后，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體積為20 μL，42 ℃ 溫育60 min，70 ℃ 加熱10 min 后終止反應(yīng)，冰浴冷卻，得到逆轉(zhuǎn)錄的cDNA 第一條鏈。進(jìn)行Q-PCR 擴(kuò)增，放入ABI Stepone 儀器中。

設(shè)置PCR 循環(huán)反應(yīng)條件，預(yù)變性，變性（95 ℃）15 s，退火及延伸（60 ℃）30 s，共40～45 循環(huán)，對(duì)循環(huán)產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線分析，反應(yīng)結(jié)束，收集信息，做Ct 值分析。Q-PCR 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-△△Ct法進(jìn)行分析，＞ 1，參考公式2-△△Ct==2^-[（Ct 實(shí)驗(yàn)組目的基因-Ct 實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因）-（Ct 對(duì)照組目的基因-Ct 對(duì)照組內(nèi)參基因）]，得到Ct 數(shù)據(jù)后再與內(nèi)參作除法比較。

1.5 Western-blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)

取-80 ℃ 的肺栓塞大鼠左下肺，每100 mg組織中加入500 μL 的RIPA 裂解液（含50 μL 蛋白酶抑制劑），剪碎組織后，冰浴環(huán)境下用超聲細(xì)胞破碎儀勻漿20 s，冰浴上靜置裂解 20 min。4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，收集上清液，根據(jù)BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。10% 的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每孔加入蛋白樣品 50 μg，進(jìn)行電泳；然后進(jìn)行濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜（260 mA 轉(zhuǎn)膜 70 min 至PVDF 膜上）；5% 脫脂奶粉室溫封閉 2 h；特異性一抗（1∶1 000）封閉 4 ℃ 過(guò)夜，TBST 洗膜3 次；二抗IgG-HRP（1∶5 000）室溫封閉 1 h，TBST 洗膜3 次，每次15 min。將 PVDF 膜置于化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行成像，采用 Image Lab 分析軟件對(duì)各組條帶的光密度值進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

研究數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間的比較使用單因素方差分析（One-way ANOVAs），統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用Graphpad Prism 8.0 作柱狀圖，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況，生命體征情況

模型組大鼠心率、呼吸次數(shù)增快、面色青紫，各組分別給與燈盞花素低、高劑量及低分子肝素后有所改善。心率監(jiān)測(cè)顯示：假手術(shù)組（356±14）次/min，模型組（428±31）次/min，燈盞花素低劑量組（374±25）次/min，燈盞花素高劑量組（357±19）次/min，低分子肝素組（385±33）次/min。模型組大鼠與與假手術(shù)組相比，模型組心率增快有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.15，P＜ 0.01）；燈盞花素低劑量組與模型組比較，心率下降有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.30，P＜ 0.01）；燈盞花素高劑量組與模型組比較，心率下降有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.75，P＜ 0.01）；低分子肝素組與模型組比較，心率下降有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.30，P＜ 0.01），見(jiàn)表3，圖1。

表3 燈盞花素對(duì)大鼠肺栓塞生命體征影響（ ）Tab.3 The effect of breviscapine on the vital signs of pulmonary embolism in rats（）

表3 燈盞花素對(duì)大鼠肺栓塞生命體征影響（ ）Tab.3 The effect of breviscapine on the vital signs of pulmonary embolism in rats（）

與假手術(shù)組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與模型組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

圖1 給藥后大鼠心率、呼吸變化Fig.1 Changes in heart rate and respiration in rats after administration

呼吸監(jiān)測(cè)顯示：假手術(shù)組呼吸（82±9）次/min，模型組（94±9）次/min，燈盞花素低劑量組（76±37）次/min，燈盞花素高劑量組（84±10）次/min，低分子肝素組（83±7）次/分。模型組大鼠與與假手術(shù)組比較，模型組呼吸增快有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.44，P＜ 0.05）；低分子肝素組與模型組比較，呼吸下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.34，P＜ 0.05），見(jiàn)表3，圖1。

2.2 病理學(xué)改變

HE 染色肺組織病理的變化顯示：假手術(shù)組肺動(dòng)脈內(nèi)干凈無(wú)血栓，模型組肺小動(dòng)脈內(nèi)血管內(nèi)多發(fā)血栓，肺動(dòng)脈內(nèi)血管內(nèi)間質(zhì)炎癥反應(yīng)明顯，肺泡內(nèi)紅色炎癥樣物質(zhì)滲出，右心室擴(kuò)張，可確定肺栓塞模型組大鼠上述指標(biāo)相比正常組有損傷，造模成功。分別給予高、低劑量燈盞花素后，上述病理改變分別在4 倍鏡、10 倍鏡下好轉(zhuǎn)，肺血管內(nèi)多發(fā)血栓減輕、間質(zhì)炎癥反應(yīng)減輕、肺泡內(nèi)紅色炎癥樣物質(zhì)減少，見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠肺組織病理檢查Fig.2 Pathological examination of lung tissue of rats in each group

2.3 Q-PCR 顯示基因水平改變

各組右心室Q-PCR 結(jié)果：CINC-1 的溶解曲線Ct 值與內(nèi)參比值顯示假手術(shù)組（1.19±0.18），模型組（15.11±2.35），燈盞花素低劑量組（7.40±1.50），燈盞花素高劑量組（2.27±0.45），低分子肝素組（3.20±0.58）。與假手術(shù)組比較，模型組比值明顯升高，差別具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.46，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素低劑量組比值明顯降低，差別具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.77，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素高劑量組比值明顯降低，差別具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.13，P＜ 0.01）；與低分子肝素組比較，燈盞花素高劑量組比值明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.06，P＜ 0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 Q-PCR 檢測(cè)燈盞花素干預(yù)肺栓塞大鼠右心室CINC-1、CINC-2 基因表達(dá)Fig.3 Q-PCR detection of right ventricular CINC-1 and CINC-2 gene expression in rats with breviscapine intervention with pulmonary embolism

各組右心室Q-PCR 結(jié)果：CINC-2 的溶解曲線Ct 值與內(nèi)參比值顯示假手術(shù)組1.27±0.26，模型組11.89±1.82，燈盞花素低劑量組6.12±1.11，燈盞花素高劑量組2.63±0.94，低分子肝素組3.41±0.92。與假手術(shù)組比較，模型組比值明顯升高，差別具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.14，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素低劑量組比值明顯降低，差別具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.62，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素高劑量組比值明顯降低，差別具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.06，P＜ 0.01）；與低分子肝素組比較，燈盞花素高劑量組比值沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.45，P＞ 0.05），見(jiàn)圖3。

2.4 Western-blot 顯示蛋白表達(dá)水平改變

各組右心室CINC-1 的Western-blot 結(jié)果：CINC-1 蛋白表達(dá)水平與內(nèi)參比值顯示假手術(shù)組（0.393±0.168），模型組（0.879±0.132），燈盞花素低劑量組（0.616±0.145），燈盞花素高劑量組0.411±0.74，低分子肝素組0.576±0.138。與假手術(shù)組比較，模型組比值明顯升高，差別具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.57，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素低劑量組比值明顯降低，差別具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.29，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素高劑量組比值明顯降低，差別具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.58，P＜ 0.01）；與低分子肝素組比較，燈盞花素高劑量組比值明顯降低，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.58，P＜ 0.05），見(jiàn)圖4，圖5。

圖4 WB 檢測(cè)肺栓塞大鼠右心室CINC-1、CINC-2 蛋白表達(dá)Fig.4 The protein expression of CINC-1 and CINC-2 in the right ventricle of rats with pulmonary embolism detected by WB

各組右心室 CINC-2 的 Western-blot 結(jié)果：CINC-2 蛋白表達(dá)水平與內(nèi)參比值顯示假手術(shù)組0.462±0.229，模型組 0.934±0.250，燈盞花素低劑量組0.730±0.220，燈盞花素高劑量組 0.506±0.171，低分子肝素組 0.677±0.199。與假手術(shù)組比較，模型組比值明顯升高，差別具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.41，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素高劑量組比值明顯降低，差別具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.47，P＜ 0.01）；與模型組比較，燈盞花素低劑量組比值差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.50，P＞ 0.05）；與低分子肝素組比較，燈盞花素高劑量組比值差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.60，P＞ 0.05），見(jiàn)圖4，圖5。

圖5 WB 檢測(cè)燈盞花素干預(yù)肺栓塞大鼠右心室CINC-1、CINC-2 蛋白表達(dá)Fig.5 WB detection of right ventricular CINC-1 and CINC-2 protein expression in rats with breviscapine intervention withpulmonary embolism

3 討論

隨著各地診斷水平的提高，肺栓塞被越來(lái)越多的重視，每年的肺栓塞確診病例不斷增加。在美國(guó)，每年診治超過(guò) 600 000 例 急性肺栓塞病例，肺栓塞是急診科的常見(jiàn)疾病[8]。來(lái)自發(fā)達(dá)國(guó)家的一項(xiàng)十年的研究顯示：肺栓塞和深靜脈血栓的在癌癥患者中高發(fā)，而且發(fā)生肺栓塞后死亡風(fēng)險(xiǎn)極高[9]。肺栓塞危害極大，常常引起急性右心衰竭、呼吸衰竭、呼吸困難、胸痛甚至猝死等嚴(yán)重并發(fā)癥?；趙estern-blot 和蛋白組學(xué)的研究，肺栓塞導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓和肺部損傷，激活炎癥系統(tǒng)，導(dǎo)致肺部、右心多種炎癥微蛋白表達(dá)差異，炎癥因子可以作為肺栓塞很好的評(píng)估指標(biāo)。肺栓塞的治療一直是臨床棘手的問(wèn)題，主要的治療方案包括抗凝和溶栓藥物治療，但是核心的抗凝藥物肝素可能誘導(dǎo)血小板減少癥、致命性出血、截肢，急性心肌梗塞和中風(fēng)等致命的并發(fā)癥[10]，而溶栓治療大規(guī)模 meta 分析甚至顯示其導(dǎo)致的主要器官出血率高達(dá) 6%，顱內(nèi)出血率高達(dá) 2%[11]。新的治療肺栓塞的藥物開(kāi)發(fā)很有必要。

CINC 系列因子包括中 CINC-1、CINC-2（α、β）等，在嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的炎癥中扮演重要角色[12]。Watts 等[13]報(bào)道肺栓塞使中性粒細(xì)胞右心導(dǎo)致功能障礙，CINC-1、CINC-2 的巨噬細(xì)胞聚集在右心衰肌細(xì)胞損傷的心臟地區(qū)，電子顯微鏡顯示肌細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞的吞噬作用，CINC系列炎癥因子可以作為肺栓塞評(píng)估指標(biāo)。本研究顯示：肺栓塞模型組大鼠心率、呼吸有增快，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，病理示大鼠肺組織內(nèi)見(jiàn)動(dòng)脈血栓、右心室擴(kuò)張，提示肺栓塞可以導(dǎo)致右心衰，誘發(fā)大鼠生命體征惡化。Q-PCR、WB 顯示模型組大鼠右心室心肌 CINC1 及CINC-2 基因、蛋白水平明顯升高，結(jié)果有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜ 0.01），可能的機(jī)制為急性肺栓塞廣泛堵塞下游肺血管床，誘發(fā)肺動(dòng)脈高壓及急性右心衰相關(guān)炎癥反應(yīng)，而急性右心衰繼發(fā)右心室明顯增大、擴(kuò)張、炎癥反應(yīng)，增加了炎癥因子 CINC-1 及 CINC-2 水平。

燈盞花素對(duì)缺血性疾病及肺外的血栓性疾病具有治療作用。也有較強(qiáng)的抗炎效應(yīng)。燈盞花素還有有抗急性肺栓塞的作用，HU 等在大鼠急性肺栓塞模型中證實(shí)了燈盞花素對(duì)肺栓塞動(dòng)物動(dòng)脈血?dú)獾难醴謮骸⒍趸挤謮核疆惓＞哂懈纳谱饔?，但具體機(jī)制及藥物作用的靶點(diǎn)未明確[14]。本課題前期研究顯示燈盞花素有肺內(nèi)抗肺栓塞作用[7]，但對(duì)肺栓塞繼發(fā)右心損傷的炎癥機(jī)制未知。本研究顯示燈盞花素高、低劑量組及低分子肝素組均能改善肺栓塞大鼠心率、呼吸次數(shù)及顯著下調(diào)明顯升高的 CINC-1 及 CINC-2 基因和蛋白水平，提示燈盞花素具有改善肺栓塞后大鼠心率及呼吸增快的效應(yīng)，CINC-1 及 CINC-2 可能作為燈盞花素發(fā)揮抗肺栓塞炎癥作用的新靶點(diǎn)。另外，在大鼠右心 CINC-1 基因和蛋白表達(dá)水平上，燈盞花素高劑量組優(yōu)于陽(yáng)性藥低分子肝素組和燈盞花素低劑量組，燈盞花素具有劑量相關(guān)性。這一結(jié)果證實(shí)了燈盞花素在肺栓塞大鼠模型中具有改善右心室中性粒細(xì)胞驅(qū)化因子的作用可能優(yōu)于低分子肝素。

燈盞花素可以下調(diào)急性肺栓塞大鼠右心室CINC-1、CINC-2 的基因和蛋白表達(dá)水平，可能發(fā)揮抗肺栓塞炎癥的作用。