馬銳，田進(jìn)海，馬榮，萬(wàn)巧鳳，劉河濤，王立斌

0 引言

結(jié)直腸腫瘤（colorectal cancer,CRC）是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分別位列全球惡性腫瘤的第3位和第2位[1]。結(jié)直腸癌早期患者多無(wú)自覺(jué)癥狀，臨床表現(xiàn)不典型，患者的生存期與診斷時(shí)疾病的分期密切相關(guān)。因此，篩選一種有效的結(jié)直腸癌的早期診斷標(biāo)志物，對(duì)延長(zhǎng)患者生存期具有重要的意義[2]。環(huán)狀RNA（circRNAs）是一種新型的非編碼RNA分子，它不存在3’端和5’端，直接由外顯子、內(nèi)含子或兩者共存，反向剪切，形成一個(gè)共價(jià)閉合的連續(xù)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。circRNA在外泌體和血漿中含量豐富且穩(wěn)定，檢測(cè)方便，且在真核生物轉(zhuǎn)錄組中具有組織特異性，能夠?qū)蜣D(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控[3]。同時(shí)，有研究報(bào)道，circRNA可以與具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)結(jié)合進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)活性[4]，并作為分子支架使得多種生物分子趨化，形成多元復(fù)合物，在細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮作用[5]。

多種多樣的生物學(xué)功能使circRNA可以成為一種新的診斷生物標(biāo)志物和基因治療的靶點(diǎn)，研究顯示circRNA在多種疾病中均發(fā)揮重要作用，如乳腺癌、大腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等[6-8]。前期工作中，我們通過(guò)基因芯片分析了在結(jié)直腸癌和鄰近正常組織中的特征性表達(dá)情況，共有13 198個(gè)環(huán)狀RNA，其中6 697個(gè)基因上調(diào)，6 501個(gè)基因下調(diào)[9]。而本研究旨在探討hsa_circ_0018574在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞周期、增殖和凋亡的影響，為circRNA在結(jié)直腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2017年6月—2018年8月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院結(jié)直腸外科確診為結(jié)直腸癌的50例患者術(shù)后癌組織和癌旁組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）無(wú)腫瘤病史；（2）結(jié)直腸癌組織樣本病理診斷明確；（3）無(wú)艾滋病毒感染；（4）行結(jié)直腸癌腫瘤切除術(shù)；（5）收集標(biāo)本前均無(wú)放療或化療史；（6）臨床信息完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往腹部手術(shù)者；（2）伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與腸梗阻者。結(jié)直腸癌組織樣本儲(chǔ)存于液氮中。所有患者在取樣前都簽署知情同意書(shū)，本研究已獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

患者組織樣本總RNA的分離提取按TRIzol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，Nano-Drop2000分光光度計(jì)（美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司）測(cè)定RNA的純度和濃度，OD260/280比值為1.9～2.0。用1%甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性；將提取的總RNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為：1 μl總RNA（約500 ng），1 μl random primer，10 μl ddH2O，2 μl dNTP，4 μl反轉(zhuǎn)錄buffer，1 μl RNA 酶抑制劑，1 μl反轉(zhuǎn)錄酶，總體積20 μl；反應(yīng)條件為：25℃ 5 min，42℃ 60 min，70℃5 min。RNA及cDNA置于-80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微陣列分析

1.4 RT-qPCR檢測(cè)

采用TB Green qPCR MasterMix（TaKaRa，日本）于LightCycler?480實(shí)時(shí)PCR平臺(tái)進(jìn)行RTqPCR，GAPDH的表達(dá)為內(nèi)參對(duì)照。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，hsa_circ_0018574（正向引物：5’-ACAGAAATACAGG CCGAGGAGT-3’；反向引物：5’-TGTCCGTGCCTGTGCAATTA-3’）。RT-qPCR反應(yīng)的總體積為20 μl系統(tǒng)，每孔加入上下游引物各0.8 μl（引物濃度為10 μmol/L），TB Green qPCR MasterMix 10 μl，cDNA 2 μl，6.4 μl雙蒸餾水。RT-qPCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)，60℃ 2 min，收集熒光信號(hào)。基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供，RPMI1640培養(yǎng)基、FBS和青/鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，TRIzol試劑和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine TM2000均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，將HT-29細(xì)胞接種至6孔板，待細(xì)胞貼壁12 h后，用脂質(zhì)體2000將si-circ_0018574質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，使用RT-qPCR檢測(cè)HT-29細(xì)胞中circ_0018574表達(dá)水平。

1.6 平板克隆形成分析

取HT29細(xì)胞，按600個(gè)/孔分別接種于12 孔板中，放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，3～5 d換液，培養(yǎng)10～15 d后棄去培養(yǎng)液，PBS清洗后結(jié)晶紫染色，流水沖洗后晾干，拍照計(jì)數(shù)。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)

將轉(zhuǎn)染后的HT-29細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，按照每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)。分為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的空白對(duì)照組（control）、空載體陰性對(duì)照組（si-NC）和hsa_circ_0018574沉默組（sicirc_0018574）。在細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)加入100 μl細(xì)胞裂解液，在冰上反應(yīng)裂解30 min，使用細(xì)胞刮板收集裂解細(xì)胞。在12 000 r/min，4℃條件下離心10 min，上清液即為蛋白樣本。BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，super block調(diào)整蛋白濃度，取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE（120 g/L電泳凝膠），80 V反應(yīng)40 min，120 V反應(yīng)2.5 h。完成電泳后，濕轉(zhuǎn)儀將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜（200 mA 1.5 h），super block封閉1 h。封閉后的PVDF膜分別加1:1 000稀釋的抗體：兔抗CDK2抗體、兔抗CDK4抗體、兔抗CDK6抗體、兔抗cyclinD1抗體和兔抗cyclinE抗體（美國(guó)Abcam公司）。20 r/min平板搖床4℃孵育過(guò)夜；TBST清洗3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:10 000），平板搖床室溫孵育1 h；TBST清洗后，ECL發(fā)光檢測(cè)，使用蛋白成像系統(tǒng)曝光，觀察條帶，以β-actin蛋白為內(nèi)參蛋白觀察相對(duì)表達(dá)。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

采用MUSE? Caspase-3/7試劑盒（密理博）檢測(cè)細(xì)胞凋亡，收集1×106個(gè)細(xì)胞，取50 μl細(xì)胞懸液加入5 μl caspase-3/7工作液37℃培養(yǎng)30 min，然后加入150 μl 7-AAD工作液（武漢，普諾賽生命科技有限公司）充分混勻后上機(jī)檢測(cè)。

1.9 生物信息學(xué)和數(shù)據(jù)分析

采用Cluster3.0軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析生成聚類(lèi)圖，火山圖采用ggPlot2軟件（R）進(jìn)行分析。circRNA引物由circPrimer1.2軟件設(shè)計(jì)。所有數(shù)據(jù)采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，每個(gè)circRNA的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異倍數(shù)篩選，差異表達(dá)基因采用單因素方差分析或ANOVA。ROC曲線(xiàn)采用SPSS23.0軟件繪制，當(dāng)AUC=0.5時(shí)，circRNA被定義為無(wú)診斷價(jià)值。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 hsa_circ_0018574的序列結(jié)構(gòu)示意圖和siRNA設(shè)計(jì)原則

circbaseID: hsa_circ_0018574，來(lái)源基因DDX21，染色體位置：chr10:70723046-70741337+，全長(zhǎng)1 475 bp，該circRNA跨DDX21基因的4-14號(hào)外顯子環(huán)化而成。引物設(shè)計(jì)必須要跨環(huán)化位點(diǎn)，hsa_circ_0018574（Forward:5’-ACAGAAATACAGG CCGAGGAGT-3’；Reverse: 5’-TGTCCGTGCCTGTGCAATTA-3’）引物特異性高，跨越環(huán)化接頭，見(jiàn)圖1。

圖1 hsa_circ_0018574的序列結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 Sequence structure diagram of hsa_circ_0018574

環(huán)狀RNA的siRNA設(shè)計(jì)原則：使siRNA序列跨過(guò)環(huán)狀RNA的反向連接位點(diǎn)，首先讓反向連接位點(diǎn)置于siRNA序列中間，降低siRNA的脫靶效應(yīng)，然后將設(shè)計(jì)好的正義鏈和反義鏈通過(guò)化學(xué)方法合成，同時(shí)在siRNA的3’端添加兩個(gè)TT脫氧核糖核苷酸，呈單鏈懸掛結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)siRNA序列的在體內(nèi)和體外的穩(wěn)定性，防止siRNA序列發(fā)生降解。本身siRNA是跨circRNA反向鏈接位點(diǎn)設(shè)計(jì)的，siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后又做了定量分析確定hsa_circ_0018574表達(dá)量降低了，這就證明我們?cè)O(shè)計(jì)的siRNA就是針對(duì)hsa_circ_0018574，排除作用于其他mRNA。

在堤壩的使用過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)遇到滲水、開(kāi)裂及滑坡等的情況，在這些堤壩病害中，滲水是最常見(jiàn)的堤壩病害，但是因?yàn)樾纬傻虊螡B水的原因不一，因此，堤壩的滲水類(lèi)型也有所不同。經(jīng)過(guò)實(shí)地考察，發(fā)現(xiàn)堤身滲水是堤壩滲水類(lèi)型之一。出現(xiàn)堤身滲水的情況主要是因?yàn)樵诘虊问┕さ倪^(guò)程中，堤身填充或壓實(shí)不均勻，長(zhǎng)期受水的沖刷作用，密度與濕度欠缺的堤身部分就會(huì)出現(xiàn)滲水的情況[1]。

2.2 hsa_circ_0018574的篩選及驗(yàn)證

本研究共收集了4例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織（C1-C4）和相鄰癌旁正常組織（N1-N4）進(jìn)行測(cè)序分析，通過(guò)微陣列基因芯片對(duì)這4對(duì)結(jié)直腸癌患者腫瘤組織及癌旁正常組織進(jìn)行表達(dá)譜芯片分析。獲得差異表達(dá)的circRNA，其中高表達(dá)6 697個(gè)，低表達(dá)6 501個(gè)，見(jiàn)圖2A。按照差異倍數(shù)（FC值）≥5和P＜0.01，篩選5個(gè)表達(dá)上調(diào)，5個(gè)表達(dá)下調(diào)的circRNA，篩選確定hsa_circ_0018574，見(jiàn)圖2B。通過(guò)RT-qPCR在50對(duì)結(jié)直腸癌及癌旁組織中驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0018574在結(jié)直腸癌組織中顯著上調(diào)（P＜0.01），見(jiàn)圖2C。

圖2 微陣列分析hsa_circ_0018574在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)Figure 2 Microarray assay of hsa_circ_0018574 expression in CRC tissues

2.3 人結(jié)腸癌細(xì)胞中hsa_circ_0018574沉默效果的檢測(cè)

轉(zhuǎn)染si-circ_0018574 48 h后，與Control組、si-NC組相比，實(shí)驗(yàn)組（si-circ_0018574組）在轉(zhuǎn)染si-circ_0018574后，HT29細(xì)胞內(nèi)circRNA_0018574的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染s i-circ_0018574后結(jié)腸腫瘤細(xì)胞中circRNA_0018574的表達(dá)Figure 3 The expression level of circRNA_0018574 after si-circ_0018574 transfection

2.4 沉默circRNA-0018574表達(dá)抑制人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞的增殖

結(jié)果顯示，與s i-N C 組相比，沉默c i rcRNA_0018574結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和集落形成能力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

圖4 平板克隆實(shí)驗(yàn)觀察si-circ_0018574轉(zhuǎn)染后HT29細(xì)胞集落形成能力Figure 4 Colony formation assay to observe the colony forming ability of HT29 cells after transfection of si-circ_0018574

2.5 沉默circRNA-0018574表達(dá)對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞周期蛋白的影響

Western blot結(jié)果顯示，si-circ_0018574組的CDK2、CDK4、CDK6以及cyclinD1、cyclinE周期蛋白較si-NC組顯著下調(diào)（均P＜0.01），見(jiàn)圖5。

圖5 Western blot法檢測(cè)si-circ_0018574對(duì)HT29細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 5 The expression of HT29 cells cycle-associated proteins after transfection of si-circ_0018574 was detected by Western blot analysis

2.6 沉默circRNA_0018574表達(dá)促進(jìn)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞的凋亡

流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)表示，CASPASE-3/7是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的因子，而與陰性對(duì)照組si-NC相比，轉(zhuǎn)染si-circ_0018574后的人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞凋亡加速，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖6。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)觀察轉(zhuǎn)染si-circ_0018574后HT29細(xì)胞凋亡情況Figure 6 Flow cytometry assay to observe the apoptosis of HT29 cells after transfection of si-circ_0018574

3 討論

結(jié)腸癌是全球范圍內(nèi)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率高及早期癥狀隱匿等特點(diǎn)。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及多基因介導(dǎo)和多酶促反應(yīng)參與的復(fù)雜生物學(xué)調(diào)控機(jī)制。既往研究顯示，癌基因的激活或抑癌基因表達(dá)的降低、失活均可增強(qiáng)腫瘤惡性進(jìn)展，如促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移等[10]。結(jié)腸癌診療技術(shù)（手術(shù)切除聯(lián)合放、化療）雖在不斷進(jìn)步和完善，但患者預(yù)后仍較差。因此，探尋結(jié)腸癌新型生物治療靶標(biāo)，尤其對(duì)于早期篩查結(jié)直腸癌患者是當(dāng)前臨床研究攻克的重點(diǎn)。

circRNA為單鏈共價(jià)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這種封閉環(huán)形結(jié)構(gòu)使其具有獨(dú)特的穩(wěn)定性、進(jìn)化保守性、多樣性以及在不同組織、生長(zhǎng)階段中的特異性。有研究發(fā)現(xiàn)，許多circRNA參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移[11]。例如，circDDX17在結(jié)直腸癌組織中明顯下調(diào)，并與不良的臨床病理參數(shù)有關(guān)[12]。miR-876-5p可以識(shí)別circRNA CDR1as，其作為miR-876-5p的“海綿”，反向負(fù)調(diào)控CDR1as在肝癌中的表達(dá)和功能，抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[13]。隨著生命科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，circRNA越來(lái)越多的功能被不斷挖掘出來(lái)。目前，已發(fā)現(xiàn)circRNA的表達(dá)譜與結(jié)直腸癌患者的臨床病理學(xué)特征有關(guān)，如組織分化、TNM分類(lèi)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等[14]；circRNA的差異表達(dá)也通過(guò)腫瘤相關(guān)信號(hào)通路調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和進(jìn)展[15]；由于circRNA不易被核酸酶降解，具有保守性高、細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高的特點(diǎn)，為其作為診斷癌癥的理想生物標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)[16]。

本研究采用circRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測(cè)在結(jié)直腸腫瘤組織和癌旁組織標(biāo)本中差異表達(dá)的circRNA，該芯片包含13 198條環(huán)狀RNA探針，經(jīng)過(guò)微陣列基因芯片篩選，確定hsa_circ_0018574為研究目標(biāo)。對(duì)結(jié)直腸腫瘤組織及癌旁正常組織進(jìn)行表達(dá)譜芯片分析和RT-qPCR結(jié)果顯示，hsa_circ_0018574在人結(jié)直腸腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織。

在確定circ_0018574在結(jié)直腸癌中的保守性和穩(wěn)定性，并對(duì)其在結(jié)直腸癌中的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)后，本研究進(jìn)一步通過(guò)circ_0018574沉默技術(shù)研究其對(duì)人結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響。平板克隆法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將si-circ_0018574和空載體轉(zhuǎn)染至HT29細(xì)胞中，si-circ_0018574能夠明顯抑制人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力。細(xì)胞周期停滯與許多細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白和細(xì)胞周期相關(guān)激酶的表達(dá)有關(guān)。之前有研究表明，細(xì)胞依賴(lài)性激酶（cyclin dependent kinases,CDKs）CDK2、CDK4和CDK6是細(xì)胞由G1期轉(zhuǎn)入S期的重要調(diào)節(jié)因子，而且cyclinD和cyclinE通過(guò)結(jié)合CDK4和CDK6，進(jìn)而調(diào)節(jié)其活性，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展[17-18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染sicirc_0018574后，人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞中CDK2、CDK4、CDK6以及cyclinD1和cyclinE周期蛋白表達(dá)明顯降低。提示干擾circRNA_0018574可延長(zhǎng)細(xì)胞周期的S期，阻滯于G1/S期，抑制紡錘體形成，以減少細(xì)胞分裂，進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖作用。Caspase在凋亡信號(hào)的作用下首先激活啟動(dòng)型Caspase引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，然后通過(guò)活化的Caspase裂解底物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[19-20]。MUSE DEVD caspase-3/7試劑含一種DNA結(jié)合染料，該染料與DEVD肽底物相連，當(dāng)它與DEVD結(jié)合時(shí)，染料不能結(jié)合DNA?；钚訡aspase-3/7在細(xì)胞內(nèi)的裂解導(dǎo)致染料釋放，移位到細(xì)胞核，染料與DNA結(jié)合，并表現(xiàn)出高熒光。當(dāng)觀察到Caspase-3/7參數(shù)的熒光增加時(shí)，很容易獲得細(xì)胞中存在活性Caspase-3/7的信息。在流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染si-circ_0018574后可以促進(jìn)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞凋亡，通過(guò)抑制其表達(dá)可延緩腫瘤的發(fā)展。

綜上所述，has-circ_0018574在結(jié)直腸腫瘤患者組織和細(xì)胞中高表達(dá)，si-circ_0018574能夠顯著抑制人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞增殖和克隆形成能力，將HT29細(xì)胞阻滯于G1/S期，減少細(xì)胞分裂，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果為結(jié)直腸腫瘤的早期診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供新的證據(jù)，但has_circ_0018574在結(jié)直腸腫瘤中的靶基因及調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚，仍需要進(jìn)一步深入研究。

致謝：感謝寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院結(jié)直腸外科為本實(shí)驗(yàn)提供臨床樣本。