林麗燕，盧建平，朱偉峰，何時(shí)，彭鳳英，陳剛

0 引言

原發(fā)性肝癌是全球最常見的惡性腫瘤之一。2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肝癌發(fā)病率位居第6位，死亡率居第3位，全球每年新發(fā)肝癌病例905 677例，死亡病例達(dá)到830 180例。在原發(fā)性肝癌中肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）占比75%～85%[1]。我國(guó)肝癌死亡病例達(dá)391 152例，與2018年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)相比，死亡率由第4位升至第2位[2]。盡管近年來針對(duì)肝細(xì)胞癌的研究取得了較大的進(jìn)展，但肝細(xì)胞癌的發(fā)病率和死亡率并沒有明顯的下降，其發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)的機(jī)制仍然備受關(guān)注，尋找能夠有效預(yù)測(cè)患者預(yù)后的指標(biāo)及新治療靶點(diǎn)仍是現(xiàn)階段腫瘤研究重點(diǎn)。

整合素β樣1（integrin subunit β like 1,ITGBL1）是與整合素β相關(guān)的細(xì)胞基質(zhì)蛋白，首先在成骨細(xì)胞的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)，其編碼蛋白包括一個(gè)典型的信號(hào)肽和一個(gè)由10個(gè)EGF樣串連重復(fù)序列組成的共471個(gè)氨基酸的親水性功能區(qū)，與整合素β亞基具有高度同源性[3]。ITGBL1在多種腫瘤中表達(dá)升高，并與患者不良預(yù)后相關(guān)，如胃癌[4]、前列腺癌[5]、結(jié)腸癌[6]及卵巢癌[7]等，但是ITGBL1在HCC中的研究較少。本研究通過RT-qPCR檢測(cè)人HCC組織中ITGBL1的表達(dá)情況，探討其蛋白表達(dá)水平與患者臨床病理學(xué)參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，以及ITGBL1基因在HCC細(xì)胞株中的作用，為尋找新的肝癌預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

選取2018年1月—2018年6月在福建省腫瘤醫(yī)院行根治切除，且術(shù)前未行治療的新鮮HCC樣本12例，離體后30 min內(nèi)置于-70℃冰箱保存，每例包含癌和癌旁肝組織（距腫瘤邊緣2 cm以上），用于RT-qPCR檢測(cè)。回顧性收集2011年1月—2018年6月在福建省腫瘤醫(yī)院行根治切除且術(shù)前未行治療的HCC患者術(shù)后標(biāo)本共160例，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)后病理診斷確診為肝細(xì)胞癌；（2）手術(shù)前未進(jìn)行其他的抗腫瘤治療方式如介入治療、化療或放療等。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)后病理診斷為非肝細(xì)胞癌的其他類型腫瘤；（2）術(shù)前接受過其他抗腫瘤治療方式。本研究通過福建省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查。

1.2 隨訪

電話隨訪每3個(gè)月1次，隨訪截止時(shí)間為2020年11月1日?？偵鏁r(shí)間（OS）定義為從手術(shù)當(dāng)日至患者死亡或末次隨訪日期的間隔時(shí)間。無病生存時(shí)間（DFS）定義為患者手術(shù)時(shí)間至第一次復(fù)發(fā)的時(shí)間間隔。160例HCC患者中DFS隨訪資料完整者有111例，隨訪率為69.4%，復(fù)發(fā)病例66例，復(fù)發(fā)率為59.5%。隨訪滿5年且具有完整OS資料的患者有53例，其中38例死亡，死亡率為71.7%，失訪原因?yàn)槲催M(jìn)行門診復(fù)診或電話無法聯(lián)系。

1.3 手術(shù)后治療情況

入組病例28例未定期復(fù)查，5例術(shù)后未進(jìn)行治療，單純經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（transarterial chemoembolization,TACE）治療79例，放射治療2例，化療1例，靶向治療1例，射頻消融治療1例，單純細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）治療9例，TACE聯(lián)合CIK治療14例，TACE聯(lián)合靶向治療9例，TACE聯(lián)合靶向及免疫治療3例，TACE聯(lián)合消融治療5例，中藥治療2例，復(fù)發(fā)后二次手術(shù)1例。

1.4 實(shí)驗(yàn)材料

人肝癌細(xì)胞株HUH7、LM3、MHCC97H（購自中科院上海細(xì)胞庫），293T細(xì)胞（購自上海吉?jiǎng)P公司），TRIZOL抽提試劑（上海賽默飛公司），qRT-PCR試劑盒（北京NEB公司），ITGBL1、GAPDH正反義鏈引物（由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成），RIPA裂解液（上海碧云天公司），ITGBL1抗體（美國(guó)Sigma公司），GAPDH抗體（美國(guó)Abcam公司），即用型免疫組織化學(xué)EliVision super試劑盒（鼠/兔）、DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），Transwell小室（美國(guó)Millipore公司），Matrigel基質(zhì)膠（美國(guó)Corning公司），CCK8試劑（美國(guó)Biosharp公司），攜帶表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的ITGBL1的重組慢病毒過表達(dá)載體和干擾載體（由上海吉?jiǎng)P公司篩選、構(gòu)建并包裝），胎牛血清（中國(guó)Gibco公司）。

1.5 總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用TRIzol試劑，分別提取12例新鮮HCC樣本及配對(duì)癌旁肝組織的總RNA，利用一步法RT-qPCR試劑盒進(jìn)行組織樣本中ITGBL1基因表達(dá)量檢測(cè)，ITGBL1引物：上游引物序列5’-GG TTGGCATGGAGATAAATGTGA-3’，下游引物序列5’-CGGATCAACATCGTGACAGGTA-3’；內(nèi)參GAPDH引物：上游引物序列5’-CAAGGT CATCCATGACAACTTTG-3’，下游引物序列5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。采用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)：ΔCt=目的基因Ct值－內(nèi)參基因Ct值；－ΔΔCt=對(duì)照組ΔCt平均值－各樣品ΔCt值；2-ΔΔCt反映各樣品相對(duì)于對(duì)照組樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 免疫組織化學(xué)染色

采用EnVision plus兩步法對(duì)HCC石蠟組織樣本中ITGBL1蛋白進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，石蠟切片均常規(guī)烤片、脫蠟、水化后，用檸檬酸熱修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)。一抗選擇ITGBL1（1:100，美國(guó)Sigma公司），二抗選擇即用型辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗鼠/兔抗體（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。采用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例綜合評(píng)分，ITGBL1蛋白陽性定位在細(xì)胞質(zhì)上。染色強(qiáng)度評(píng)分定義為：0分：無色；1分：淺黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色。陽性細(xì)胞數(shù)比例評(píng)分定義：0分：無陽性細(xì)胞；1分：陽性細(xì)胞比例＜25%；2分：陽性細(xì)胞比例26%～50%；3分：陽性細(xì)胞比例51%～75%；4分：陽性細(xì)胞比例＞76%。最終結(jié)果由染色強(qiáng)度評(píng)分和陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分乘積判定，0～3分為低表達(dá)，＞3分為高表達(dá)。

1.7 構(gòu)建ITGBL1過表達(dá)及干擾慢病毒載體

通過查詢PubMed的GeneBank數(shù)據(jù)庫獲得人ITGBL1基因信息及序列（NM_004791），合成基因片段并構(gòu)建至慢病毒載體GV492上，構(gòu)建ITGBL1過表達(dá)慢病毒載體；以ITGBL1基因?yàn)槟０澹鶕?jù)RNAi干擾序列設(shè)計(jì)原則，獲取多個(gè)RNAi靶點(diǎn)序列，選擇最佳動(dòng)力學(xué)參數(shù)的靶點(diǎn)進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。設(shè)計(jì)的RNAi靶點(diǎn)序列分別為：5’-ATGGGA AGTGTTACTGTGGAA-3’、5’-TTGCGGAAGATG TGACTGCAA-3’、5’-ATGGATGGAATGGAAATG CAT-3’，并以GV248為載體，構(gòu)建ITGBL1慢病毒干擾載體。根據(jù)病毒包裝手冊(cè)，使用Lipofectamine 2000為轉(zhuǎn)染試劑，將ITGBL1-GV492質(zhì)粒、ITGBL1-GV248質(zhì)粒、對(duì)照質(zhì)粒分別與包裝質(zhì)粒（Helper 1.0和Helper 2.0載體）共同轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，待48 h后收獲上清液，以0.45 μm濾器過濾后進(jìn)行滴度測(cè)定，并分裝保存在病毒管中，-80℃長(zhǎng)期保存。

1.8 重組慢病毒載體感染人肝癌細(xì)胞株HUH7和LM3

消化后重懸HUH7和LM3細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞融合度達(dá)40%～50%，用ITGBL1過表達(dá)慢病毒載體和對(duì)照組空載體慢病毒感染HUH7細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection,MOI）為10，聚凝胺終濃度為5 μg/ml，兩組細(xì)胞標(biāo)記為HUH7/OE和HUH7/Ctrl；ITGBL1-RNAi慢病毒干擾載體和對(duì)照組空載體慢病毒感染LM3細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)為30，聚凝胺終濃度為5 μg/ml，兩組細(xì)胞標(biāo)記為L(zhǎng)M3/ShITGBL1和LM3/Ctrl。12 h后更換新鮮完全培養(yǎng)基，72 h后用熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)情況，并計(jì)算感染效率。

1.9 細(xì)胞總蛋白提取及Western blot檢測(cè)

感染后第3天，收集細(xì)胞于離心管中，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解10 min，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入制備好的SDS-PAGE上樣緩沖液，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜置于脫脂牛奶中室溫封閉2 h，孵育稀釋的一抗 ITGBL1（1:1 000），4℃過夜，TBST洗膜后，室溫孵育辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗2 h，經(jīng)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）熒光底物反應(yīng)后，膠片曝光顯影。

1.10 CCK8實(shí)驗(yàn)

胰酶消化細(xì)胞后，加入培養(yǎng)基終止，1 200 rpm離心5 min，棄上清液，加入培養(yǎng)基混勻后計(jì)數(shù)；接細(xì)胞到96孔板中，5 000個(gè)/孔（100 μl培養(yǎng)基）；細(xì)胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，加入100 μl CCK8工作液（10 μl CCK8母液+90 μl培養(yǎng)基），60 min后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)吸光值（450 nm波長(zhǎng)），連續(xù)4天檢測(cè)細(xì)胞活力并根據(jù)結(jié)果作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.11 劃痕實(shí)驗(yàn)

用馬克筆在6孔板背后劃豎線，每孔1條；消化細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞濃度，孔中加入約1×106個(gè)細(xì)胞；第二天用槍頭垂直于背后的豎線劃痕，PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基；放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)0、48 h后進(jìn)行拍照。

1.12 Transwell實(shí)驗(yàn)

將Matrigel基質(zhì)膠稀釋50倍（冰上操作），在每個(gè)小室中加入10 μl Matrigel膠，鋪勻，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中待膠干后方將細(xì)胞消化，接種至小室中；每個(gè)小室接種合適細(xì)胞數(shù)量（HUH7接種1×105個(gè)，LM3接種1.5×105個(gè)），上室中的培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，下室培養(yǎng)基為含20%FBS的完全培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；48 h進(jìn)行結(jié)晶紫染色：用棉簽擦去上室未穿過的細(xì)胞后，用4%多聚甲醛固定30 min，再用PBS洗兩遍，加入1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗三遍，室溫晾干，隨機(jī)挑選視野拍照（100倍鏡）。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS20.0進(jìn)行分析。采用Mann-Whiteney U檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析癌組織與癌旁組織中ITGBL1 mRNA和蛋白表達(dá)差異；卡方檢驗(yàn)分析ITGBL1蛋白表達(dá)水平與一般臨床資料的相關(guān)性；Kaplan-Meier單因素分析HCC患者DFS和OS，用Log rank進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)；并用多因素Cox回歸模式評(píng)估死亡危險(xiǎn)比及95%CI，探討可能影響患者生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后因素；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)計(jì)量資料以（）表示，采用Student′st檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ITGBL1在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

160例患者的一般臨床資料見表1。與癌旁肝組織相比，癌組織中ITGBL1基因表達(dá)高于癌旁肝組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-3.233,P=0.001），見圖1A。ITGBL1蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)中，組織中的小膽管及間質(zhì)中的纖維細(xì)胞也呈陽性表達(dá)，可以作為內(nèi)部陽性對(duì)照。結(jié)果顯示，癌組織ITGBL1蛋白高表達(dá)率為55.0%（88/160），而相應(yīng)的癌旁肝組織高表達(dá)率為31.9%（51/160），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-3.860,P=0.000），見圖1B。在多個(gè)樣本中也觀察到，ITGBL1在腫瘤包膜侵犯處及癌巢浸潤(rùn)性邊緣的表達(dá)明顯高于腫瘤內(nèi)部。此外，在脈管周圍的癌組織中，ITGBL1的表達(dá)也高于周圍的癌組織，見圖1C。

圖1 ITGBL1在HCC中的表達(dá)情況及臨床意義Figure 1 Expression of ITGBL1 in HCC and its clinical significance

表1 160例肝細(xì)胞癌患者的一般臨床資料Table 1 Clinical features of 160 patients with hepatocellular carcinoma

2.2 ITGBL1蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)果顯示，ITGBL1蛋白表達(dá)與血清AFP水平、包膜侵犯、脈管癌栓、腫瘤分化及臨床分期相關(guān)（均P＜0.05），而與患者性別、年齡、腫瘤大小、周圍肝硬化情況、乙肝病毒感染情況及是否肝外轉(zhuǎn)移無關(guān)，見表2。

表2 ITGBL1蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 (N=160)Table 2 Correlation between ITGBL1 protein expression and clinicopathological features in patients with HCC (N=160)

2.3 ITGBL1的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier單因素分析結(jié)果顯示，160例HCC患者中，ITGBL1蛋白高表達(dá)患者3、5年無病生存率分別為14.3%、2.0%，低表達(dá)患者3、5年無病生存率分別為33.9%、14.5%。Log rank檢驗(yàn)顯示，ITGBL1高表達(dá)組患者DFS低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0042），見表3、圖2。但多因素Cox回歸分析顯示，腫瘤分化及脈管癌栓是影響HCC患者術(shù)后DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表4。兩組病例OS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 Kaplan-Meier單因素分析ITGBL1表達(dá)與HCC患者無病生存時(shí)間的關(guān)系Figure 2 Kaplan-Meier analysis to identify the relationship between ITGBL1 expression and disease-free survival of HCC patients

表3 單因素Log rank分析可能影響HCC患者術(shù)后DFS的預(yù)后因素Table 3 Univariate Log rank analysis to identify potential prognostic factors affecting DFS of HCC patients

表4 多因素Cox回歸分析影響HCC患者術(shù)后DFS的獨(dú)立預(yù)后因素Table 4 Multivariate Cox regression analysis to identify independent prognostic factors affecting DFS in HCC patients

2.4 ITGBL1與HCC細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的關(guān)系

三株HCC細(xì)胞株HUH7、LM3和MHCC97H中ITGBL1基因mRNA和蛋白的本底表達(dá)情況見圖3A，ITGBL1基因在低轉(zhuǎn)移潛能的HUH7細(xì)胞株中表達(dá)較低，而在高侵襲潛能的細(xì)胞株LM3和MHCC97H中高表達(dá)，因此，選擇ITGBL1基因mRNA/蛋白表達(dá)最低的HUH7構(gòu)建ITGBL1基因上調(diào)表達(dá)的細(xì)胞株模型，而ITGBL1基因mRNA/蛋白表達(dá)較高的細(xì)胞株LM3構(gòu)建ITGBL1基因表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞株模型，從兩個(gè)方面探討ITGBL1在HCC細(xì)胞中的作用。

過表達(dá)慢病毒載體感染HUH7細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)組HUH7/OE與對(duì)照組HUH7/Ctrl比較，ITGBL1基因mRNA及蛋白的表達(dá)均明顯升高（P=0.001）；ITGBL1-RNAi慢病毒載體感染LM3細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)組LM3/ShITGBL1與對(duì)照組LM3/Ctrl比較，ITGBL1基因mRNA及蛋白水平較對(duì)照組表達(dá)明顯下降（P=0.006），見圖3B。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)ITGBL1基因后細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（t=16.726,P=0.000），敲降ITGBL1基因后，細(xì)胞增殖能力減低（t=-48.702,P=0.000），見圖3C。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ITGBL1后，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)（t=7.085,P=0.000），敲降ITGBL1后，細(xì)胞遷移能力減弱（t=-9.209,P=0.000），見圖3D。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)ITGBL1后，細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)（t=7.990,P=0.001），敲降ITGBL1后，細(xì)胞侵襲能力減弱（t=-19.092,P=0.000），見圖3E。

圖3 ITGBL1促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲Figure 3 ITGBL1 promoted HCC cell growth,migration and invasion in vitro

3 討論

術(shù)后HCC患者的預(yù)后一直是研究關(guān)注的焦點(diǎn)。尋找有效的預(yù)測(cè)患者預(yù)后的指標(biāo)將有助于臨床醫(yī)生制定個(gè)體化的隨訪及后續(xù)的治療方案，減少患者費(fèi)用，延長(zhǎng)患者的生存率。80%～90%的HCC發(fā)生在肝纖維化及肝硬化的基礎(chǔ)之上，并且肝纖維化與HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)[8]。有研究表明，在慢性肝炎患者中，ITGBL1是肝硬化形成的重要風(fēng)險(xiǎn)因子及肝纖維化的主要調(diào)節(jié)因子[9-10]。此外，ITGBL1在多種腫瘤中表達(dá)增高并與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。在胃癌中，ITGBL1在癌組織表達(dá)高于癌旁組織，且與患者的不良預(yù)后、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)[4,11]；在結(jié)腸癌中，ITGBL1在癌組織中高表達(dá)，且高表達(dá)患者的生存時(shí)間較短[12]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)新鮮HCC樣本進(jìn)行RTqPCR檢測(cè)，對(duì)石蠟樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示癌組織中ITGBL1基因表達(dá)高于癌旁組織，并且ITGBL1蛋白表達(dá)與多種不良預(yù)后因素如腫瘤包膜侵犯、脈管癌栓、腫瘤分化及分期等相關(guān)，提示該基因可能與HCC的侵襲及進(jìn)展密切相關(guān)。Kaplan-Meier單因素分析結(jié)果顯示ITGBL1高表達(dá)組患者DFS較短，但多因素COX分析未能顯示ITGBL1基因表達(dá)是影響HCC患者DFS的獨(dú)立預(yù)后因素，且兩組患者OS無明顯差異，這可能與具有完整隨訪資料的術(shù)后患者較少有關(guān)，后續(xù)將擴(kuò)大病例量，并對(duì)所有病例的隨訪資料完善后進(jìn)行進(jìn)一步的分析。此外，本組病例患者術(shù)后治療方式多樣，根據(jù)《原發(fā)性肝癌診療指南（2022年版）》，術(shù)后TACE治療具有減少復(fù)發(fā)、延長(zhǎng)生存的效果，免疫治療、靶向藥物等治療策略也在積極的探索中。一旦發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，根據(jù)復(fù)發(fā)腫瘤的特征，可以選擇再次手術(shù)切除、消融治療、介入治療、放射治療或系統(tǒng)抗腫瘤治療等，延長(zhǎng)患者生存[13]。術(shù)后治療方式的選擇會(huì)對(duì)患者的預(yù)后產(chǎn)生影響，試驗(yàn)的理想情況是患者的治療數(shù)據(jù)盡量一致，但在真實(shí)世界中很難做到。在本組病例中，即便是單純TACE治療，患者治療的次數(shù)也不盡相同，以現(xiàn)有的病例數(shù)難以根據(jù)治療情況進(jìn)行分層分析。

ITGBL1與多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。既往研究表明，ITGBL1可以通過Wnt信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[14]；通過Akt信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲[15]；通過NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲及轉(zhuǎn)移[16]。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)三株常用的HCC細(xì)胞株內(nèi)（包含1株低轉(zhuǎn)移潛能的HUH7細(xì)胞株，及2株高轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞株MHCC97H和LM3）ITGBL1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，ITGBL1在HUH7細(xì)胞中低表達(dá)，在MHCC97H和LM3中高表達(dá)，提示該基因可能與腫瘤的侵襲相關(guān)；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步顯示，ITGBL1可以促進(jìn)HCC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移：過表達(dá)ITGBL1基因后，HUH7細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)，而下調(diào)表達(dá)ITGBL1后LM3細(xì)胞的遷移和侵襲能力降低，與Huang等[17]在其他HCC細(xì)胞株中的研究結(jié)果一致。腫瘤細(xì)胞的遷移能力是造成腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素[18]，這也在一定程度上解釋了本組高表達(dá)ITGBL1患者具有較短的DFS。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示ITGBL1可以促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖能力，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

ITGBL1為分泌性蛋白，Ji等發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌模型中，腫瘤細(xì)胞可通過分泌富含ITGBL1的胞外囊泡進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，促進(jìn)遠(yuǎn)隔臟器內(nèi)成纖維細(xì)胞的活化，而活化的成纖維細(xì)胞可通過分泌促炎因子及纖維相關(guān)因子（如TGF-β、SMA）促進(jìn)轉(zhuǎn)移部位腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[19]，Li等也發(fā)現(xiàn)ITGBL1可以通過激活TGF-β信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移[20]。在本實(shí)驗(yàn)的部分病例中可見ITGBL1蛋白在包膜侵犯處、脈管周圍癌組織及癌巢浸潤(rùn)性邊緣都具有較強(qiáng)的表達(dá)，也提示該基因在促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用。此外，ITGBL1在脈管周圍表達(dá)增高的模式，提示外周血中ITGBL1的檢測(cè)可能具有一定的臨床意義。Ye等的研究結(jié)果顯示，血清ITGBL1聯(lián)合AFP檢測(cè)可以提高HBV相關(guān)早期HCC的檢出率[21]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，HCC癌組織中ITGBL1的表達(dá)與血清AFP水平具有一定的相關(guān)性，但I(xiàn)TGBL1能否與AFP一樣作為評(píng)估HCC患者預(yù)后的血清生物學(xué)標(biāo)志物還有待于進(jìn)一步的探討。Cheli等發(fā)現(xiàn)，在惡性黑色素瘤中ITGBL1可以通過抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，使黑色素瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視，但具體機(jī)制及特異性靶向該基因在改善免疫系統(tǒng)中的作用仍在進(jìn)一步研究中[22]。

綜上所述，ITGBL1基因在HCC癌組織中表達(dá)增高，并可以促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，是HCC患者預(yù)后判斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，并為開發(fā)新的治療方法、治療藥物提供基礎(chǔ)和依據(jù)，但I(xiàn)TGBL1在HCC中具體作用的分子機(jī)制仍不明確，尚需要在細(xì)胞株中進(jìn)行深入探索。