劉強(qiáng)，孫少明，王文俊

0 引言

胃癌是常見(jiàn)的消化道癌癥，具有發(fā)病隱匿、發(fā)展迅速、惡性程度高及預(yù)后較差等特點(diǎn)，且發(fā)病趨于年輕化，因此及早對(duì)胃癌進(jìn)行診斷，實(shí)施早期干預(yù)，是改善胃癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。目前臨床上通常采用胃鏡、病理活檢及腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原等對(duì)胃癌進(jìn)行篩查，但以上方法均具有一定的局限性，因此尋找新型的胃癌早期診斷標(biāo)志物尤為重要。微小RNA（miRNA）在多種腫瘤中表達(dá)異常，通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及凋亡等過(guò)程，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在腫瘤的早期診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)及防治中具有潛在重要價(jià)值。有研究表明[1]，miR-101-3p在胃癌組織中呈低表達(dá)，與胃癌黏膜下浸潤(rùn)及患者預(yù)后相關(guān)，可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展。隨后Xu等[2]也發(fā)現(xiàn)胃癌組織中miR-101-3p水平較低，同時(shí)miR-101-3p能抑制癌細(xì)胞增殖，增強(qiáng)對(duì)5-氟尿嘧啶的化學(xué)敏感度，且另有研究表明miR-101-3p能抑制胃癌細(xì)胞的存活和轉(zhuǎn)移[3]。以上研究結(jié)果提示miR-101-3p可能抑制胃癌的惡性進(jìn)展。斯鈣素1（stanniocalcin 1,STC-1）是一種糖蛋白激素，在多種腫瘤組織中高表達(dá)，與癌細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡和血管生成等密切相關(guān)[4]。近年來(lái)研究顯示STC-1在胃癌患者癌組織和外周血中高表達(dá)，且與胃癌增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)[5]。然而miR-101-3p和STC-1是否存在關(guān)聯(lián)以及兩者對(duì)胃癌的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究擬探討miR-101-3p與STC-1的關(guān)系，對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路和對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成的影響，以期為胃癌的臨床靶向治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例資料

選擇80例2019年1月到2020年10月在大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院急腹癥外科診治的80例胃癌患者為胃癌組，其中男47例，女33例，年齡為35～79歲。收集患者的病歷資料及手術(shù)切除的胃癌組織標(biāo)本。采集的標(biāo)本保存于液氮（－196℃）中。一般臨床資料包括患者年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度等信息。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)胃鏡和病理組織學(xué)確診為胃癌；（2）無(wú)其他重大疾病者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）癌旁組織有明顯的炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)；（2）胃潰瘍、胃糜爛者；（3）其他惡性腫瘤者。另外選取40例健康體檢者為對(duì)照組，年齡34～75歲。各組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.767,P=0.445），具有可比性。所有患者均簽署知情同意書(shū)，本研究已獲得大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（K2018021）。

1.2 研究材料

正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1（上海滬震生物科技有限公司）；胃癌細(xì)胞株BGC-823（上海博研生物科技有限公司）；BALB/c雌性裸鼠（斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，使用許可證號(hào)：SYXK（京）2019-0030））；RPMI1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（中國(guó)四季青生物公司）；NC mimic、miR-101-3p mimic、pcDNA-STC-1、pcDNA-NC質(zhì)粒（上海生物工程有限公司）；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；miR-101-3p、STC-1、U6、GAPDH引物（上海華大基因科技有限公司）；BCA試劑盒、ECL顯影劑（中國(guó)碧云天公司）；STC-1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT（美國(guó)Abcam公司）；MMP-2、MMP-9、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血管生成素2（Ang2）抗體（美國(guó)CST公司）；二抗（北京博爾西科技有限公司）；Thermo酶標(biāo)儀（上海熱電儀器有限公司）；冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；Bio-Rad蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 細(xì)胞培養(yǎng)[6]：BGC-823細(xì)胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。每2天更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，用胰蛋白酶進(jìn)行消化并傳代。

細(xì)胞分組[7]：將BGC-823細(xì)胞分為對(duì)照組、miR-NC組（轉(zhuǎn)染NC mimic的細(xì)胞）、miR-101-3p組、pcDNA-NC組、STC-1組、miR-101-3p+pcDNA-NC組、miR-101-3p+STC-1組。根據(jù)LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)，將100 μl質(zhì)粒終濃度為100 nmol/L的LipofectamineTM2000混合溶液加入各組BGC-823細(xì)胞。對(duì)照組僅加入LipofectamineTM2000溶液。轉(zhuǎn)染4 h后更換培養(yǎng)基，24 h后通過(guò)qRT-PCR及Western blot檢測(cè)是否轉(zhuǎn)染成功。

1.3.2 在線(xiàn)生物數(shù)據(jù)庫(kù)分析 使用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析STC-1在正常胃組織和胃癌組織中的表達(dá)水平及對(duì)患者預(yù)后生存期的影響。

1.3.3 靶基因預(yù)測(cè)及雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) 使用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)TargetScanHuman預(yù)測(cè)miR-101-3p的相關(guān)靶基因，發(fā)現(xiàn)STC-1基因可能是miR-101-3p的靶基因。以STC-1質(zhì)粒為載體，分別構(gòu)建野生型3’UTR（STC-1 3’UTR-WT）和突變型3’UTR（STC-1 3’UTR-MUT）質(zhì)粒。將兩種質(zhì)粒分別與NC mimic、miR-101-3p mimic混合，通過(guò)LipofectamineTM2000分別共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞制備細(xì)胞裂解物，按試劑盒要求檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3.4 qRT-PCR檢測(cè)胃癌組織及細(xì)胞中miR-101-3p和STC-1 mRNA的表達(dá) 采用Trizol試劑從胃癌組織和細(xì)胞中提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并使用SYBR Green法進(jìn)行擴(kuò)增，U6作內(nèi)參。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃ 60 s，60℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCT公式計(jì)算miR-101-3p、STC-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。PCR引物序列：miR-101-3p-F：5’-ATGCAAGUCAAUAGUGUCAUG-3’，miR-101-3p-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。U6-F：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，U6-R：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。STC-1-F：5’-TTCTGGTGCTGGTGATCAGTG-3’，STC-1-R：5’-TTTGGGCACAGTGGTATGTCT-3’。GAPDH-F：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’，GAPDH-R：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC。

1.3.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將BGC-823細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞分組及培養(yǎng)條件同1.3.1。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后進(jìn)行胰酶消化，后接種于新6孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，當(dāng)細(xì)胞呈現(xiàn)單壁生長(zhǎng)時(shí)，使用200 μl移液器槍頭劃痕，PBS洗去脫落的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)液，顯微鏡下觀察并記錄劃痕寬度。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下再次觀察記錄劃痕寬度。細(xì)胞劃痕愈合率=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%，用細(xì)胞劃痕愈合率表示細(xì)胞遷移率。

1.3.6 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 在Transwell小室平板平鋪一層Matrigel基質(zhì)膠（約50 μl），并將無(wú)血清培養(yǎng)基中的各組單細(xì)胞懸液加至上室，在下室平鋪含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，PBS清洗后，甲醛固定，結(jié)晶紫染色后，顯微鏡下觀察并對(duì)穿膜細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)。

1.3.7 Matrigel體外成管實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的血管生成能力 96孔板每孔鋪50 μl Matrigel基質(zhì)膠，待Matrigel膠凝固，以每毫升1×104個(gè)的密度將各組BGC-823細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于倒置顯微鏡（100×）下觀察細(xì)胞血管生成情況并拍照。

1.3.8 Western blot法檢測(cè)STC-1、PI3K/p-PI3K、AKT/p-AKT、MMP-2、MMP-9、VEGF和Ang2的表達(dá) BGC-823細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液，離心所得的上清液即為蛋白樣品。用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度，蛋白定量變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白，電泳后迅速轉(zhuǎn)至PVDF膜上，放入含5%脫脂牛奶TBST溶液中室溫封閉2 h，分別加入對(duì)應(yīng)一抗STC-1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、MMP-2、MMP-9、VEGF、Ang2（濃度為1:2 000）4℃過(guò)夜。TBST洗滌3次后，加入二抗（濃度為1:10 000）室溫孵育2 h，最后避光下加入ECL顯色劑顯色，Bio-Rad凝膠成像儀記錄蛋白灰度并拍照，以GAPDH作為對(duì)照，對(duì)各組蛋白進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.3.9 裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)[8]將40只裸鼠隨機(jī)平均分為5組，在裸鼠右肩背部皮下分別注射0.2 ml 1×107/ml接種慢病毒的BGC-823細(xì)胞懸液：對(duì)照組（注射未處理的細(xì)胞）、miR-NC組（注射感染miR-NC慢病毒質(zhì)粒的細(xì)胞）、miR-101-3p組（注射感染miR-101-3p過(guò)表達(dá)慢病毒質(zhì)粒的細(xì)胞）、pcDNA-NC組（注射感染對(duì)照慢病毒質(zhì)粒的細(xì)胞）、STC-1組（注射感染STC-1過(guò)表達(dá)慢病毒質(zhì)粒的細(xì)胞）。正常飼養(yǎng)，觀察裸鼠皮下成瘤情況。第30天處死裸鼠，完整取出皮下腫瘤稱(chēng)重并測(cè)量體積。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中做到了減少、替代、優(yōu)化的3R原則，實(shí)驗(yàn)開(kāi)展前獲得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（IACUC-20180513）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-101-3p和STC-1在胃癌組織中的表達(dá)

胃癌組織中STC-1表達(dá)水平明顯高于正常組織，且STC-1高表達(dá)的患者生存期短（P＜0.05），見(jiàn)圖1。Western blot結(jié)果顯示，與正常胃組織（1.65±0.52）相比，胃癌組織中miR-101-3p mRNA的表達(dá)量（1.12±0.36）明顯降低（t=11.312,P=0.000），STC-1 mRNA的表達(dá)量明顯升高（0.94±0.28vs.3.47±1.05,t=32.260,P=0.000），且兩者呈負(fù)相關(guān)（r=－0.835,P＜0.001）。

圖1 STC-1在胃癌組織中的表達(dá)Figure 1 Expression of STC-1 in gastric cancer tissues

2.2 miR-101-3p表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理因素的關(guān)系

為了驗(yàn)證miR-101-3p在胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用，將80例患者按照miR-101-3p相對(duì)表達(dá)量分為低表達(dá)組（24例）、高表達(dá)組（56例）。結(jié)果顯示，miR-101-3p的表達(dá)水平與年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05），而與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性，見(jiàn)表1。

表1 miR-101-3p表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理因素的關(guān)系(n(%))Table 1 Relationship between the expression level of miR-101-3p and the clinicopathological factors of gastric cancer patients (n(%))

2.3 miR-101-3p靶向抑制STC-1

TargetScanHuman在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出STC-1作為miR-101-3p的靶基因，miR-101-3p與STC-1在3’UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖2A。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明miR-101-3p對(duì)野生型STC-1表達(dá)有明顯下調(diào)作用（t=46.965,P=0.000），而對(duì)突變型沒(méi)有明顯作用，說(shuō)明miR-101-3p直接靶向作用于野生型STC-1，見(jiàn)圖2B。同時(shí)，qRTPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組相比，miR-101-3p組miR-101-3p mRNA表達(dá)上調(diào)、STC-1 mRNA表達(dá)量下調(diào)（t=55.213,P=0.000;t=8.392,P=0.000）；與pcDNA-NC組相比，STC-1組中miR-101-3p mRNA表達(dá)下調(diào)，STC-1 mRNA表達(dá)量上調(diào)（t=6.889,P=0.002;t=49.263,P=0.000）；與miR-101-3p+pcDNA-NC組相比，miR-101-3p+STC-1組中miR-101-3p mRNA表達(dá)下調(diào)，STC-1 mRNA水平上調(diào)（t=41.256,P=0.000;t=14.781,P=0.000），說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-101-3p靶向抑制了STC-1的表達(dá)，見(jiàn)圖2C～D。

圖2 miR-101-3p靶向作用STC-1Figure 2 miR-101-3p targets STC-1

2.4 miR-101-3p過(guò)表達(dá)靶向調(diào)控STC-1抑制胃癌細(xì)胞BGC-823的侵襲轉(zhuǎn)移

與miR-NC組相比，miR-101-3p組劃痕變寬，愈合率降低，細(xì)胞侵襲數(shù)減少，MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)降低（t=9.535,P=0.000;t=8.947,P=0.000）；與pcDNA-NC組相比，STC-1組劃痕變窄，愈合率提高，細(xì)胞侵襲數(shù)增多，MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)升高（t=65.327,P=0.000;t=57.630,P=0.000）；與miR-101-3p+pcDNA-NC組相比，miR-101-3p+STC-1組劃痕變窄，愈合率提高，細(xì)胞侵襲數(shù)增多，MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)升高（t=10.026,P=0.000;t=11.233,P=0.000），見(jiàn)圖3。說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-101-3p靶向STC-1抑制胃癌細(xì)胞BGC-823的侵襲轉(zhuǎn)移。

圖3 miR-101-3p過(guò)表達(dá)靶向調(diào)控STC-1對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823侵襲轉(zhuǎn)移的影響Figure 3 Effect of miR-101-3p overexpression and targeted regulation of STC-1 on the invasion and metastasis of gastric cancer cell line BGC-823

2.5 miR-101-3p過(guò)表達(dá)靶向調(diào)控STC-1抑制胃癌細(xì)胞BGC-823的血管生成

與miR-NC組相比，miR-101-3p組管腔結(jié)構(gòu)明顯減少，VEGF、Ang2表達(dá)下調(diào)（t=7.535,P=0.000;t=9.667,P=0.000）；與pcDNA-NC組相比，STC-1組基本形成了完整的閉合管腔結(jié)構(gòu)，環(huán)形結(jié)構(gòu)組成了蜂窩狀，VEGF、Ang2表達(dá)上調(diào)（t=31.205,P=0.000;t=28.569,P=0.000）；與miR-101-3p+pcDNA-NC組相比，miR-101-3p+STC-1組管腔結(jié)構(gòu)明顯增加，VEGF、Ang2表達(dá)上調(diào)（t=7.895,P=0.000;t=10.214,P=0.000），見(jiàn)圖4。說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-101-3p靶向STC-1能抑制胃癌細(xì)胞BGC-823的血管生成。

圖4 miR-101-3p過(guò)表達(dá)靶向調(diào)控STC-1對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823血管生成的影響Figure 4 Effect of miR-101-3p overexpression and targeted regulation of STC-1 on the angiogenesis of gastric cancer cell line BGC-823

2.6 miR-101-3p過(guò)表達(dá)靶向調(diào)控STC-1抑制胃癌細(xì)胞BGC-823 PI3K/AKT信號(hào)通路

與miR-NC組相比，miR-101-3p組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT表達(dá)下調(diào)（t=12.010,P=0.000;t=14.630,P=0.000）；與pcDNA-NC組相比，STC-1組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT表達(dá)上調(diào)（t=28.539,P=0.000;t=29.077,P=0.000）；與miR-101-3p+pcDNA-NC組相比，miR-101-3p+STC-1組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT表達(dá)上調(diào)（t=11.096,P=0.000;t=12.127,P=0.000），見(jiàn)圖5。說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-101-3p調(diào)控STC-1抑制胃癌細(xì)胞BGC-823 PI3K/AKT信號(hào)通路。

圖5 miR-101-3p過(guò)表達(dá)靶向調(diào)控STC-1對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823 PI3K/AKT信號(hào)通路的影響Figure 5 Effect of miR-101-3p overexpression and targeted regulation of STC-1 on the PI3K/AKT signaling pathway in gastric cancer cell line BGC-823

2.7 miR-101-3p過(guò)表達(dá)抑制裸鼠體內(nèi)移植瘤生長(zhǎng)

與miR-NC組相比，miR-101-3p組腫瘤體積、質(zhì)量下降（t=7.329,P=0.000;t=6.329,P=0.002）；與pcDNA-NC組相比，STC-1組腫瘤體積、質(zhì)量增加（t=22.541,P=0.000;t=25.794,P=0.000），見(jiàn)圖6。說(shuō)明miR-101-3p抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖6 miR-101-3p過(guò)表達(dá)對(duì)裸鼠體內(nèi)移植瘤生長(zhǎng)的影響Figure 6 Effect of miR-101-3p overexpression on the growth of transplanted tumor in nude mice

3 討論

miRNAs作為致癌基因或抑癌基因，能夠調(diào)控腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和凋亡等進(jìn)程。其中miR-101-3p是miRNA101家族成員，為抑癌基因，可調(diào)控靶基因表達(dá)，參與多種腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成等生物學(xué)行為。Wang等[9]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-101-3p可消除長(zhǎng)鏈非編碼RNA核仁小分子RNA宿主基因6，從而抑制膽管癌細(xì)胞增殖、遷移和血管生成。Lu等[10]發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-101-3p的表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，提示miR-101-3p高表達(dá)與胃癌進(jìn)展有關(guān)。Cao等[11]發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞中miR-101-3p通過(guò)抑制AMP依賴(lài)的蛋白激酶途徑抑制胃癌進(jìn)展，但miR-101-3p是否調(diào)控胃癌血管生成鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)miR-101-3p在胃癌組織及胃癌細(xì)胞BGC-823中低表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，過(guò)表達(dá)miR-101-3p可抑制BGC-823細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成，抑制體內(nèi)移植瘤的發(fā)展，提示miR-101-3p在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用。

STC-1參與組織和器官的生長(zhǎng)、分化和發(fā)育，在胃癌組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)，發(fā)揮促癌基因作用[12]。Arigami等[13]發(fā)現(xiàn)STC-1 mRNA在胃癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度和腫瘤分期顯著相關(guān)，可用于預(yù)測(cè)腫瘤侵襲性。He等[14]發(fā)現(xiàn)STC-1在體內(nèi)外均能促進(jìn)血管生成，其通過(guò)調(diào)控細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2促進(jìn)VEGF表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胃腫瘤生長(zhǎng)。本研究通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)胃癌組織中STC-1表達(dá)水平升高，且預(yù)后較差，同時(shí)發(fā)現(xiàn)STC-1在胃癌組織中的表達(dá)量上調(diào)，TargetScanHuman數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-101-3p與STC-1具有結(jié)合位點(diǎn)，且雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、qRT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)顯示miR-101-3p可靶向負(fù)調(diào)控STC-1。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，高表達(dá)STC-1可部分逆轉(zhuǎn)miR-101-3p對(duì)BGC-823細(xì)胞遷移、侵襲和血管生成的影響，說(shuō)明miR-101-3p和STC-1在胃癌中存在調(diào)控關(guān)系，miR-101-3p表達(dá)可能與胃癌進(jìn)展相關(guān)。

PI3K/AKT信號(hào)通路不僅調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，而且與腫瘤的血管新生、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15]。MMP在腫瘤細(xì)胞突破基底膜屏障而浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中起重要作用，MMP-2、MMP-9在許多腫瘤組織中呈高表達(dá)[16]。血管新生是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要條件，不僅原發(fā)腫瘤依賴(lài)于血管形成，而且其在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮重要作用[17]。在血管生成過(guò)程中，需要多種細(xì)胞因子共同調(diào)節(jié)。其中VEGF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有較強(qiáng)的親和作用，能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)機(jī)體血管形成。Ang2是一種新型的調(diào)節(jié)血管生成的蛋白，主要參與內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)定、血管及肌肉纖維化進(jìn)程，其過(guò)度表達(dá)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和血管化。Shu等[18]發(fā)現(xiàn)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶1（BCAT1）通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和血管生成。Wu等[19]發(fā)現(xiàn)芥花內(nèi)酯通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路降低MMP-2、MMP-9活性，進(jìn)一步抑制了胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移。Mahfouz等[20]發(fā)現(xiàn)端粒酶抑制劑BIBR-1232和貝伐單抗通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR通路降低胃癌細(xì)胞VEGF的表達(dá)和分泌，從而減輕胃癌細(xì)胞血管生成能力。本研究中過(guò)表達(dá)miR-101-3p后MMP-2、MMP-9、VEGF、Ang2、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT表達(dá)降低，而過(guò)表達(dá)STC-1可逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)。說(shuō)明miR-101-3p和STC-1通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成，由此我們推斷過(guò)表達(dá)miR-101-3p靶向STC-1基因能夠抑制癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成，其機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)，見(jiàn)圖7。

圖7 miR-101-3p靶向STC-1基因影響胃癌細(xì)胞惡性表型的作用機(jī)制Figure 7 Mechanism of miR-101-3p targeting the STC-1 gene to affect the malignant phenotype of gastric cancer cells

綜上所述，miR-101-3p在胃癌中表達(dá)下調(diào)，能夠靶向STC-1調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞BGC-823的侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成及體內(nèi)移植瘤的發(fā)展。本研究從microRNA的角度探討了miR-101-3p在胃癌發(fā)展中的作用機(jī)制，從而為胃癌的靶向治療提供參考依據(jù)。但是miR-101-3p和STC-1能否作為臨床有效的預(yù)測(cè)和治療靶標(biāo)應(yīng)用于胃癌患者治療有待進(jìn)一步研究，今后還將從可變剪切等其他作用機(jī)制進(jìn)一步探索非編碼RNA對(duì)胃癌發(fā)生與進(jìn)展的調(diào)控，為胃癌的基因與靶向治療提供新思路。