王宗勝，王輝

（1.贛南醫(yī)學(xué)院2020級(jí)碩士研究生；2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科，江西 贛州 341000）

白內(nèi)障是全球首位致盲性眼病，占盲因構(gòu)成的51%［1］，目前藥物對(duì)白內(nèi)障的治療效果欠佳?，F(xiàn)階段，白內(nèi)障摘除伴人工晶體植入術(shù)是治療白內(nèi)障的唯一有效措施。然而，人工晶體屬于假體材料，在植入人體后可能會(huì)引起慢性刺激，從而導(dǎo)致術(shù)后并發(fā)癥，盡管現(xiàn)在已有雙焦、多焦人工晶體的上市，但其仍不具備正常晶狀體所具有的靈敏且精確的生理調(diào)節(jié)能力，甚至部分患者術(shù)后發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重影響視覺(jué)質(zhì)量［2］。所以尋找更理想的晶狀體替代物為晶狀體的再生研究提供了原動(dòng)力。近年來(lái)由于再生醫(yī)學(xué)的迅猛發(fā)展，人們把目光也放在了再生醫(yī)學(xué)上，已有大量研究顯示，干細(xì)胞能夠成功分化為某些特定類(lèi)型的眼組織［3］。如果可以誘導(dǎo)晶狀體再生類(lèi)晶狀體，不僅可以避免人工晶狀體的諸多弊端，還可以通過(guò)建立多種模型，探究晶狀體疾病的發(fā)生機(jī)制和防治措施。

1 晶狀體再生

1.1 晶狀體再生研究的歷史1880年，Phillipeaux證實(shí)了蠑螈眼睛的再生能力，觀察到眼睛的一部分必須保留才能再生。1891年，Colucci描述了蠑螈即使在成年階段摘除后也能再生晶狀體的能力。1895年，Wolff發(fā)表了他的研究，描述了這種晶狀體再生的機(jī)制，虹膜色素上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成一個(gè)新的晶狀體，這一過(guò)程因此得名：Wolffian再生。在20世紀(jì)30年代，佐藤忠男研究了蠑螈的Wolffian再生，發(fā)現(xiàn)只有背側(cè)虹膜色素上皮（IPE）產(chǎn)生新的晶狀體，而腹側(cè)虹膜在正常條件下卻不能產(chǎn)生新的晶狀體［4］。1940年，耶魯大學(xué)的Stone和Sapir發(fā)現(xiàn)Wolffian再生背后的機(jī)制依賴(lài)于IPE的轉(zhuǎn)分化，這意味著IPE細(xì)胞去分化，失去色素沉著，然后再分化成另一種類(lèi)型細(xì)胞，即初級(jí)晶狀體纖維細(xì)胞。而在2005年，GREENFELD H等［5］已經(jīng)能夠從腹側(cè)IPE誘導(dǎo)晶狀體再生。

1.2 晶狀體的發(fā)育過(guò)程在眼球的發(fā)育過(guò)程中，晶狀體的發(fā)育過(guò)程包括兩個(gè)階段，即晶狀體泡產(chǎn)生期和晶狀體纖維產(chǎn)生期。在原始視泡時(shí)期，視泡由前腦長(zhǎng)出并逐漸與表面外胚葉接觸，導(dǎo)致表面外胚層的細(xì)胞分裂加快，上皮層逐漸變薄，形成晶狀體板（Lensplate），晶狀體板逐漸內(nèi)陷成凹，即晶狀體凹（Lenspit）。凹陷逐漸加深，當(dāng)胚胎達(dá)到7 mm時(shí)，僅借一個(gè)細(xì)莖與表面外胚葉相連接，此時(shí)晶狀體凹幾乎填滿(mǎn)整個(gè)視杯。當(dāng)胚胎達(dá)9 mm時(shí)，細(xì)莖消失，形成晶狀體泡（Lensvesicle），與表面外胚葉完全分離。晶狀體泡脫離表面外胚葉時(shí)，立刻開(kāi)始分化。前囊下的上皮細(xì)胞層由前壁細(xì)胞分化而成，而后壁細(xì)胞則逐漸變長(zhǎng)向前生長(zhǎng)。胚胎發(fā)育至第7周時(shí)，由后壁細(xì)胞形成的晶狀體原始纖維逐漸充滿(mǎn)泡腔，構(gòu)成晶狀體胚胎核。赤道部前的晶狀體上皮細(xì)胞（Lens epithelial cell，LEC）一直具有有絲分裂潛力，在胚胎發(fā)育至第7周以后，第二晶狀體纖維以晶狀體核為中心，并向前后生長(zhǎng)。新產(chǎn)生的纖維一直以同種方式生長(zhǎng)，原先的纖維逐漸成熟，不再具有細(xì)胞核和細(xì)胞器，并被擠向中央，此過(guò)程終生進(jìn)行。各層纖維末端彼此聯(lián)合形成晶狀體縫，核前的縫為“Y”型，核后的為“人”型。

2 干細(xì)胞及其在晶狀體再生中的應(yīng)用

2.1 干細(xì)胞的定義干細(xì)胞是一類(lèi)具有多向分化潛能及自我更新能力的細(xì)胞，與損傷組織的再生修復(fù)密切相關(guān)，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有舉足輕重的價(jià)值［6］。哺乳動(dòng)物的干細(xì)胞按照其來(lái)源可分為兩大類(lèi)，即外源性干細(xì)胞和內(nèi)源性干細(xì)胞。來(lái)自于人體不同階段、不同組織的干細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外操作后再次移植入人體均可視為外源性干細(xì)胞，而內(nèi)源性干細(xì)胞是處于未分化的細(xì)胞，其分布于本體某特定組織或器官內(nèi)，其具有自我更新的能力，并且能夠分化成該組織的主要細(xì)胞類(lèi)型。除此類(lèi)分類(lèi)方法外，現(xiàn)階段主要根據(jù)干細(xì)胞的分化潛能（全能干細(xì)胞、亞全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、專(zhuān)能干細(xì)胞）和發(fā)育階段（胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、生殖嵴干細(xì)胞等）來(lái)進(jìn)行劃分。

2.2 干細(xì)胞在眼科中的應(yīng)用由于再生醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，干細(xì)胞在各種臨床疾病的治療中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，在眼科學(xué)中的應(yīng)用和研究日漸增長(zhǎng)。目前利用干細(xì)胞治療眼病主要有3個(gè)策略：⑴刺激內(nèi)源性細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)；⑵從胚胎或成體眼中獲得細(xì)胞進(jìn)行移植或獲得干細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外擴(kuò)增后再進(jìn)行移植；⑶通過(guò)誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為眼組織細(xì)胞后進(jìn)行移植，此項(xiàng)策略在治療視網(wǎng)膜疾病時(shí)嘗試較多［7］。

2.3 干細(xì)胞在晶狀體再生中的應(yīng)用Wolff在100年前觀察到成年蠑螈的晶狀體在損傷后，背側(cè)虹膜的色素上皮可以通過(guò)去分化、去色素化重新進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)，長(zhǎng)出透明的晶狀體。晶狀體再生的現(xiàn)象不僅發(fā)生在兩棲動(dòng)物蠑螈上，還存在于雞、青蛙、魚(yú)等動(dòng)物中。人類(lèi)作為高級(jí)哺乳動(dòng)物，晶狀體再生的有力證據(jù)即是白內(nèi)障術(shù)后所引起的后發(fā)性白內(nèi)障，這就可以有力地說(shuō)明晶狀體囊上存在一類(lèi)能夠再生晶體纖維的細(xì)胞，即晶狀體上皮細(xì)胞。

干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新和多向分化能力的細(xì)胞，在通常情況下干細(xì)胞在體內(nèi)代謝緩慢、保持未分化特性，并表達(dá)特異性標(biāo)記物［8］。5-溴尿嘧啶-2-脫氧核苷（Bromodeoxyuridine，BrdU），是一類(lèi)胸腺嘧啶核苷酸類(lèi)似物，可在S期通過(guò)與胸腺嘧啶競(jìng)爭(zhēng)摻入細(xì)胞核苷酸序列而整合到DNA中，其在細(xì)胞內(nèi)的含量隨著細(xì)胞分裂逐漸降低。在干細(xì)胞這類(lèi)代謝緩慢的細(xì)胞中，BrdU可以在細(xì)胞內(nèi)存留較長(zhǎng)的時(shí)間，這種細(xì)胞即是標(biāo)記滯留細(xì)胞（Label-retainingcells，LRCs）。慢周期性是干細(xì)胞最顯著特征之一，標(biāo)記滯留細(xì)胞實(shí)驗(yàn)常用于鑒定組織內(nèi)細(xì)胞［9］。

LIN H T等［10］為了評(píng)估晶狀體上皮細(xì)胞的再生能力，使用BrdU標(biāo)記識(shí)別人類(lèi)供者晶狀體上皮細(xì)胞的增殖。該團(tuán)隊(duì)量化了8個(gè)月大、30歲及40歲供體中的BrdU+和LEC，發(fā)現(xiàn)增殖細(xì)胞的數(shù)量隨著年齡的增長(zhǎng)而減少。然而，在手術(shù)切除整個(gè)晶狀體內(nèi)容物并保留空囊袋支架中，BrdU+細(xì)胞的數(shù)量增加了11倍，表明人類(lèi)LEC在損傷后具有強(qiáng)大的再生能力。

目前大量研究均表明，晶狀體發(fā)育過(guò)程與多種生長(zhǎng)因子和信號(hào)通路息息相關(guān)，大多數(shù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)包括骨受體蛋白（Bone receptor protein，BMP）、FGF、Notch、TGF-β、Wnt等，已經(jīng)被證實(shí)能夠調(diào)控晶狀體形成的不同階段［11］。此外，晶狀體的起源前基板區(qū)域在雞和斑馬魚(yú)的模型中都顯示分化過(guò)程的平起階段需要神經(jīng)外胚層的形成和其后續(xù)產(chǎn)物前基板外胚層［12］。

在細(xì)胞培養(yǎng)下神經(jīng)外胚層的形成能夠通過(guò)一系列生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)形成，如BMP抑制劑Noggin、Follistatin、Cerberus、Chordin等。目前發(fā)現(xiàn)Noggin是由上皮層MyoD陽(yáng)性的細(xì)胞亞群產(chǎn)生；而這些細(xì)胞亞群免疫介導(dǎo)切除干擾晶狀體和視杯的形成。BMP信號(hào)不僅扮演了晶狀體形成的角色，更參與了晶狀體纖維細(xì)胞分化。BMP2，4和BMP7是誘導(dǎo)晶狀體纖維分化的標(biāo)志物［13］。FGF信號(hào)被認(rèn)為是一個(gè)晶狀體纖維細(xì)胞分化的促發(fā)子，并且FGF信號(hào)自分泌和旁分泌提供了晶狀體基板細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)。Wnt信號(hào)通過(guò)β-連環(huán)蛋白和平坦細(xì)胞極性非常規(guī)Wnt信號(hào)在晶狀體行程中扮演了重要的角色［14］。Wnt/PCP信號(hào)是晶狀體纖維細(xì)胞骨架組織所必需的。晶狀體發(fā)育相關(guān)研究表明，激活的BMP和FGF信號(hào)通路是晶狀體細(xì)胞形成所必需［15］。FGF信號(hào)是誘導(dǎo)晶狀體纖維細(xì)胞分化所必需的，且這個(gè)過(guò)程的調(diào)控需要Notch、Wnt/β-連環(huán)蛋白和Wnt/PCP信號(hào)通路提供額外的工具來(lái)調(diào)控胚胎干細(xì)胞向晶狀體發(fā)育的過(guò)程［15］。

YANG C B等［16］通過(guò)誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為晶狀體前體細(xì)胞，并在一定的條件下觸發(fā)LBs的形成。為此，該團(tuán)隊(duì)通過(guò)連續(xù)抑制和激活FGF、TGF-β及Wnt信號(hào)通路，開(kāi)發(fā)了一個(gè)三階段程序。首先需要誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞優(yōu)先分化為外胚層衍生物，在N2/B27培養(yǎng)基中使用100 ng·mL-1的Noggin顯著增加了神經(jīng)外胚層標(biāo)記物Pax6的表達(dá)。其次，細(xì)胞在第6天顯著增加Sox2和Six3的表達(dá)。最后就是確定這些晶狀體干細(xì)胞是否能進(jìn)一步分化成三維結(jié)構(gòu)，即LBs。該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用BMP4、BMP7和Wnt-3a并不能促進(jìn)晶狀體小體的形成。相比之下，F(xiàn)GF單獨(dú)使用或與其他生長(zhǎng)因子聯(lián)合使用，可增強(qiáng)晶狀體小體的形成，由此可見(jiàn)，F(xiàn)GF信號(hào)對(duì)晶狀體的形成是必不可少的。在N2/B27培養(yǎng)基和Matrigel涂層培養(yǎng)皿中，LBs總產(chǎn)量的“最佳”方案是一個(gè)三步程序：⑴至第6天，使用100 ng·mL-1Noggin處理；⑵從第6天至第18天，100 ng·mL-1bFGF、20 ng·mL-1BMP4和20 ng·mL-1BMP7組合處理；⑶從第18天至第35天，100 ng·mL-1FGF2和20 ng·mL-1Wnt-3a組 合處理［17］。

2.4 晶狀體再生的影響因素晶狀體再生形態(tài)與多種因素相關(guān)，如年齡、撕囊口的大小等。晶狀體再生能力會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸降低。除此之外，晶狀體再生也受撕囊口的大小、位置及封閉情況等影響。在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，前囊膜撕囊口的愈合情況與撕囊口的大小相關(guān)，撕囊口越小，愈合越快［10］。而前囊膜撕囊口愈合越快，越可防止前后囊膜形成粘連，前囊膜撕囊口盡早封閉，也會(huì)為晶狀體再生創(chuàng)造封閉微環(huán)境。

目前，通過(guò)改良撕囊口的方式，盡早實(shí)現(xiàn)撕囊口的愈合，從而盡早優(yōu)化晶狀體再生微環(huán)境，在此基礎(chǔ)上可以獲得具有一定功能性的再生晶狀體。但仍有大量問(wèn)題亟待解決，如其長(zhǎng)期透明性、年齡因素、撕囊口修復(fù)等問(wèn)題。

2.5 晶狀體再生最新進(jìn)展在之前研究學(xué)者三步法程序分化的基礎(chǔ)上，F(xiàn)U Q L等［18］提出一種新的“煎蛋”優(yōu)化方案，因?yàn)樵谥鸩椒只^(guò)程中，形成具有煎蛋外觀的細(xì)胞簇是一個(gè)獨(dú)特的特征，以從人尿細(xì)胞衍生的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cells，IPSC）生成LBs。通過(guò)在分化的早期階段分離晶狀體干細(xì)胞并操縱微環(huán)境，將人類(lèi)誘導(dǎo)的IPSC分化為L(zhǎng)Bs，微環(huán)境在特定時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)“煎蛋”形態(tài)。該研究結(jié)果表明，來(lái)源于尿細(xì)胞的IPSC能夠在體外分化為具有人類(lèi)晶狀體樣透明結(jié)構(gòu)、表達(dá)晶狀體特異性標(biāo)記物并具有基本光學(xué)特性的LBs。第一，在mTesR培養(yǎng)基中接種約80個(gè)PSC菌落，每個(gè)菌落約20個(gè)細(xì)胞，并在Matrigel涂層35 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。電鍍4 h后，通過(guò)100 ng·mL-1BMP抑制劑Noggin觸發(fā)PSC，并誘導(dǎo)其分化為神經(jīng)外胚層，直到D6上的菌落邊緣首次出現(xiàn)上皮樣細(xì)胞。第二，機(jī)械分離約50個(gè)分化的PSC和周?chē)纳掀蛹?xì)胞，并選擇30～50個(gè)分化的PSC菌落，并將其重新接種在涂有Matrigel的35 mm培養(yǎng)皿中。BMP信號(hào)通過(guò)其激動(dòng)劑BMP4和BMP7（20 ng·mL-1）重新激活。同時(shí)通過(guò)bFGF（100 ng·mL-1）激活成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子信號(hào)。第三，在D11上觀察到具有“煎蛋”結(jié)構(gòu)的細(xì)胞簇；無(wú)“煎蛋”形態(tài)的細(xì)胞簇被機(jī)械地丟棄，以避免在以下分化過(guò)程中產(chǎn)生任何負(fù)面影響。第四，在D15，BMP4和BMP7被Wnt3a（20 ng·mL-1）取代，以激活Wnt信號(hào)，并觸發(fā)晶狀體上皮細(xì)胞向晶狀體纖維細(xì)胞分化。第五，在D25上獲得了具有透鏡狀形態(tài)和透明結(jié)構(gòu)的成熟LBs。使用這種方案生成的LBs不僅在每個(gè)分化階段表達(dá)各種人類(lèi)晶狀體特異性標(biāo)記，而且還表現(xiàn)出類(lèi)似晶狀體的結(jié)構(gòu)和光學(xué)特性，在很大程度上類(lèi)似于人類(lèi)晶狀體發(fā)育過(guò)程中在形態(tài)學(xué)、分子和結(jié)構(gòu)方面所看到的。并且通過(guò)這種方案從人類(lèi)IPSC和小鼠晶狀體上皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞中獲得的晶狀小體的轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜高度重疊［19］。此外，這些研究在iPSC衍生的晶狀小體中觀察到緊密排列的晶狀體上皮細(xì)胞和分化的纖維樣細(xì)胞，其顯示出與晶狀體相似的超微結(jié)構(gòu)。

另外，BI X等［20］在該方面也獲得較大進(jìn)展，該團(tuán)隊(duì)對(duì)42只健康雌性SD大鼠進(jìn)行了晶狀體囊外摘除。在術(shù)后3、7、14、21、30、60和90天進(jìn)行裂隙燈觀察，并在術(shù)后30、60、90天通過(guò)頸脫位人工處死大鼠以移除眼球，研究員進(jìn)行了Sirt1、p53、α-滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和纖維連接蛋白（fn）的半定量免疫熒光分析，以及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)晶狀體和后囊中的miRNA-34a、Sirt1和p53含量。盡管晶狀體和后囊中miRNA-34a和p53的相對(duì)mRNA表達(dá)隨著時(shí)間的推移而降低，但Sirt1的表達(dá)增加。α-SMA在晶體中均勻表達(dá)并逐漸減少，而fn表達(dá)逐漸增加。所以在晶狀體再生過(guò)程中，miRNA-34a表達(dá)減少，Sirt1表達(dá)增加，p53表達(dá)降低，從而減少細(xì)胞凋亡。因此，該團(tuán)隊(duì)認(rèn)為Sirt1在該通路中起關(guān)鍵作用，并在晶狀體再生中起保護(hù)作用［20］。

除了在分子領(lǐng)域獲得較大突破外，在臨床中也獲得較大進(jìn)步。劉奕志［21］發(fā)現(xiàn)，在現(xiàn)階段白內(nèi)障手術(shù)中，會(huì)在晶狀體前囊膜撕囊，形成一個(gè)撕囊口，直徑約為6 mm。這種手術(shù)方式會(huì)導(dǎo)致大量晶狀體上皮細(xì)胞丟失，破壞晶狀體上皮細(xì)胞和囊袋的完整性，更為嚴(yán)重的還會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。因此，劉奕志團(tuán)隊(duì)首創(chuàng)了一種新的環(huán)形撕囊術(shù)，其撕囊口直徑約為1～1.5 mm，并且愈合較快，為晶狀體再生提供封閉的微環(huán)境；另外，撕囊口轉(zhuǎn)移至周邊．提高了視軸中心的透明度。隨后，該團(tuán)隊(duì)先在新西蘭兔驗(yàn)證了晶狀體再生能力，后采用該術(shù)式在1～3月齡食蟹猴內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。術(shù)后5個(gè)月，觀察到再生晶狀體形成，透明、雙凸?fàn)?，并且眼底結(jié)構(gòu)清晰。最后，對(duì)2歲以下白內(nèi)障患兒進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，觀察內(nèi)微創(chuàng)手術(shù)能否實(shí)現(xiàn)人晶狀體的再生。12例小兒白內(nèi)障患者通過(guò)內(nèi)微創(chuàng)手術(shù)獲得晶狀體再生，運(yùn)用動(dòng)態(tài)觀察如裂隙燈微鏡等記錄術(shù)后晶狀體再生的情況。術(shù)后8個(gè)月，再生晶狀體的平均中央厚度及屈光力明顯增加。目前，該團(tuán)隊(duì)的長(zhǎng)期療效及遠(yuǎn)期風(fēng)險(xiǎn)仍需等待進(jìn)一步研究。

3 發(fā)展與展望

晶狀體再生研究的一個(gè)最終目標(biāo)是在晶狀體損傷或白內(nèi)障手術(shù)中摘除后成功再生人類(lèi)晶狀體，最理想的結(jié)果是具有功能性、完整透明且具有前后囊膜的晶狀體，目前晶狀體再生的機(jī)制及晶狀體再生微環(huán)境的影響因素尚不明確，再生晶狀體的尺寸、形狀和透明度仍需優(yōu)化，如何提高晶狀小體分化狀態(tài)，形成成熟的晶狀小體及狹長(zhǎng)的晶狀小體去核細(xì)胞，還需進(jìn)行大量的基礎(chǔ)分子生物學(xué)研究。且仍需進(jìn)一步剖析晶狀體再生的各個(gè)流程，不斷優(yōu)化分化過(guò)程與步驟。由于缺乏合適的動(dòng)物模型和人類(lèi)原發(fā)性晶狀體培養(yǎng)的各種限制，人類(lèi)白內(nèi)障研究的系統(tǒng)方法受到阻礙。因此，一個(gè)有效的體外系統(tǒng)可引導(dǎo)細(xì)胞向人胚胎干細(xì)胞的祖細(xì)胞和成熟晶狀體細(xì)胞分化，有助于晶狀體發(fā)育和白內(nèi)障發(fā)生機(jī)制的研究。雖然能夠在小兒白內(nèi)障患者上通過(guò)改善白內(nèi)障手術(shù)方式和利用干細(xì)胞的分化功能獲得晶狀體再生，但仍需開(kāi)展更多的臨床試驗(yàn)評(píng)估其長(zhǎng)期療效。