孫偉毅 李思諾

（鹽城市東臺生態(tài)環(huán)境局，江蘇東臺 224200）

1 引言

近年來，隨著納米科技快速發(fā)展，納米材料在環(huán)境污染防治中的應(yīng)用潛力受到廣泛關(guān)注。當(dāng)前，國內(nèi)外對應(yīng)用零價nZVI、納米ZnO、納米TiO2等去除水體和污泥中的金屬離子，降解土壤有機(jī)污染物研究的報道甚多，對應(yīng)用納米材料修復(fù)土壤重金屬污染的研究起步較晚，當(dāng)前主要停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段［1］。

與nZVI 類似，SeNPs、硒硅溶膠具有比表面積大及反應(yīng)活性強(qiáng)等性質(zhì)，理論上能夠吸附并催化土壤重金屬離子還原反應(yīng)，降低重金屬離子的遷移、轉(zhuǎn)化及其生物有效性，削減重金屬離子毒性。本文在借鑒他人研究成果基礎(chǔ)上，合成穩(wěn)定的nZVI、SeNPs、硒硅溶膠，結(jié)合工業(yè)化石墨烯材料，探討納米材料進(jìn)入Cd 污染土壤后對Cd2+有效態(tài)變化的影響，同時分析蚯蚓相關(guān)生理生化指標(biāo)變化，以此評價土壤修復(fù)后的環(huán)境效應(yīng)和生態(tài)風(fēng)險［2］，為應(yīng)用納米材料修復(fù)土壤重金屬污染提供參考。

2 材料與方法

2.1 納米材料合成與表征

nZVI 的合成：取少量FeCl3溶于80%無水乙醇，加入0.5% CMC（m/V）和0.1 mL TEOS，通氮?dú)猓瑪嚢?5 min，滴加4 mL 5.17 mol/L Na4BH 溶液，攪拌1 h，定容至200 mL。TEM 檢測結(jié)果表明，nZVI 粒徑小于10 nm；用ICP－MS 測定其鐵濃度為1.5 mg/mL。

應(yīng)用載體/模板法制備SeNPs 反應(yīng)體系：2 mmol/L亞硒酸鈉、6 mmol/L 還原性谷胱甘肽、1.25 mg/mL 殼寡糖，40 ℃攪拌40 min，生成硒納米溶膠，定容至500 mL。TEM 檢測結(jié)果表明，SeNPs 粒徑為50～80 nm；用ICP－MS 測定其硒濃度為0.272 mg/mL。

硒硅溶膠合成：取250 mL 無水乙醇、10 mL 濃氨水、5 mL 去離子水，40 ℃攪拌3 h；緩慢加入0.15 g Na2SeO3、0.5 g 殼寡糖，40 ℃磁力攪拌30 min；加入50 mL 0.3%（m/V）GSH，攪拌20 min；加入5 mL TEOS，40 ℃磁力攪拌1 h，定容至500 mL，4 ℃保存。TEM 檢測結(jié)果表明，SeNPs 粒徑為40～50 nm；用ICP－MS 測定其硒濃度為0.125 mg/mL，硅濃度為0.937 mg/mL。

石墨烯為工業(yè)級多層石墨烯材料，TEM 檢測結(jié)果表明其為片層結(jié)構(gòu)。

2.2 復(fù)合污染土壤制備與蚯蚓暴露培養(yǎng)

對照組土壤僅噴灑CdCl2溶液，Cd 濃度3 mg/kg；分別取nZVI、SeNPs、硒硅溶膠3 mL，定容至300 mL，超聲處理后噴灑至3 mg/kg Cd 污染土壤，制備成nZVI＋Cd、SeNPs＋Cd、硒硅溶膠＋Cd 復(fù)合污染土壤。取0.125 g 石墨烯，溶于280 mL 去離子水，超聲3 h，定容至300 mL，噴灑至3 mg/kg Cd 污染土壤，制備石墨烯＋Cd 復(fù)合污染土壤。室內(nèi)老化15 d 置入蚯蚓，在21～23 ℃、65%相對濕度環(huán)境下暴露培養(yǎng)15 d，檢測蚯蚓生理生化指標(biāo)，用ICP－OES 測定土壤有效態(tài)Cd 變化。

2.3 土壤有效性Cd 濃度測定

取5.00 g 經(jīng)2 mm 篩的風(fēng)干土壤樣品，置入100 mL錐 形 瓶。加 入25.0 mL 10 mmol/L Na2EDTA 溶 液（pH＝8.0），室溫下以180 次/min 振蕩2 h；3 000 r/min條件下離心20 min，上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，用ICP－OES 測定Cd 濃度。

2.4 蚯蚓抗氧化酶與內(nèi)肽酶同工酶圖譜分析

蚯蚓清腸24 h 后，制備粗酶液，上清液－80 ℃保存?zhèn)溆?。可溶性蛋白含量采用Bradford 方法（考馬斯亮藍(lán)法）測定。

應(yīng) 用Bio－Rad Mini－PROTEAN 電 泳 系 統(tǒng) 和Native－PAGE 電泳系統(tǒng)分離同工酶，電泳緩沖液含25 mmol/L Tris，192 mmol/L 甘氨酸（pH＝8.3），4 ℃條件下電泳。SOD，CAT，APX，POD 同工酶電泳的分離膠10%，積層膠5%；CAT 分離膠6%，積層膠4%；分別應(yīng)用相應(yīng)顯色液顯色，數(shù)碼相機(jī)攝像。

內(nèi)肽酶（EP）同工酶試驗(yàn)，SDS－PAGE 電泳分離內(nèi)肽酶同工酶，8%分離膠，5%積層膠，4 ℃條件下電泳；電泳結(jié)束后，將凝膠浸沒0.1 mol/L 冰醋酸—醋酸鈉緩沖液（pH＝4.5），37 ℃恒溫水浴3 h，將凝膠移至250 mmol/L Tris－HCl（pH＝7.5），36 ℃恒溫孵育2 h，再將凝膠移至顯色液中，染色2 h，用40%甲醇（V/V）/10%冰乙酸（V/V）脫色，至藍(lán)色背景下白色帶型出現(xiàn)［3］。

2.5 蛋白酶活性測定

蛋白酶活性測定方案反應(yīng)體系：50 mmol/L Tris－HCl（pH＝7.5），0.08%（m/V）偶氮酪蛋白，適量粗酶液；37 ℃條件下分別孵育1，3 h，用10%（m/V）三氯乙酸（TCA）終止反應(yīng)，參照管首先添加TCA，再加入粗酶液。反應(yīng)結(jié)束后，4 000 g 條件下離心10 min，測定上清液OD366nm值，每毫克酶蛋白每分鐘升高0.01 作為1 個酶活力單位（U）。

2.6 蛋白羰基化產(chǎn)物免疫印跡

蛋白羰基化產(chǎn)物的免疫印跡，50 μL 粗酶液與50 μL10%（m/V）SDS，100 μL 20 mmol/L DNPH/20%（m/V）三氟乙酸（TFA）混合，空白組用100 μL 20%（m/V）TFA 替代20 mmol/L DNPH/20%（m/V）TFA。室溫下靜置30 min，依次加入100 mL 2 mol/L Tris（pH＝8.0）/30%（V/V）甘油/6%（V/V）β－疏基乙醇、50 μL 1%（m/V）溴酚藍(lán)，混勻后上樣，SDS－PAGE 電泳；半干轉(zhuǎn)印后，依次包被一抗和二抗；最后用Supersignal West Femoto Trial Kit 發(fā)光試劑盒顯色、X 光片曝光顯影，數(shù)碼相機(jī)拍攝［4］。

3 結(jié)果與分析

3.1 土壤有效態(tài)Cd 濃度變化

與對照組比較，nZVI、SeNPs、硒硅溶膠降低土壤Cd 有效性顯著；同時發(fā)現(xiàn)，工業(yè)化石墨烯對土壤Cd有效態(tài)未產(chǎn)生明顯影響，如圖1 所示（ck 為3 mg/kg Cd，a1，b1，c1，d1 分別為nZVI＋3 mg/kg Cd、SeNPs＋3 mg/kg Cd、硒硅溶膠＋3 mg/kg Cd、石墨烯＋3 mg/kg Cd 復(fù)合污染土壤；n＝3，p＜0.05）。

圖1 4 種納米材料對處理Cd 污染土壤有效態(tài)Cd 濃度的影響

3.2 抗氧化酶同工酶圖譜變化

考察4 種納米材料與Cd 復(fù)合污染土壤對蚯蚓蛋白氧化損傷的影響。4 種納米材料與土壤Cd 復(fù)合后，未改變蚯蚓體內(nèi)SOD，CAT，APX，POD 同工酶帶型數(shù)量，誘導(dǎo)了其酶活性變化。4 種納米材料適度提高了SOD，CAT 酶活性。nZVI，SeNPs 對APX 酶活性影響較小，硒硅復(fù)合溶膠、石墨烯提高APX 酶活性明顯。4 種納米材料與Cd 復(fù)合后均降低了POD 酶活性。

3.3 蛋白基化產(chǎn)物變化

免疫印跡結(jié)果表明，nZVI、硒硅溶膠、石墨烯誘導(dǎo)蚯蚓蛋白羰基化產(chǎn)物明顯升高。因此，以上3 種納米材料誘導(dǎo)了蚯蚓蛋白分子氧化損傷。

3.4 蚯蚓蛋白酶活性與內(nèi)肽酶同工酶變化

4 種納米材料與土壤Cd 復(fù)合后誘導(dǎo)蚯蚓體內(nèi)蛋白酶活性與內(nèi)肽酶同工酶活性升高；其中，nZVI、硒硅溶膠與石墨烯提高蛋白酶活性顯著，SeNPs 與Cd 復(fù)合后未誘導(dǎo)蚯蚓蛋白酶和內(nèi)肽酶同工酶明顯變化。此外，nZVI 和硒硅溶膠還誘導(dǎo)內(nèi)肽酶同工酶帶型數(shù)量增加。

4 討論

4.1 4 種納米材料修復(fù)土壤Cd 污染的環(huán)境效應(yīng)

納米顆粒進(jìn)入土壤后易團(tuán)聚，直接影響其在土壤中的遷移和傳遞，且在與土壤介質(zhì)和微生物相互作用過程中，其反應(yīng)活性受到干擾。以nZVI 為例，國內(nèi)外通常采用改性、負(fù)載、包覆、分散等措施提高其穩(wěn)定性和傳遞能力。采用CMC 負(fù)載nZVI，應(yīng)用硅包覆納米鐵顆粒、殼寡糖負(fù)載與包埋SeNPs 顆粒、殼寡糖負(fù)載硒硅溶膠。結(jié)合納米硅對SeNPs 掩蔽作用，提高了上述納米顆粒在土壤中的穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果表明，nZVI、SeNPs、硒硅溶膠降低土壤Cd 有效性顯著，工業(yè)化石墨烯對土壤有效態(tài)Cd 影響較小，可能與4種納米材料對Cd2＋的還原能力有關(guān)，其中，nZVI 對土壤Cd2＋還原能力最強(qiáng)，石墨烯最小。

4.2 4 種納米材料與Cd 復(fù)合對土壤生態(tài)安全的影響

與對照組相比，nZVI 與Cd 復(fù)合后誘導(dǎo)蚯蚓SOD 和CAT 酶活性明顯升高，同時，硒硅溶膠和石墨烯誘導(dǎo)APX 明顯升高，推測nZVI、硒硅溶膠或石墨烯可能誘導(dǎo)了蚯蚓體內(nèi)ROS 產(chǎn)生與積累，進(jìn)而誘導(dǎo)抗氧化酶同工酶活性升高，清除部分ROS 產(chǎn)物，緩解了復(fù)合污染引起的蚯蚓組織細(xì)胞氧化脅迫。當(dāng)ROS 大量產(chǎn)生而未及時清除時，ROS 攻擊蛋白分子中敏感基團(tuán)，誘導(dǎo)蛋白羰基化產(chǎn)物產(chǎn)生。氧化損傷蛋白若不及時降解，可能干擾細(xì)胞正常代謝功能，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

試驗(yàn)結(jié)果表明，4 種納米材料與土壤Cd 作用后，不同程度地誘導(dǎo)了蚯蚓組織蛋白分子氧化損傷，其中nZVI、硒硅溶膠和石墨烯明顯誘導(dǎo)了蚯蚓組織蛋白羰基化產(chǎn)物增加，尤其硒硅溶膠最明顯，其蛋白毒性最強(qiáng)。

5 結(jié)論

通過土壤有效態(tài)Cd 濃度與蚯蚓毒理學(xué)指標(biāo)的變化發(fā)現(xiàn)，nZVI 和硒硅溶膠雖能顯著降低土壤Cd有效性，但同時加劇了復(fù)合污染土壤對蚯蚓蛋白的損傷，表明2 種納米材料加入Cd 污染土壤后加劇了土壤蛋白毒性；SeNPs 既削減土壤Cd 離子有效性，又未明顯誘導(dǎo)蚯蚓組織細(xì)胞蛋白毒性。因此，SeNPs修復(fù)土壤Cd 污染的潛力高于其余3 種納米材料，具有修復(fù)Cd 污染土壤的應(yīng)用前景。