寇偉,年芳,蔣林樹,潘予琮,余詩強,梁婷
(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;2.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點實驗室,北京 102206)
近年來,植物提取物作為一類新型綠色的抗生素替代品成為研究的熱點,植物提取物中的黃酮、多糖、生物堿、有機酸等多種活性物質(zhì)[1],能夠?qū)游餀C體產(chǎn)生抗炎、抗氧化、提高飼料轉(zhuǎn)化率、改善免疫平衡、調(diào)節(jié)營養(yǎng)平衡等積極的生理功能[2]。其中,黃酮類是植物中含量相對較高,且結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定的一類營養(yǎng)活性物質(zhì),具有抗菌、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等生理功能[3]。
紫花苜蓿作為反芻動物優(yōu)質(zhì)的蛋白飼料,除常規(guī)營養(yǎng)成分外,優(yōu)質(zhì)苜蓿中總黃酮含量可達到10.351 mg/g[4],其主要的黃酮化合物可分為苷類、異黃酮類、異黃烷等[5]。有研究表明,奶牛干物質(zhì)采食量會隨著苜蓿黃酮添加量升高而升高,可以有效地提高奶牛機體抗氧化能力,減少瘤胃甲烷排放,且不會影響瘤胃發(fā)酵特性[6],抑制淋巴細胞凋亡,完善非特異性免疫[7],還能增加瘤胃細菌門和屬的數(shù)量,提高細菌的豐富度和多樣性[8]。因此,苜蓿黃酮在維持反芻動物機體健康及提高機體免疫有廣闊的應(yīng)用前景。臧清波[9]通過對233份苜蓿中黃酮類化合物進行了測定和評價,發(fā)現(xiàn)不同苜蓿之間黃酮類化合物存在顯著差異。因此本試驗采用體外產(chǎn)氣法研究不同品種苜??傸S酮對瘤胃體外發(fā)酵產(chǎn)氣量、發(fā)酵液的影響,揭示不同品種苜??傸S酮之間的差異,為后續(xù)作為奶牛飼料配方中添加劑的篩選提供理論參考。
苜蓿來源:6個品種苜蓿均來自正道生態(tài)集團小湯山種植基地。
發(fā)酵底物:選用北京市某奶牛場泌乳奶牛的TMR(精粗比為4∶6),將TMR烘干粉碎過40目篩,底物組成及營養(yǎng)水平如表1。
表1 TMR組成及營養(yǎng)水平(DM)Table 1 Composition and nutritional levels of TMR(DM)
瘤胃液采集:選取3頭體況相近、胎次和泌乳期相同荷斯坦奶牛,飼前2 h通過口腔采取其瘤胃液,裝入保溫瓶中,并迅速帶回實驗室用紗布(4層)過濾待用。
人工唾液:采用Menke[10]的方法進行配制,如下:先將蒸餾水(1 000 mL)倒入玻璃瓶中,然后依次加入微量元素溶液(0.25 mL)、碳酸鹽緩沖液(500 mL)、磷 酸 鹽 緩 沖 液(500 mL)、刃 天青(2.5 mL),搖勻加熱至39℃后,再次加入現(xiàn)配的還原液(100 mL),繼續(xù)混勻,并通入CO2、待溶液褪色或顏色變淺后,停止通入CO2,待用。
微生物培養(yǎng)液:將瘤胃液與人工唾液按1∶2的體積比混合,搖勻。
1.2.1 苜??傸S酮的提取參考潘予琮[4]的提取條件,采用乙醇超聲提取法,取1 g苜蓿粉末,加入30 mL 80%的乙醇溶液,超聲提取35 min,將提取液用真空冷凍干燥器進行濃縮干燥,制成固體備用。
1.2.2 體外發(fā)酵添加量的篩選依據(jù)實驗室前期研究,選取一種總黃酮提取率最高的苜蓿黃酮(WL363HQ)設(shè)置不同比例(0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.2%)來確定體外發(fā)酵最優(yōu)添加比例,分別將不同比例的苜蓿總黃酮添加到0.5 g TMR中,加入75 mL的微生物培養(yǎng)液,置于恒溫培養(yǎng)箱(39℃)中培養(yǎng)24 h,每組3個重復(fù)。
1.2.3 不同品種苜蓿對瘤胃體外發(fā)酵的影響分別將S1~S6 6種不同品種苜??傸S酮(WL298HQ、WL363HQ、WL366HQ、國 產(chǎn) 苜 蓿、WL440HQ、WL525HQ)按上述確定最優(yōu)比例添加至0.5 g TMR中,加入75 mL的微生物培養(yǎng)液,置于恒溫培養(yǎng)箱(39℃)中培養(yǎng)24 h,每組3個重復(fù)。
體外GP(產(chǎn)氣量):通過AGRS-Ⅱ微生物發(fā)酵微量產(chǎn)氣自動記錄儀記錄各時間點的GP。
產(chǎn)氣參數(shù)計算:根據(jù)McDonald[11]的產(chǎn)氣模型計算樣品在培養(yǎng)2、4、6、9、12、24 h時間點的動力參數(shù)。
pH的測定:通過METTLR TOLEDO pH儀進行測定。
氧化還原電位測定:通過METTLR TOLEDO氧化還原電位儀進行測定。
VFA的測定:取5 mL瘤胃發(fā)酵液于10 000×g離心10 min,然后取3 mL上清液并加入0.3 mL偏磷酸溶液(25%),搖勻后靜置30 min,在10 000×g離心10 min,取1.5 mL上清液置于測樣瓶中采用安捷倫7890B型號氣相色譜儀測定。
NH3-N的測定:取5 mL瘤胃發(fā)酵液于離心管中,通過12 000×g離心20 min后取上清液40 μL,加入苯酚顯色試劑2.5 mL,搖勻,再加入次氯酸鹽試劑2.0 mL,再次搖勻,水?。?7℃)30 min,于550 nm波長處測定吸光值,計算濃度。
通過Excel統(tǒng)計整理數(shù)據(jù)后,采用IBM SPSS 22.0軟件中ANOVA對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,采用Tukey法進行多重比較,P<0.05為差異顯著。
2.1.1 體外產(chǎn)氣參數(shù)及降解率由表2可知,在快速產(chǎn)氣部分a值中,苜??傸S酮添加比例為0.6 %時,顯著高于添加1.2%組(P<0.05),與其他組無顯著差異,在1.2%組時,快速產(chǎn)氣部分a值為負值,其余均為正值;在緩慢產(chǎn)氣速度常數(shù)c值中,添加1.2%組顯著高于其他組(P<0.05);在潛在產(chǎn)氣量(a+b)值中,0組、0.4 %組、0.6 %組、0.8 %組顯著高于1.2%組(P<0.05),其他組無顯著差異;在24 h時,0.4%、0.6%和0.8%組的產(chǎn)氣量顯著大于1%、1.2%組和對照組(P<0.05)。緩慢產(chǎn)氣部分b值和降解率無顯著差異(P>0.05)。
2.1.2 NH3-N、氧化還原電位及pH的測定如表3所示,在不同比例苜??傸S酮發(fā)酵后的瘤胃液中,試驗組中的NH3-N含量極顯著高于空白組(P<0.05),但試驗組中NH3-N含量沒有顯著差異。發(fā)酵后瘤胃液的氧化還原電位呈先上升后下降的趨勢,當(dāng)比例為0.8%組時,還原電位達到了最大值,為271 mV,其顯著高于1.2%、1%、0.4%、0.2%組和對照組的電位值(P<0.05),0.4%、1%、1.2%組還原電位值顯著高于0.2%和對照組(P<0.05)。底物發(fā)酵結(jié)束后,pH無顯著差異。
表3 不同比例苜??傸S酮瘤胃體外發(fā)酵對NH3-N、氧化還原電位及pH的影響Table 3 Effects of in vitro rumen fermentation of alfalfa flavonoids extracts with different gradients on NH3-N,redox potential and pH
2.1.3 VFA的測定如表4所示,瘤胃液中總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)和乙酸在比例為0.8%時,達到了最大值,分別為114.87 mmol/L和64.43 mmol/L。TVFA在0.8%組時,顯著大于0.2%、0.4%、1%、1.2%和對照組(P<0.05),0.4%組顯著大于對照組(P<0.05);乙酸在0.8%組時,顯著大于0.2%、0.4%、1%、1.2%和對照組(P<0.05),0.6%組時,顯著大于0.2%、1%、1.2%和對照組(P<0.05);乙丁酸在0.6%、0.8%組時,顯著大于其他試驗組和對照組(P<0.05)。試驗組發(fā)酵液中的丙酸、丁酸、異戊酸、戊酸和乙酸/丙酸均無顯著差異(P>0.05)。
表4 不同比例苜??傸S酮瘤胃體外發(fā)酵對VFA的影響Table 4 Effects of in vitro rumen fermentation of alfalfa flavone extracts with different gradient on VFA
以上試驗結(jié)果表明,苜??傸S酮最佳添加比例為0.8%DM。
2.2.1 產(chǎn)氣參數(shù)及降解率如表5所示,快速產(chǎn)氣部分a值均為負值,說明快速產(chǎn)氣部分存在產(chǎn)氣滯后、其余均為正值;在慢速產(chǎn)氣b中,S6顯著高于S2、S1、S4、S5和S0(P<0.05),S2、S3顯著高于S5、S4、S1和S0(P<0.05),最高值為63.82 mL;在緩慢產(chǎn)氣速度常數(shù)c中,S6顯著高于其他組(P<0.05),最大值為0.21;在潛在產(chǎn)氣量中,S6顯著高于S5、S4、S1和S0(P<0.05),S2、S3顯著高于S1、S0(P<0.05);24 h時的產(chǎn)氣量與降解率無顯著差異(P>0.05)。
表5 6種苜??傸S酮瘤胃體外發(fā)酵對體外產(chǎn)氣參數(shù)及降解率的影響Table 5 Effects of rumen in vitro fermentation of 6 kinds of alfalfa total flavonoids on dynamic gas production parameters and degradation rate
2.2.2 NH3-N、氧化還原電位及pH的測定如表6所示,不同發(fā)酵液中的NH3-N有明顯差異,對照組顯著高于S1、S3、S4、S5和S6組(P<0.05),S2、S6顯著高于S1、S3、S4和S5組(P<0.05)。氧化還原電位中的“+”表示氧化電位,“-”表示還原電位,S6、S5、S3組顯著高于S2、S1和對照組(P<0.05),S4、S1顯著高于S2、S0組(P<0.05)。不同發(fā)酵液中的pH之間無顯著差異(P>0.05)。
表6 6種苜??傸S酮瘤胃體外發(fā)酵對NH3-N、氧化還原電位及pH的影響Table 6 Effects of rumen fermentation of 6 kinds of alfalfa total flavones on NH3-N,REDOX potential and pH
2.2.3 VFA的測定如表7所示,S3組的發(fā)酵液中TVFA和乙酸濃度顯著高于其他組(P<0.05);S3組的發(fā)酵液中丙酸濃度顯著高于其他組(P<0.05);S0、S1、S2、S3組的發(fā)酵液中異丁酸濃度顯著高于其他組(P<0.05);S0、S1、S3組的發(fā)酵液中丁酸濃度顯著高于其他組(P<0.05);S0組的發(fā)酵液中異戊酸濃度顯著高于其他組(P<0.05);S1組的發(fā)酵液中戊酸濃度顯著高于其他組(P<0.05)。
表7 6種苜蓿總黃酮瘤胃體外發(fā)酵對VFA的影響Table 7 Effects of 6 alfalfa total flavonoids in rumen in vitro fermentation on VFA
體外產(chǎn)氣參數(shù)是體外發(fā)酵中一項綜合指標(biāo),在一定程度上能反映瘤胃對飼料利用的情況及瘤胃微生物的活動趨勢,一般來說,產(chǎn)氣量等越高瘤胃對飼料的利用率越高,表明瘤胃微生物活性越強[12]。本試驗中,不同比例苜??傸S酮對快速產(chǎn)氣部分a、緩慢產(chǎn)氣常數(shù)c、潛在產(chǎn)氣量(a+b)及24 h產(chǎn)氣量GP24都有顯著影響,整體表明,比例為0.4%、0.6%和0.8%時,可以顯著提高產(chǎn)氣量。因此,添加適量的苜??傸S酮可能會降低原蟲數(shù)量,使體外產(chǎn)氣量增加,提高了瘤胃對飼料的利用率。白齊昌[13]通過研究沙棘黃酮對綿羊體外產(chǎn)氣量、pH、VFA等影響,發(fā)現(xiàn)沙棘黃酮可以提高瘤胃體外發(fā)酵的產(chǎn)氣量,結(jié)果與本試驗相似。不同品種苜??傸S酮之間的瘤胃體外產(chǎn)氣量存在顯著差異,但快速產(chǎn)氣部分a值均為負值,說明在體外發(fā)酵前期存在著產(chǎn)氣滯后,可能是未將發(fā)酵瓶中的底物與發(fā)酵液混合均勻所造成,從緩慢產(chǎn)氣部分b和潛在產(chǎn)氣量(a+b)來看,添加苜??傸S酮有利于提高發(fā)酵時的產(chǎn)氣量,且在S6組時最高(b為63.82 mL,(a+b)為57.83 mL)。干物質(zhì)降解率可以反映微生物利用飼料的情況[14],是飼糧被機體利用程度的重要指標(biāo)[15]。在本試驗中,不同比例和不同品種苜蓿總黃酮對瘤胃體外發(fā)酵中的底物降解率沒有顯著差異。
NH3-N是反映瘤胃內(nèi)氮平衡及MCP合成的重要指標(biāo)[16]。飼料中的可降解蛋白和非蛋白氮通過部分瘤胃微生物的降解作用最終生產(chǎn)NH3-N,而NH3-N又可以通過瘤胃微生物的作用合成MCP。NH3-N的濃度受飼糧結(jié)構(gòu)和微生物的影響較大,當(dāng)MCP合成速率減慢時,NH3-N的濃度上升,抑制微生物的生長繁殖,造成氨中毒。有研究表明瘤胃NH3-N濃度的適宜范圍為6.58~36.7 mg/dL[17]。本試驗中,不同比例體外發(fā)酵液中的NH3-N含量顯示,試驗組顯著高于對照組且在正常范圍為之內(nèi),可能是因為苜蓿總黃銅促進了飼料中非蛋白氮的降解速率[18];不同品種苜??傸S酮對發(fā)酵液中的NH3-N有顯著的影響,對照組顯著高于其他試驗組,S2、S6顯著高于其他試驗組,說明S1、S3、S4和S5更有利于MCP的合成,提高瘤胃對日糧的利用率。
氧化還原電位常用于衡量瘤胃內(nèi)容物中氧化還原能力,其受飼糧類型、采食時間、飼料添加劑影響[19]。本試驗中,氧化還原電位均為負值,則為還原電位,隨著不同比例的增加,還原電位呈先上升后下降趨勢,在0.8%組時,達到最大值(-271 mV)且試驗組顯著高于對照組,說明苜蓿總黃酮具有提高還原電位作用,可能與黃酮類具有抗氧化作用有關(guān);在不同品種苜蓿總黃酮發(fā)酵液中,S3、S5、S6的還原電位顯著高于其他試驗組和對照組,則說明這三種苜蓿可能具有較好的抗氧化作用。
瘤胃內(nèi)pH是瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性的重要的指標(biāo)之一,受唾液、瘤胃液和飼糧結(jié)構(gòu)等影響[20],pH值過高或過低都會影響瘤胃微生物生存環(huán)境,從而影響動物的健康。在不同比例試驗中,試驗組和對照組之間pH沒有顯著差異,數(shù)值均在正常范圍內(nèi)。不同品種苜??傸S酮對發(fā)酵液pH無顯著影響,從整體來看,試驗組的pH高于對照組,說明添加苜蓿總黃酮會提高瘤胃液pH,有利于調(diào)節(jié)奶牛瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。
VFA是反芻動物瘤胃日糧中Cm(H2O)n和蛋白質(zhì)被降解的最終產(chǎn)物,為機體提供70%~80%的能量[21]。VFA不僅可以反映動物對飼料的利用情況,也具有調(diào)節(jié)胃腸激素分泌,促進腸道上皮細胞增殖和生長等作用[22]。在不同比例試驗中,TVFA、乙酸、丙酸等均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢,在0.8%組時,TVFA、乙酸、丙酸濃度均顯著大于其他試驗組和對照組,表明苜??傸S酮最適添加比例為0.8%;不同品種苜??傸S酮對發(fā)酵液中VFA有顯著影響,TVFA和乙酸濃度含量從大到小依次為S3>S1>S2>S4>S5>S0>S6,則S3效果較佳。有研究發(fā)現(xiàn),苜蓿中由黃酮、黃酮苷和黃酮醇組成的總黃酮具有強大的抗氧化活性[23],因此,不同品種苜??傸S酮中所含有的黃酮種類組合不同,可能會對瘤胃微生物造成不同的影響,進而造成發(fā)酵液中揮發(fā)酸濃度含量有顯著差異。在發(fā)酵液中,乙酸/丙酸均大于1.6,則說明發(fā)酵類型為乙酸發(fā)酵,乙酸是反芻動物脂肪合成的主要前體物質(zhì),是乳腺合成乳脂中脂肪酸的重要原料,乙酸轉(zhuǎn)化為乳脂的效率為67%~71%,因此乙酸含量升高利于乳脂率的提高[24]。栗明月等[25]添加竹葉總黃酮對奶牛瘤胃體外發(fā)酵研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵類型也為乙酸發(fā)酵類型,與本試驗結(jié)果相似。由此可見,添加適宜的苜??傸S酮可以提高瘤胃微生物對底物的消化利用。
1)通過不同濃度比例試驗研究表明,苜??傸S酮最佳添加濃度比例為0.8%DM;
2)通過不同品種苜蓿黃銅提取物試驗表明,S3品種苜蓿總黃酮效果更佳,為后續(xù)作為奶牛飼料配方中添加劑的篩選提供理論參考。