何 萍，王健強，高 潭，陳誠欣，徐雨婷，簡 閱，劉盼盼，張二豪

（西藏農(nóng)牧學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000）

西藏林芝市位于西藏東南部，雅魯藏布江中下游，平均海拔3 100 m，其獨特的高原氣候類型賦予了該地區(qū)晝夜溫差大、光照充足和紫外線強的特點，為果樹種植提供了得天獨厚的生長環(huán)境，因此，素有“西藏江南”和“水果之鄉(xiāng)”的美稱。

葡萄（Vitis viniferaL.）為葡萄科葡萄屬多年生木質(zhì)藤本植物，是栽培歷史悠久、栽培面積最大的水果之一[1]。目前，全球葡萄品種數(shù)量巨大，超過23 000種[2]，由于其富含維生素、蛋白質(zhì)、有機酸及礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分深受消費者的青睞[3-5]。在我國，葡萄主要用于鮮食，其次是釀酒和制干[5]，但從世界范圍來看，葡萄主要用于釀酒，其次是鮮食和制干[6]。隨著人們生活水平的提高和健康意識的增強，葡萄酒作為一種功能保健品深受廣大消費者的青睞。葡萄酒具有抗癌、降血糖、抗氧化及增強免疫力等功效[7]，但葡萄酒品質(zhì)受葡萄品種、釀造工藝、產(chǎn)地和表皮微生物等因素影響[8]。葡萄酒釀造的本質(zhì)是一系列微生物發(fā)酵和代謝的過程，其中酵母菌、乳酸菌、醋酸菌和霉菌在發(fā)酵過程中扮演著重要角色[9]，而這些微生物主要來源于葡萄表皮和發(fā)酵設(shè)備[10-11]。研究表明，在葡萄酒釀造過程中，葡萄果實表皮微生物葡糖桿菌屬（Gluconobacter）等能促進酯類物質(zhì)的合成，進而改善葡萄酒的品質(zhì)，乳酸菌屬（Lactobacillus）等則會產(chǎn)生異味，影響葡萄酒的感官[12]；本土釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）能夠顯著提升酒的風(fēng)味物質(zhì)[13]；增芳德葡萄表皮上的非釀酒酵母澤普林假絲酵母（Candida zemplinina）能增強葡萄酒的口感[14]。葡萄表皮微生物受產(chǎn)地、品種和環(huán)境等因素影響，張世偉等[15]研究表明，不同品種葡萄表皮微生物群落結(jié)構(gòu)組成存在明顯差異；趙昱等[16]研究表明，不同產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄表皮微生物存在一定的差異。綜上所述，葡萄表皮微生物在葡萄酒釀造過程中扮演著重要角色，且受產(chǎn)地、品種、氣候和環(huán)境等因素的影響。西藏林芝市具有獨特的地理位置和氣候類型，蘊藏著豐富的微生物資源，因此，探明林芝地區(qū)不同品種葡萄果實表皮微生物群落結(jié)構(gòu)組成，對篩選利用功能微生物具有重要意義。

本研究利用高通量測序技術(shù)對西藏林芝地區(qū)的‘夏黑’、‘火焰無核’、‘茉莉香’和‘玫瑰香’葡萄果實表皮微生物群落結(jié)構(gòu)組成進行分析，揭示不同品種葡萄果實表皮微生物多樣性，為葡萄種植管理和篩選利用本土優(yōu)質(zhì)的微生物資源提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品的采集與處理

2021年8月從西藏林芝市嘎瑪農(nóng)場（緯度29°24'44.74"N，經(jīng)度94°26'26.86"E）采集‘夏黑’（Summer Black）、‘火焰無核’（Flame Seedless）、‘茉莉香’（Jasmine）和‘玫瑰香’（Muscat Hamburg）共4個品種的葡萄果實樣品，編號分別為XH、BL、ML、MG。隨機選取10株生長一致的葡萄樹（10年生），用無菌剪刀分別采集每株葡萄樹上、中、下部位的成熟果實，并混合均勻，置于無菌袋中，每組3個重復(fù)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

稱50 g葡萄樣品，加入200 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）（pH7.0），200 r/min渦旋30 min，超聲處理20 min，經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾后，取出濾膜并剪碎置于無菌離心管中[16]，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

DNeasy Plant Mini Kit提取試劑盒：美國Qiagen公司；Taq脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（5.0 U/μL）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）（5 mmol/L）、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖、Qubit2.0 DNA檢測試劑盒：美國Invitrogen公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TD-GelX 1520凝膠成像系統(tǒng)、T100聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）儀：美國Bio-rad公司；WS600電泳儀：萬生博朗電子有限公司；NanoDrop2000微量分光光度計：美國Thermo公司；5424、5418R離心機：德國Eppendorf公司；IMS-20制冰機：上海精密儀器儀表有限公司；UPT-I-5T優(yōu)普系列超純水器：四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄果實樣品表皮宏基因組DNA的提取

利用DNeasy Plant Mini Kit提取試劑盒提取12個葡萄樣品果實表皮微生物總DNA，采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，采用NanoDrop2000微量分光光度計檢測DNA濃度和純度。

1.3.2 PCR擴增

利用細菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)通用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）和真菌內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internally transcribed spacer，ITS）通用引物ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS2R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）進行PCR擴增。PCR擴增體系（25 μL）：10×PCR Buffer 2.0 μL，TaqDNA聚合酶（5.0 U/μL）0.20 μL，正、反向引物各1μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTPs）（5 mmol/L）1 μL，DNA模板1 μL，雙蒸水（ddH2O）18.80 μL。PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35個循環(huán)；72℃再延伸10min，4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測和純化回收后委托上海派森諾科技股份有限公司進行測序。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理及分析

利用QIIME2（2019.4）軟件對Illumina MiSeq測序所得的原始序列進行去噪、拼接和質(zhì)控后，使用Vsearch（v2.13.4）軟件，在97%的相似度水平下對高質(zhì)量序列進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類；用Greengenes數(shù)據(jù)庫（Release 13.8，http：//greengenes.secondgenome.com/）和UNITE數(shù)據(jù)庫（Release 8.0，https：//unite.ut.ee/）分別對細菌和真菌進行物種分類學(xué)注釋；利用QIIME2（2019.4）軟件和R語言計算各樣本的Alpha多樣性和樣品間的Beta多樣性；利用R語言工具進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序結(jié)果分析

高通量測序結(jié)果見表1。由表1可知，4個葡萄品種果實表皮細菌菌群共產(chǎn)生1 570 843條有效序列，其中XH、BL、ML和MG樣品果實表皮分別獲得370 681、392 649、409 586和397 927條有效序列，平均序列堿基長度為407 bp。4個葡萄品種果實表皮真菌菌群共產(chǎn)生1 438 032條有效序列，其中XH、BL、ML和MG樣品表皮分別獲得338 757、387 540、329 897和381 838條有效序列，平均序列堿基長度為217 bp。葡萄果實表皮微生物測序覆蓋度在0.982 0～0.999 9之間，說明此次測序結(jié)果能真實反應(yīng)樣品表皮微生物的菌落結(jié)構(gòu)組成。

表1 不同品種葡萄樣品果實表皮微生物菌群高通量測序結(jié)果Table 1 Results of high throughput sequencing of microbial community on the different varieties of grape fruit surface

2.2 Alpha多樣性結(jié)果分析

Alpha多樣性指數(shù)包括Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)等，常用來反映樣品中微生物的豐富度和多樣性，Chao1指數(shù)表征豐富度，值越大表明群落的豐富度越高；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表征多樣性，Shannon指數(shù)值越大、Simpson指數(shù)越小表明群落多樣性越高[17]。不同品種葡萄樣品果實表皮微生物菌群的Alpha多樣性分析結(jié)果見圖1。由圖1可知，XH樣品果實表皮微生物豐富度和多樣性指數(shù)最高，其次是樣品ML，樣品BL最低。結(jié)果表明，不同品種葡萄果實表皮微生物多樣性和豐富度存在差異。

圖1 不同品種葡萄樣品果實表皮微生物群落alpha多樣性分析結(jié)果Fig.1 Analysis results of alpha diversity indexes of microbial community on the different varieties of grape fruit surface

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 不同葡萄品種果實表皮微生物菌群OTU分析

基于97%相似度的分類水平，4個葡萄品種果實表皮細菌菌群共注釋到705個OTUs，其中，XH、BL、ML和MG樣品所產(chǎn)生的OTUs數(shù)分別為266、110、184和145個；4個葡萄品種果實表皮真菌菌群共注釋到615個OTUs，其中，XH、BL、ML和MG樣品所產(chǎn)生的OTUs數(shù)分別為186、119、164和146個。不同品種葡萄果實表皮微生物所獲得OTUs數(shù)不同，XH樣品最多，BL樣品最少，說明不同品種葡萄果實表皮微生物群落結(jié)構(gòu)組成差異較大。通過韋恩圖能夠展示出不同樣品間共同擁有和特有的OTU數(shù)目，也直觀反映了不同樣品中OTU數(shù)目的差異性[18]。繪制不同葡萄品種果實表皮微生物菌群的OTU韋恩圖，結(jié)果見圖2。由圖2A可知，XH、BL、ML和MG樣品特有的細菌OTUs數(shù)分別為181、48、103和69個，共有的細菌OTUs數(shù)為32個，占總數(shù)的4.54%，說明不同品種葡萄果實表皮細菌群落結(jié)構(gòu)組成差異較大；由圖2B可知，XH、BL、ML和MG樣品特有的真菌OTUs數(shù)分別為114、54、112和82個，共有真菌OTUs數(shù)為19個，占總數(shù)3.08%，說明不同品種葡萄果實表皮真菌群落結(jié)構(gòu)組成差異較大。綜上，不同品種葡萄果實表皮微生物群落結(jié)構(gòu)組成差異較大。

圖2 不同品種葡萄樣品果實表皮細菌（A）和真菌（B）菌群OTU韋恩圖Fig.2 Venn diagrams of OTU of bacterial (A) and fungal (B)community on the surface of grape fruit of different varieties

2.3.2 不同葡萄品種果實表皮微生物種群歸類分析

微生物種群歸類分析結(jié)果見表2。由表2可知，XH樣品表皮細菌歸屬于15門、23綱、39目、50科和66屬；MG樣品表皮細菌歸屬于12門、18綱、33目、39科和49屬；BL樣品表皮細菌歸屬于10門、16綱、27目、31科和36屬；ML樣品表皮細菌歸屬于11門、16綱、32目、41科和49屬。XH樣品表皮真菌歸屬于5門、11綱、20目、27科和30屬；MG樣品表皮真菌歸屬于4門、11綱、17目、23科和27屬；BL樣品表皮真菌歸屬于4門、9綱、16目、19科和24屬；ML樣品表皮真菌歸屬于5門、11綱、18目、23科和29屬。葡萄果實表皮微生物在各分類等級上的數(shù)量各不相同，XH樣品果實表皮微生物在各分類等級上的數(shù)量最多，BL樣品果實表皮最少，且細菌多于真菌，說明不同品種葡萄果實表皮微生物多樣性存在差異。

表2 不同葡萄樣品果實表皮微生物菌群歸類分析結(jié)果Table 2 Classified analysis results of microbial community on the surface of grape fruit with different varieties

2.3.3 基于門分類水平不同品種葡萄樣品果實表皮微生物群落結(jié)構(gòu)組成

在門分類水平上，不同葡萄樣品果實表皮細菌及真菌群落結(jié)構(gòu)組成見圖3。

圖3 基于門分類水平不同品種葡萄樣品果實表皮細菌（A）及真菌（B）的群落結(jié)構(gòu)組成Fig.3 Composition of bacterial (A) and fungal (B) community on the grape surface of different varieties based on phylum level

由圖3A可知，XH樣品中的優(yōu)勢細菌門（相對豐度＞1%）為變形菌門（Proteobacteria）（62.26%）、放線菌門（Actinobacteria）（12.09%）、厚壁菌門（Firmicutes）（7.51%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（5.83%）、疣微菌門（Verrucomicrobia）（4.18%）、綠彎菌門（Chloroflexi）（1.87%）和髕骨細菌門（Patescibacteria）（1.38%）；MG樣品中的優(yōu)勢細菌門為變形菌門（Proteobacteria）（64.39%）、綠彎菌門（Chloroflexi）（21.50%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（4.20%）、厚壁菌門（Firmicutes）（2.53%）、放線菌門（Actinobacteria）（2.52%）和酸桿菌門（Acidobacteria）（1.36%）；BL樣品中的優(yōu)勢細菌門為變形菌門（Proteobacteria）（52.45%）、綠彎菌門（Chloroflexi）（33.06%）、厚壁菌門（Firmicutes）（3.21%）、放線菌門（Actinobacteria）（2.95%）、酸桿菌門（Acidobacteria）（2.45%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（1.75%）、髕骨細菌門（Patescibacteria）（1.49%）和浮霉菌門（Planctomycetes）（1.01%）；ML樣品中的優(yōu)勢細菌門為變形菌門（Proteobacteria）（75.93%）、綠彎菌門（Chloroflexi）（7.48%）、放線菌門（Actinobacteria）（3.53%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（3.40%）、厚壁菌門（Firmicutes）（3.34%）和酸桿菌門（Acidobacteria）（2.36%）。以上結(jié)果表明，不同樣品中的優(yōu)勢細菌門類型基本相同，但相對豐度差異較大。有研究表明，霞多麗葡萄和美樂葡萄果實表皮上的優(yōu)勢細菌門是變形菌門[19-20]；張世偉等[15]研究表明，不同品種葡萄表皮細菌主要分布在8個已知的門，如變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門、醋桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門和棲熱菌門（Thermi），其中變形菌門是優(yōu)勢細菌門。這與本研究結(jié)果一致，林芝地區(qū)不同品種葡萄果實表皮上的優(yōu)勢細菌門是變形菌門，但在主要細菌門類型上又存在差異，這可能與西藏特殊的氣候類型和葡萄品種等因素有關(guān)。

由圖3B可知，XH樣品的優(yōu)勢真菌門（相對豐度＞1%）為子囊菌門（Ascomycota）（86.04%）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）（8.64%）和油壺菌門（Olpidiomycota）（1.01%）；MG和BL樣品中的優(yōu)勢真菌門均為子囊菌門（Ascomycota），其相對豐度分別為99.23%和99.77%；ML樣品中的優(yōu)勢真菌門為子囊菌門（Ascomycota）（95.94%）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）（1.32%）。不同葡萄樣品果實中的主要優(yōu)勢真菌門均為子囊菌門。有研究表明，子囊菌門是葡萄表皮的優(yōu)勢菌門[15-16，21-22]，這與本研究結(jié)果一致。

2.3.4 基于屬分類水平不同葡萄樣品果實表皮微生物群落結(jié)構(gòu)組成

在屬分類水平上，不同葡萄樣品果實表皮細菌及真菌群落結(jié)構(gòu)組成見圖4。

由圖4A可知，XH樣品中的優(yōu)勢細菌屬（相對豐度＞1%）為伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）（8.69%）和慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）（7.26%）；伯克霍爾德氏菌屬（21.46%）和SJA-15（20.53%）是MG樣品中的優(yōu)勢細菌屬；SJA-15（32.35%）和伯克霍爾德氏菌屬（14.38%）是BL樣品中的優(yōu)勢細菌屬；ML樣品中的優(yōu)勢細菌屬為伯克霍爾德氏菌屬（21.52%）和SJA-15（5.52%）。研究表明，伯克霍爾德氏菌屬細菌能夠在污染土壤及水體中快速定植和生長，具有降解農(nóng)藥殘留的功效[23]，說明林芝地區(qū)葡萄種植地土壤可能存在污染和農(nóng)藥殘留。

圖4 基于屬水平不同品種葡萄樣品果實表皮細菌（A）及真菌（B）群落結(jié)構(gòu)組成Fig.4 Composition of bacterial (A) and fungal (B) community on the grape surface of different varieties based on genus level

由圖4B可知，球腔菌屬（Mycosphaerella）（52.93%）和曲霉屬（Aspergillus）（10.95%）為XH樣品中的優(yōu)勢真菌屬（相對豐度＞1%）；球腔菌屬（57.31%）和枝孢屬（Cladosporium）（9.39%）為MG樣品中的優(yōu)勢真菌屬；BL樣品中的優(yōu)勢真菌屬為球腔菌屬（82.99%）和枝孢屬（8.84%）；ML樣品中的優(yōu)勢真菌屬為球腔菌屬（43.91%）和枝頂孢屬（Acremonium）（33.85%）。張世偉等[15]研究表明，不同品種釀酒葡萄表皮真菌主要分布在9個屬，即鏈格孢菌屬（Alternaria）、鐮孢屬（Fusarium）、枝孢屬（Cladosporium）、耐冷酵母屬（Guehomyces）、孢霉屬（Mortierella）、莖點霉屬（Phoma）、黑附球菌屬（Epicoccum）、隱球菌屬（Cryptococcus）和漆斑霉屬（Myrothecium），這與本研究結(jié)果差異較大，可能與產(chǎn)地、氣候和品種等因素有關(guān)。有研究表明，球腔菌屬是多種農(nóng)林作物的致病菌，如甜瓜球腔菌能引起黃瓜蔓枯病[24]，落葉松葡萄座腔菌能引起落葉松的落針病[25]，香蕉黑條葉斑病菌能使香蕉致病[26]。不同品種葡萄果實表皮的主要優(yōu)勢真菌屬均為球腔菌屬，其相對豐度在43.91%～82.99%之間，說明西藏林芝地區(qū)葡萄可能存在致病菌感染的風(fēng)險。曲霉屬是常見的食品、糧食和環(huán)境污染菌，但曲霉也能產(chǎn)生各種有機酸、酶類和抗生素等有益的化合物[27]。曲霉屬是XH樣品中的優(yōu)勢真菌屬，其功能有待進一步確定。枝孢屬廣泛存在于土壤和植物體內(nèi)，能合成多種類型的化合物，如生物堿、醌類、萜類和醌類等[28]；枝頂孢屬是一類以腐生、寄生和自生為主的真菌，目前約有130種，部分枝頂孢屬真菌能產(chǎn)生多種具有生物活性的化合物，如恩醌類、萜類和酚類等，同時還具有抑菌作用[29]；MG和BL葡萄果實表皮富含豐富的枝孢屬真菌，ML葡萄果實表皮富含豐富的枝頂孢屬真菌，說明MG、BL和ML葡萄樣品果實表皮可能存在具有生物活性功能的益生微生物。

2.4 Beta多樣性差異分析

為了分析生物群落結(jié)構(gòu)組成上的差異，基于相對豐度前20的細菌和真菌屬對不同品種葡萄表皮菌落進行聚類分析，結(jié)果見圖5。

圖5 基于屬水平不同品種葡萄樣品表皮相對豐度前20的細菌（A）和真菌（B）聚類分析結(jié)果Fig.5 Cluster analysis results of relative abundance top 20 bacterial(A) and fungal (B) community on grape surface of different varieties based on genus level

由圖5A可知，BL和ML樣品聚為一支，而XH和MG樣品與BL和ML樣品間聚類較遠，說明BL和ML樣品果實表皮細菌群落結(jié)構(gòu)組成較其他樣品相似，而XH和MG樣品與BL和ML樣品果實表皮細菌群落結(jié)構(gòu)組成差異較大。

由圖5B可知，MG和BL樣品聚為一支，而與其他樣品間距離較遠，說明MG和BL樣品果實表皮真菌群落結(jié)構(gòu)組成較其他樣品相似。以上結(jié)果表明，不同品種葡萄果實表皮微生物群落結(jié)構(gòu)組成存在差異，葡萄品種類型是影響葡萄果實表皮微生物的關(guān)鍵因素。

3 結(jié)論

西藏林芝地區(qū)不同品種葡萄果實表皮微生物群落多樣性差異明顯，‘夏黑’葡萄果實表皮微生物豐富度和多樣性指數(shù)最高；不同品種葡萄果實表皮優(yōu)勢細菌屬主要分布在伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、SJA-15、勞爾氏菌屬（Ralstonia）、異樣根瘤菌屬（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）和阿菲波菌屬（Afipia），優(yōu)勢真菌屬主要分布在球腔菌屬（Mycosphaerella）、曲霉屬（Aspergillus）、枝孢屬（Cladosporium）和枝頂孢屬（Acremonium）。不同品種葡萄果實表皮微生物群落結(jié)構(gòu)組成及相對豐度差異明顯，說明葡萄品種影響葡萄果實表皮微生物群落結(jié)構(gòu)組成。