張 青，付 華，蘇 靖，夏美茹

（河套學(xué)院 農(nóng)學(xué)系，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000）

酸粥作為我國山西、陜西和內(nèi)蒙古部分地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵型谷物食品，主要利用乳酸菌和酵母菌等微生物對糜米等谷物進(jìn)行發(fā)酵而成，因其具有良好風(fēng)味、營養(yǎng)價值及保健作用而得到消費(fèi)者的喜歡[1]。研究顯示，谷物經(jīng)過發(fā)酵后其營養(yǎng)價值有明顯提高[2]，酸粥也因此受到了研究者較多的關(guān)注。張悅等[3]采用響應(yīng)面法對酸粥的制作工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在32 ℃發(fā)酵20 h，并將酸漿稀釋5倍后的酸粥感官品質(zhì)最優(yōu)；任宇婷等[4]對廣西扶綏酸粥的營養(yǎng)成分和微生物類群展開了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，扶綏酸粥中富含維生素和游離氨基酸，且乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和畢赤酵母屬（Pichia）分別為其中主要的優(yōu)勢細(xì)菌屬和真菌屬。然而，目前針對酸粥細(xì)菌菌群的研究更加廣泛而深入[5]，對真菌類群的研究相對較少。與此同時，酸粥的制作還未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，仍依靠家庭作坊式制作[6]。

位于內(nèi)蒙古河套地區(qū)的巴彥淖爾市具有廣泛制作和食用酸粥的習(xí)俗，酸粥亦是當(dāng)?shù)氐囊环N特色名小吃，然而目前針對當(dāng)?shù)厮嶂嗟恼婢惾航馕鲞€鮮有報(bào)道。因而，解析巴彥淖爾地區(qū)酸粥的真菌類群對全面了解酸粥的微生物類群以及未來酸粥工業(yè)化生產(chǎn)用菌的選擇具有一定的積極意義。Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)作為第二代高通量測序技術(shù)，因其能夠滿足快速掃描樣品環(huán)境微生物和價格低廉等需求[7]，被廣泛應(yīng)用于檢測環(huán)境微生物[8]、腸道微生物[9]和釀酒微生物[10]等，亦是解析發(fā)酵食品中微生物類群的有效方法[11]。

為明確內(nèi)蒙古巴彥淖爾地區(qū)酸粥樣品中的真菌菌群多樣性，本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對其真菌菌群多樣性進(jìn)行分析，并探討其中菌群的相關(guān)關(guān)系，以期為后續(xù)以酸粥為典型的地方發(fā)酵谷物制品產(chǎn)業(yè)發(fā)展給予理論數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

8份酸粥樣品：均采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市8個地區(qū)/縣/旗當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶自制的自然發(fā)酵酸粥，8份樣品編號依次為BS1～BS8，將采集到的樣品分別裝入采樣瓶中并放于有冰盒的采樣箱后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究。納入本研究的所有酸粥樣品均以糜米為主要原料，發(fā)酵時間在24～48 h。

1.1.2 試劑

MoBio PowerSoil脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Isolation Kit基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒：美國貝克曼庫爾特公司；Agilent DNA 1000 Kit：美國Agilent公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI Veriti梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；BIO-RAD 164-5050基礎(chǔ)電源電泳儀：美國伯樂公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國Protein Simple公司；高通量測序平臺：美國Illumina公司；R920機(jī)架式服務(wù)器：美國Dell公司。

1.3 方法

1.3.1 酸粥樣品宏基因組提取、PCR擴(kuò)增和高通量測序

使用基因組DNA提取試劑盒并參照說明書的具體步驟提取酸粥樣品中真菌菌群的宏基因組總DNA；以其為模板，采用引物ITS3F（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）和ITS4R（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對真菌的ITS 1區(qū)基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[12]，PCR擴(kuò)增體系和程序參照王玉榮等[13]的方法，并對檢驗(yàn)后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量檢測；將檢測合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托南京奧維森生物醫(yī)藥科技有限公司完成MiSeq平臺的測序。

1.3.2 數(shù)據(jù)處理及分析

將反饋回的有效序列上傳至QIIME（v1.70）平臺以對測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析[14]。首先將雙端序列對齊并歸至各樣品中，再采用UCLUST法將序列按97%的相似度劃分操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）[15]，之后對OTU進(jìn)行嵌合體檢查[16]，除去嵌合體OTU，繼而使用SILVA數(shù)據(jù)庫[17]對OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋，最后對酸粥樣品中真菌的α多樣性指數(shù)進(jìn)行計(jì)算[18]，進(jìn)而對樣品的物種豐度及多樣性進(jìn)行評估。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理及分析

使用Origin 2021軟件繪制稀釋曲線圖；使用R軟件實(shí)現(xiàn)各樣品中真菌門和屬相對含量的可視化；使用Excel 2016繪制核心優(yōu)勢OTU相對含量的瀑布圖；最后使用SAS 9.4軟件計(jì)算核心OTU的相關(guān)性系數(shù)和P值，并采用Catyscape（v3.7.2）軟件繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序結(jié)果及α多樣性分析結(jié)果

采用高通量測序技術(shù)對酸粥樣品中真菌菌群的ITS 1區(qū)基因序列進(jìn)行測序，共得到785 549條序列，按照97%相似度劃分序列并刪除嵌合體OTU后共劃分得到1 752個OTU，平均每個樣品獲得97 606條有效序列和539個OTU，各樣品的測序結(jié)果及α多樣性分析結(jié)果見表1。

表1 8份酸粥樣品真菌菌群的高通量測序結(jié)果及α多樣性分析結(jié)果Table 1 Results of high-throughput sequencing and alpha diversity analysis of fungal flora in 8 sour porridge samples

由表1可知，采集自五原縣的BS6樣品所獲得的序列數(shù)最多，達(dá)213 049條；采集自杭錦后旗的BS7樣品所獲得的序列數(shù)最少，僅有45 353條；BS6樣品的OTU數(shù)最多，而BS3樣品的OTU數(shù)最少。選取所有OTU代表性序列比對共鑒定到12個門、21個綱、55個目、119個科和198個屬，不能鑒定到門和屬的序列數(shù)分別占總序列數(shù)的0.97%和3.55%。由表1亦可知，所有樣品的超1指數(shù)范圍為453～890，其中BS3樣品的超1指數(shù)最小，BS6樣品的超1指數(shù)最大；香農(nóng)指數(shù)范圍為1.39～4.81，BS4樣品的香農(nóng)指數(shù)最小，BS6樣品的香農(nóng)指數(shù)仍最大。超1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)的大小分別與物種豐富程度和多樣程度成正比，兩者的值越大，則物種豐富度及多樣程度越高[19-20]。因而較之其他樣品，BS6樣品中的真菌類群不僅豐度最高，物種多樣性亦最高。此外，分析發(fā)現(xiàn)8份樣品之間的OTU數(shù)和α多樣性指數(shù)之間存在著較大差異，分析原因可能是由于樣品采集自不同縣市的8戶農(nóng)家，不同的制作手法和制作環(huán)境對酸粥中菌群的構(gòu)成有著直接或間接的影響[21]。

為檢查測序結(jié)果是否滿足后續(xù)研究要求，本研究進(jìn)一步采用稀釋曲線和香農(nóng)指數(shù)曲線分析酸粥樣品的測序深度和物種多樣性，結(jié)果見圖1。由圖1可知，BS6和BS8樣品的測序深度較其他樣品較深，發(fā)現(xiàn)物種數(shù)亦較多，BS6和BS7樣品的香農(nóng)指數(shù)較高。然而所有樣品的稀釋曲線與香農(nóng)曲線卻有著相同的變化趨勢，稀釋曲線均隨測序深度的增加而不斷上升，而香農(nóng)指數(shù)曲線卻是先隨測序深度的增加而上升，隨后上升速度趨于平緩，在測序深度達(dá)到40 000條時進(jìn)入平臺期，表明增加測序深度雖能檢測到更多的物種豐度，但物種的多樣性卻并不會大幅增加，說明在每個樣品的測序深度為43 010條序列時，物種的覆蓋率高且全面，因此，這一測序深度恰當(dāng)，其結(jié)果能夠表現(xiàn)其群落構(gòu)成的范圍，可滿足要求并進(jìn)行后續(xù)分析。

圖1 酸粥樣品的稀疏曲線（A）和香農(nóng)指數(shù)曲線（B）Fig.1 Rarefaction curve (A) and Shannon index curve (B) of sour porridge samples

2.2 酸粥樣品真菌菌群結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 基于真菌門分類學(xué)地位的真菌類群分析

基于門水平解析酸粥樣品中的真菌類群構(gòu)成，結(jié)果見圖2。

圖2 酸粥樣品中真菌門的相對豐度分析結(jié)果Fig.2 Analysis results of relative abundance of fungal phylum in sour porridge samples

由圖2可知，所有樣品僅注釋到1個優(yōu)勢真菌門（平均相對豐度＞1.0%），為子囊菌門（Ascomycota），其平均相對豐度高達(dá)98.11%。可見，酸粥樣品中的真菌類群大多隸屬于Ascomycota。

2.2.2 基于真菌屬分類學(xué)地位的真菌類群分析

進(jìn)一步基于屬水平解析酸粥樣品中的真菌類群構(gòu)成，結(jié)果見圖3。

圖3 酸粥樣品中真菌屬的相對豐度分析結(jié)果Fig.3 Analysis results of relative abundance of fungal genus in sour porridge samples

由圖3可知，所有樣品共鑒定出8個優(yōu)勢真菌屬（平均相對豐度＞1.0%），分別為畢赤酵母屬（Pichia）（37.32%）、哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）（20.34%）、酵母屬（Sac charomyces）（11.03%）、耐堿酵母屬（Galactomyces）（9.41%）、假絲酵母屬（Candida）（5.88%）、曲霉屬（Aspergillus）（4.44%）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）（2.69%）和德巴利酵母屬（Debaryomyces）（1.51%）?？梢姡嶂鄻悠分械恼婢惾阂越湍妇佣?，同時亦含有少量的霉菌。上述真菌屬在不同地區(qū)的酸粥中均有被檢測到，但各個菌屬的相對豐度在不同地區(qū)的樣品中有所差異。如王玉榮等[13，22]使用MiSeq高通量測序技術(shù)解析內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)酸粥的真菌菌群時發(fā)現(xiàn)，假絲酵母屬（Candida）和耐堿酵母屬（Galactomyccs）為相對豐度最高的兩個優(yōu)勢真菌屬，而畢赤酵母屬（Pichia）相對豐度＜1.0%。此外，折米娜等[23]研究發(fā)現(xiàn)，使用乳酸菌和畢赤酵母菌復(fù)配發(fā)酵的酸粥滋味品質(zhì)與使用乳酸菌單一發(fā)酵的酸粥滋味品質(zhì)并無顯著差異；JESPERSEN L[24]研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌能夠在發(fā)酵過程中起到促進(jìn)乳酸菌生長的作用。因而，畢赤酵母屬對酸粥的滋味品質(zhì)并無積極影響，但或許對酸粥中微生物共生有積極作用。

值得注意的是，這些優(yōu)勢真菌屬在各樣品中的相對豐度并未像優(yōu)勢真菌門一樣表現(xiàn)出均一性。如Pichia在BS1、BS2、BS3和BS8樣品中的相對豐度在40.67%～81.13%之間，但在其他樣品中相對豐度卻＜2.0%；Kazachstania僅在BS4和BS8樣品中相對豐度較高，而Galactomyces、Aspergillus和Saccharomyces僅分別在BS5、BS6和BS7樣品中較豐富一些。納入本研究的樣品雖都來源于巴彥淖爾市，但該市地理面積廣闊，南北中西部分別為平原、草原、山地和沙漠戈壁，地理形勢復(fù)雜，各縣的環(huán)境亦有所不同[25]。

2.2.3 基于OTU水平的真菌類群分析

進(jìn)一步從OTU水平解析酸粥樣品中的真菌類群，OTU在各樣品中的分布情況見圖4。

圖4 酸粥樣品中操作分類單元數(shù)量的分布情況Fig.4 Distribution of operational taxonomic unit quantities in sour porridge samples

由圖4可知，在8份酸粥樣品中，BS6、BS7和BS8樣品較其他樣品獲得了更多的OTU，其含有的特有OTU（僅在一個樣品中存在，其他樣品中均不存在的OTU）亦更多，它們各自包含的特有OTU數(shù)量均＞150個，而其他樣品各自包含的特有OTU卻＜50個，說明上述3個樣品中的真菌類群較其他樣品更為豐富和特別。值得注意的是，8份樣品中包含了50個核心OTU（在所有樣品中均存在的OTU），本研究選取了其中平均含量＞1.0%的優(yōu)勢OTU進(jìn)一步分析，結(jié)果見圖5。

圖5 核心操作分類單元相對豐度統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Fig.5 Results of statistical analysis of relative abundance of core operational taxonomic units

由圖5可知，50個核心OTU中共有15個核心OTU，分別被注釋為畢赤酵母屬（Pichia）（OTU4549和OTU990）、耐堿酵母屬（Galactomyces）（OTU2455和OTU1541）、哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）（OTU6240和OTU5763）、假絲酵母屬（Candida）（OTU1327）、曲霉屬（Aspergillus）（OTU 1949、OTU2129和OTU4506）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）（OTU5030和OTU185）、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）（OTU4366）和酵母屬（Saccharomyces）（OTU2585和OTU 2104），累計(jì)相對含量分別為37.45%、17.99%、15.04%、5.12%、8.83%、3.00%、1.56%、3.50%，總累計(jì)相對含量高達(dá)92.49%。該結(jié)果與優(yōu)勢菌屬得到的結(jié)論十分相近，說明雖然部分樣品中有著較多不同于其他樣品的菌群類別，但整體的核心菌群（相對含量＞1.0%的核心OTU被注釋到的真菌屬）卻都是一致的。

在核心優(yōu)勢OTU分析的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探究它們之間的相關(guān)性，結(jié)果見圖6。由圖6可知，核心優(yōu)勢OTU之間更多呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)關(guān)系，但均不具有顯著性（P＞0.05）。相反，具有顯著相關(guān)性的核心優(yōu)勢OTU間均為正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。如OTU4549與OTU5030（R=0.973）、OTU2455與OTU1541（R=0.986）和OTU5763（R=0.978）、OTU1541與OTU5763（R=0.999）、OTU1949與OTU2129（R=0.999）和OTU4506（R=0.999）、OTU 2129和OTU（R=0.999）、OTU5030和OTU185（R=0.985）以及OTU2585和OTU2104（R=0.999）之間均為顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。由此可見，酸粥樣品中的真菌類群間可能大多為共存關(guān)系，酸粥品質(zhì)的形成亦可能是它們協(xié)同互作的結(jié)果。

圖6 核心優(yōu)勢操作分類單元間相關(guān)性分析結(jié)果Fig.6 Results of correlation analysis between core dominant operational taxonomic units

3 結(jié)論

使用高通量測序技術(shù)對巴彥淖爾地區(qū)酸粥樣品中的真菌菌群多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8份酸粥樣品中的優(yōu)勢真菌門為Ascomycota（98.11%），優(yōu)勢真菌屬為Pichia（37.32%）、Kazachstania（20.34%）、Saccharomyces（11.03%）、Galactomyces（9.41%）、Candida（5.88%）、Aspergillus（4.44%）、Issatchenkia（2.69%）和Debaryomyces（1.51%），這些菌屬也為其中的核心真菌類群，且核心菌群之間大多表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系。