張小勤，潘曉姍，李 東，蔣思峽，張 豐，安焱林，趙晶晶，宋 亞，喻仕瑞，張 陽，顏茹雨

（茅臺學(xué)院 食品科學(xué)與工程系，貴州 遵義 564507）

刺梨（Rosa roxbunghii）為一種薔薇科多年生落葉灌木繅絲花的果實(shí)[1]，是滋補(bǔ)健身的營養(yǎng)珍果，富含多種氨基酸和維生素C[2]，因其含有抗衰老和抗癌物質(zhì)超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD），被稱為“長壽防癌”的綠色珍果[3]。我國貴州地區(qū)刺梨資源尤為豐富，產(chǎn)量全國領(lǐng)先[4-6]。近年來，刺梨特色產(chǎn)業(yè)迎來了前所未有的歷史發(fā)展機(jī)遇[6-7]。目前，刺梨產(chǎn)品主要為原汁、飲料、果干、果糕和浸泡酒等，這些產(chǎn)品大多存在附加值偏低的缺點(diǎn)[8]。刺梨果酒歷史悠久，早在清道光十三年便有記錄[9]，目前刺梨果酒多以高度白酒浸泡[10-11]、商用酵母直接釀造[12-13]或用經(jīng)馴化后的商用酵母釀造[14]，但受限于浸泡果酒口感粗糙不夠柔和、缺乏刺梨果酒釀造專用酵母，在刺梨果酒釀造過程中未能很好的體現(xiàn)貴州產(chǎn)地刺梨果酒的特色和風(fēng)格。

酵母是發(fā)酵釀制果酒中決定果酒品質(zhì)優(yōu)劣的核心要素，優(yōu)良的刺梨果酒酵母菌應(yīng)具有發(fā)酵速度快、產(chǎn)乙醇率高、耐受性好（耐糖、耐乙醇、耐SO2、耐酸等）、凝聚性好，發(fā)酵結(jié)束后能使酒快速澄清的特點(diǎn)[15]。目前，針對刺梨果酒釀造專用的產(chǎn)酒精酵母報(bào)道較少，基于此，本研究擬從貴州遵義、荔波、六盤水、都勻刺梨種植基地采集刺梨鮮果樣品，采用孟加拉紅培養(yǎng)基分離純化、2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyte-trazoliumchloride，TTC）培養(yǎng)基初篩產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的酵母菌株，結(jié)合杜氏小管產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)和耐受性實(shí)驗(yàn)復(fù)篩發(fā)酵性能優(yōu)良的酵母菌株，然后采用復(fù)篩菌株釀造刺梨果酒，測定果酒理化指標(biāo)，最后基于26S rDNA基因序列對復(fù)篩菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。篩選出適合貴州地區(qū)刺梨果酒釀造的產(chǎn)酒精酵母，對改善刺梨果酒特色風(fēng)味和品質(zhì)具有重要意義。同時(shí)可提升刺梨的附加值，解決刺梨季節(jié)性過剩的問題，亦可豐富果酒市場，具有良好的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

成熟新鮮刺梨：采自貴州遵義、荔波、六盤水、都勻刺梨種植基地。

1.1.2 菌株

商業(yè)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）D524：上?？奠称凤嫎I(yè)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

孟加拉紅培養(yǎng)基：杭州百思生物技術(shù)有限公司；TTC培養(yǎng)基：環(huán)凱微生物科技有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。YPD固體培養(yǎng)基中添加瓊脂粉20 g/L。

1.1.4 試劑

乙醇（分析純）：南昌華鑫醫(yī)藥化工有限公司；鹽酸（分析純）：上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司；氫氧化鈉、酚酞、偏重亞硫酸鉀（均為分析純）：北京沃凱生物科技有限公司；無水葡萄糖、瓊脂粉（均為生化試劑）：常德比克曼生物科技有限公司；酵母浸粉、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE5RAA高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；CV-5200PC分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；BGG-9140A干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HZQ-C臥式恒溫?fù)u床：常州洛基儀器有限公司；DL-CJ-2NDI超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DKB24電熱恒溫水浴鍋：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FA2004W電子天平：上海菁海儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 刺梨果酒產(chǎn)酒精酵母的富集

將采摘好的刺梨進(jìn)行榨汁、過濾，所得的刺梨汁與刺梨渣各分裝兩份進(jìn)行發(fā)酵，一份隔絕空氣、一份不隔絕空氣。相同條件下自然發(fā)酵7 d[16]。

吸取上述樣品各5 mL分別放入100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，并在28 ℃、220 r/min搖床中富集培養(yǎng)12 h。

1.3.2 刺梨果酒產(chǎn)酒精酵母的分離

在無菌操作條件下，使用梯度稀釋法將富集培養(yǎng)好的菌液進(jìn)行梯度稀釋，各取0.1 mL稀釋液涂布在孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基上，在28 ℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h。觀察菌落在孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基上的顏色形態(tài)以及隆起情況，選取明顯是酵母菌的菌株，將其進(jìn)行分離純化，直到看到單個菌落[17]。

1.3.3 刺梨果酒產(chǎn)酒精酵母的形態(tài)觀察及產(chǎn)酒精能力篩選

將篩選出的單個酵母菌菌落接種在YPD固體培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h。通過觀察酵母菌的形態(tài)特征，挑選出典型的酵母菌菌落（表面光滑、濕潤、黏稠，質(zhì)地柔軟，容易挑起，大多為乳白或奶油色，并且具有愉悅香氣等特征[18]）。隨后以商業(yè)釀酒酵母D254為對照，將其接種于TTC固體培養(yǎng)基，于28 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h后觀察酵母菌的顏色。因?yàn)門TC本身是一種顯色劑，它能與酵母中的脫氫酶發(fā)生呈色反應(yīng)，通過顏色深淺可以判斷酵母中呼吸酶活力的大小，進(jìn)而判斷出酵母菌產(chǎn)酒精能力的高低，產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的酵母會顯深紅色，次之顯紅色、微紅色或不顯色[19]，所以篩選顏色較深的酵母菌作為初篩菌株，并分別接種到Y(jié)PD斜面培養(yǎng)基上，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后放入冰箱（4 ℃）保存，用于后續(xù)酵母菌的篩選鑒定。

1.3.4 刺梨果酒產(chǎn)酒精酵母發(fā)酵性能的測試

（1）杜氏小管發(fā)酵測試

將初篩菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h活化，制成菌懸液。按照1%（V/V）的接種量接種于含10 mL YPD液體培養(yǎng)基和杜氏小管的試管中[20]，于28 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，平行實(shí)驗(yàn)3次，期間記錄各菌株的產(chǎn)氣起始時(shí)間、凝聚性能、杜氏管內(nèi)充滿氣體時(shí)間，如有大量白色沉淀形成，表明生長旺盛[21]。將產(chǎn)氣時(shí)間較快，有絮凝沉淀物，且氣泡為杜氏小管2/3的菌株在冰箱中（4 ℃）保藏，作為一級篩選的菌株進(jìn)行耐受性試驗(yàn)。

（2）耐受性測試

參照文獻(xiàn)[22]的方法并做了部分調(diào)整，將一級篩選得到的菌株制成菌懸液，按照1%（V/V）的接種量分別接種到不同葡萄糖含量（10%、20%、30%、40%、50%）、乙醇含量（10%vol、12%vol、14%vol、16%vol、18%vol）、SO2含量（100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L和300 mg/L）以及酸度（pH=2.0）的YPD液體培養(yǎng)基試管中，于28 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h，記錄酵母菌在24 h內(nèi)產(chǎn)氣情況，每個試驗(yàn)平行重復(fù)3次，總結(jié)分析菌株的耐受性，篩選出耐高糖含量、低pH值、高乙醇含量、高SO2含量的產(chǎn)酒精酵母菌株作為二級篩選菌株進(jìn)行釀酒試驗(yàn)。

1.3.5 刺梨果酒產(chǎn)酒精酵母的釀酒實(shí)驗(yàn)

在無菌條件下，將二級篩選得出的酵母菌菌株接種于100 mL YPD液體培養(yǎng)基內(nèi)，在28 ℃、220 r/min的搖床中培養(yǎng)12 h。將過濾后的1 L刺梨汁倒入大燒杯中，使用白砂糖調(diào)節(jié)刺梨原汁的糖度至20.3°Bx，加入偏重亞硫酸鉀0.1 g，隨后搖勻分裝入容量為200mL的錐形瓶中，并將酵母菌菌液按照5%（V/V）的接種量加入至各錐形瓶中，貼好標(biāo)簽，用橡膠塞塞住瓶口并插上單向排氣閥，置于28 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵8 d。

1.3.6 刺梨果酒理化指標(biāo)測試及感官評價(jià)

發(fā)酵結(jié)束后，取樣測定發(fā)酵過程中發(fā)酵醪的白利糖度、總酸及揮發(fā)酸和最終發(fā)酵液的酒精度、澄清度，然后對刺梨果酒進(jìn)行感官評價(jià)。根據(jù)其理化指標(biāo)與感官評價(jià)，篩選出優(yōu)良的刺梨產(chǎn)酒酵母菌作為三級篩選菌株。理化指標(biāo)中總酸度、揮發(fā)酸、酒精度測試參考GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[23]；感官評價(jià)參考文獻(xiàn)[24]并做適當(dāng)調(diào)整，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 刺梨果酒的感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of Rosa roxbunghii wine

1.3.7 刺梨果酒產(chǎn)酒酵母的分子生物學(xué)鑒定

參照文獻(xiàn)[25]對篩選出的優(yōu)良產(chǎn)酒酵母菌進(jìn)行26SrDNA序列鑒定，將三級篩選酵母菌株送至北京擎科生物技術(shù)有限公司重慶分公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性搜索比對，選取同源性較高的模式菌株的26S rDNA基因序列，采用MEGA6軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Excel 2013、SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺梨果酒產(chǎn)酒精酵母的分離、形態(tài)鑒定及產(chǎn)酒精能力篩選結(jié)果

刺梨發(fā)酵液經(jīng)孟加拉紅培養(yǎng)基梯度稀釋分離純化，然后結(jié)合YPD固體培養(yǎng)基觀察酵母菌的外觀特征以及產(chǎn)酒精酵母特有的香味，共分離篩選出35株疑似酵母菌，菌株編號及TTC顯色結(jié)果見表2。由表2可知，菌株GL13、GL14、GL141、GL15、GP21、GP23、GP24、GP25、GD33、GD331、GZ431與商業(yè)釀酒酵母D254在TTC培養(yǎng)基上的顏色較深，將其作為初級篩選菌株。

表2 2,3,5-三苯基氯化四氮唑培養(yǎng)基篩選產(chǎn)酒酵母結(jié)果Table 2 Screening results of wine-producing yeasts by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride medium

2.2 刺梨果酒產(chǎn)酒精酵母發(fā)酵性能的測定結(jié)果

2.2.1 杜氏小管實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將初級篩選菌株經(jīng)杜氏管產(chǎn)氣試驗(yàn)后，觀察各菌株的產(chǎn)氣起始時(shí)間、杜氏管內(nèi)充滿氣時(shí)間和菌體凝集性，篩選出起酵快和凝聚性良好菌株，結(jié)果見表3。由表3可知，菌株GL13、GL14、GP21、GP23、GP24、GD331、GD33、GZ431與D254都具有較好的凝聚性能，在10 h內(nèi)凝聚且快速在試管底形成大量白色沉淀，將其作為一級篩選菌株。

表3 杜氏小管產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of Duchenne tube gas production tests

續(xù)表

2.2.2 耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）糖耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

一級篩選菌株的糖耐受性試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，在高糖含量下，只有菌株GL14、GP21、GP24產(chǎn)氣受到的抑制最小，能夠發(fā)酵產(chǎn)氣充滿杜氏小管。商業(yè)釀酒酵母D254在葡萄糖含量為40%時(shí)產(chǎn)氣受到抑制，其余菌株在不同葡萄糖含量下會產(chǎn)氣，但受到不同程度的抑制。

表4 糖耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of glucose resistance tests

（2）乙醇耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

一級篩選菌株的乙醇耐受性試驗(yàn)結(jié)果見表5。由表5可知，所有菌株在乙醇含量為10%vol的YPD液體培養(yǎng)基中都能夠正常發(fā)酵，產(chǎn)氣充滿杜氏小管。當(dāng)乙醇含量上升到12%vol時(shí)，菌株GL13和GD33發(fā)酵產(chǎn)氣速度受到抑制；而商業(yè)釀酒酵母菌D254在乙醇含量為16%vol時(shí)產(chǎn)氣才受到抑制；當(dāng)乙醇含量上升到18%vol時(shí)，只有菌株GL14、GP24、GP21的產(chǎn)氣沒有受到抑制，其余菌株都有著不同程度的抑制。

表5 乙醇耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of ethanol resistance tests

（3）SO2耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

一級篩選菌株的SO2耐受性試驗(yàn)結(jié)果見表6。由表6可知，當(dāng)SO2含量為100 mg/L時(shí)，菌株GD33、GZ431的產(chǎn)氣受到明顯抑制；當(dāng)SO2含量為150 mg/L時(shí)，菌株GD33已經(jīng)停止產(chǎn)氣；當(dāng)SO2含量為300 mg/L時(shí)，菌株GL13、GP23、GD331、GZ431的產(chǎn)氣受到抑制，而菌株GL14、GP24、GP21、D254的耐受性較好。

表6 SO2耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of SO2 resistance tests

（4）酸耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

一級篩選菌株在pH=2的高酸環(huán)境下的耐受性試驗(yàn)結(jié)果見表7。由表7可知，在pH=2的高酸性條件下，菌株GD33、GZ431停止產(chǎn)氣，菌株GP23產(chǎn)氣受到嚴(yán)重的抑制，菌株GL13、GL14、GP21、GD331產(chǎn)氣受到不同程度的抑制，而菌株GP24、D254產(chǎn)氣受到的抑制最小。

表7 酸（pH=2）耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of acid (pH=2) resistance tests

根據(jù)8株一級篩選菌株的耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，菌株GL14、GP21、GP24在高糖、高乙醇、高SO2含量和高酸特性下受到的抑制影響最小，且在耐高糖、高乙醇含量方面優(yōu)于商業(yè)釀酒酵母D254。因此，將這3株酵母菌作為二級篩選結(jié)果。

2.3 刺梨果酒產(chǎn)酒酵母的釀酒實(shí)驗(yàn)

2.3.1 理化指標(biāo)分析

采用菌株GL14、GP21、GP24發(fā)酵刺梨汁制備刺梨果酒，檢測刺梨果酒的理化指標(biāo)，結(jié)果見表8。由表8可知，澄清度方面，菌株GL14和GP24發(fā)酵的刺梨果酒澄清度較高，分別為0.373和0.306；總酸和揮發(fā)酸方面，3株酵母發(fā)酵的刺梨果酒差異不顯著（P＞0.05）；糖度方面，菌株GP21發(fā)酵的刺梨果酒糖度最高（9.3 °Bx），說明其發(fā)酵程度相對較低，與其酒精度較低（7.0%vol）相符合；酒精度方面，菌株GL14和GP24發(fā)酵的刺梨果酒較高，均為8.0%vol。

表8 不同酵母菌發(fā)酵刺梨果酒的理化指標(biāo)Table 8 Physical and chemical indicators of Rosa roxbunghii wine fermented by different yeasts

2.3.2 感官評價(jià)

菌株GL14、GP21、GP24發(fā)酵刺梨果酒的感官評分見表9。由表9可知，菌株GL14、GP21、GP24發(fā)酵刺梨果酒的感官評分分別為74.55分、80.09分、79.77分。就香氣而言，菌株GP21發(fā)酵刺梨果酒的分?jǐn)?shù)最高，為27.36分；而在外觀、滋味和典型性方面，3株菌株發(fā)酵刺梨果酒無顯著差異（P＞0.05）；3株酵母菌株發(fā)酵刺梨果酒的各項(xiàng)感官指標(biāo)均未出現(xiàn)明顯缺陷，均具有刺梨果酒釀造潛力。

表9 不同酵母發(fā)酵刺梨果酒的感官評價(jià)結(jié)果Table 9 Sensory evaluation results of Rosa roxbunghii wine fermented by different yeasts

根據(jù)菌株GL14、GP21、GP24發(fā)酵釀制得到的刺梨果酒的理化指標(biāo)和感官評價(jià)可知，其酒精度符合NY/T 1508—2017《綠色食品 果酒》標(biāo)準(zhǔn)[26]。其中菌株GL14、GP24發(fā)酵釀制的刺梨果酒在澄清度及酒精度方面優(yōu)于菌株GP21；在刺梨果酒的香氣上菌株GP21更適合刺梨果酒的釀造。綜上，菌株GL14、GP21、GP24具有優(yōu)質(zhì)刺梨果酒釀造潛力，將這3株酵母菌作為三級篩選菌株。

2.4 刺梨果酒產(chǎn)酒酵母的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

將三級篩選酵母菌進(jìn)行26S rDNA分子生物學(xué)鑒定，構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌株GP24和GP21與熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）聚于一支，菌株GL14與異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）聚于一支，親緣關(guān)系最近。因此，菌株GP21、GP24被鑒定為熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）、菌株GL14被鑒定為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。

圖1 基于26S rDNA基因序列3株酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 3 yeasts based on 26S rDNA gene sequences

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選用貴州遵義、荔波、六盤水、都勻的新鮮刺梨為原料，采用孟加拉紅培養(yǎng)基從中分離純化得到35株酵母菌株，經(jīng)TTC培養(yǎng)基初篩，結(jié)合杜氏管產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、耐受性實(shí)驗(yàn)復(fù)篩得到3株優(yōu)良產(chǎn)酒精酵母，編號分別為GL14、GP21、GP24，其產(chǎn)氣快、凝聚性強(qiáng)，可耐受50%葡萄糖、18%vol乙醇、300 mg/L SO2、pH=2環(huán)境。利用這3株菌株發(fā)酵釀造刺梨果酒，結(jié)果表明，菌株GL14、GP24發(fā)酵的刺梨果酒在澄清度及酒精度方面優(yōu)于菌株GP21，而在刺梨果酒的香氣上，菌株GP21發(fā)酵的刺梨果酒更優(yōu)。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，菌株GL14被鑒定為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomycesanomalus），菌株GP24和GP21均被鑒定為熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）。本研究為今后選育適合刺梨果酒釀造的酵母菌奠定基礎(chǔ)，對未來釀造具有獨(dú)特風(fēng)格的刺梨果酒、促進(jìn)貴州地區(qū)的刺梨資源開發(fā)利用和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)有十分重要的意義。