顏家慶，張嬌嬌，郭炳豪，韓興林，沈世明，孫志偉，徐曉玲*，江 偉，黃科瑞，劉 芳

（1.百色學(xué)院 農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院，廣西 百色 533000；2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015；3.國(guó)家酒類品質(zhì)與安全國(guó)際聯(lián)合研究中心，北京 100015）

白蘭地是一種蒸餾酒，以水果為原材料，經(jīng)過(guò)發(fā)酵、蒸餾、貯藏以及陳釀而成[1]。香氣物質(zhì)的種類及其含量是評(píng)價(jià)水果白蘭地品質(zhì)高低的一個(gè)重要指標(biāo)，也是水果白蘭地中重要的功能性組成成分[2-3]。不同品種的水果釀造出來(lái)的白蘭地香氣成分千差萬(wàn)別，而相同品種釀造而成的白蘭地的香氣成分也會(huì)受到釀酒原料、發(fā)酵工藝、蒸餾工藝以及橡木桶陳釀等多種因素的影響[4-6]。近幾年來(lái)，關(guān)于白蘭地香氣成分的研究較多。如劉其聳[7]對(duì)張?jiān)０滋m地蒸餾過(guò)程香氣物質(zhì)變化規(guī)律的研究，通過(guò)白蘭地蒸餾前后成分的差異，發(fā)現(xiàn)一次蒸餾液比二次蒸餾液的香氣成分多15種。畢蕓杰[8]研究葡萄品種、陳釀時(shí)間與橡木制品對(duì)白蘭地香氣成分的影響，發(fā)現(xiàn)不同葡萄品種、陳釀時(shí)間與榆木制品對(duì)白蘭地香氣成分的影響有顯著性差異。

芒果（Mangifera indicaLinn）又名“杧果”、“面果”、“檬果”等，原產(chǎn)地于印度和馬來(lái)西亞，為漆樹(shù)科芒果屬芒果種多年生植物[9]。芒果具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其胡蘿卜素、維生素C（vitamin C，VC）和硒的含量分別是蘋果的45～104倍、3～10倍和2～12倍，VB1、VB2的含量與柑桔和菠蘿相當(dāng)，素有“熱帶果王”的美譽(yù)[10-11]。由于其富含硒，因而被稱為“抗癌之王”[12]。同時(shí)，芒果還含有芒果甙、槲皮素等成分，具有祛疾止咳的功效?！毒V目拾遺》指出芒果能益胃氣、止嘔暈[13]。然而，由于芒果屬于熱帶水果，采后生理代謝旺盛，且對(duì)低溫敏感，易遭受冷害，不耐貯藏。所以我國(guó)芒果的銷售主要集中在中、低檔市場(chǎng)，價(jià)低傷農(nóng)且由于上市時(shí)間集中導(dǎo)致季節(jié)性過(guò)剩[14-15]。將芒果釀造成白蘭地可以有助于減少原料浪費(fèi)，提升芒果副產(chǎn)值[16]。桂七芒果是廣西百色市特色芒果品種，有“肉質(zhì)嫩、甜度高、香氣足”等特點(diǎn)，是釀造芒果白蘭地的絕佳原料。

本研究以桂七芒果為原料，分別以6種釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為發(fā)酵劑制備芒果白蘭地，進(jìn)一步采用感官評(píng)價(jià)和氣相色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器（gas chromatography-hydrogen flame ionization detector，GC-FID）對(duì)芒果白蘭地的香氣和揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，研究不同釀酒酵母對(duì)芒果白蘭地風(fēng)味的影響，為芒果白蘭地釀酒酵母的選擇和工藝優(yōu)化提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桂七芒果、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Marquise（M型）（發(fā)酵速度快速、揮發(fā)酸產(chǎn)量低，可在極端環(huán)境下進(jìn)行酒精發(fā)酵）、Persane（P型）（發(fā)酵速度中等、揮發(fā)酸產(chǎn)量非常低，可產(chǎn)生大量芳香化合物如2-乙酸苯乙酯、苯乙酸酯等）、Authentique（A型）（發(fā)酵速度和揮發(fā)酸產(chǎn)量中等，可開(kāi)發(fā)出水果的復(fù)合香氣）、Raffinee（R型）（發(fā)酵速度中等、揮發(fā)酸產(chǎn)量低，可開(kāi)發(fā)發(fā)酵酯和品種香氣釋放果味和復(fù)雜香氣）、Eclatante（E型）（發(fā)酵速度中等、揮發(fā)酸產(chǎn)量低，可最大限度表達(dá)硫醇品種和萜烯品種的芳香）、Italica CR1（C型）（發(fā)酵速度極快、揮發(fā)酸產(chǎn)量低，在＜10 ℃下接種，此酵母具有很高地滲透性，可以增強(qiáng)水果品種和風(fēng)土的典型芳香特征）：煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司。

果膠酶（酶活力≥60 000 U/mL）：上海鼎唐國(guó)際貿(mào)易有限公司；L（+）-抗壞血酸（分析純）：江蘇宜昊添生物科技有限公司；白砂糖：市售。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TurboMatrix40氣相色譜儀：上海珀金埃爾默股份有限公司；ICS-3000離子色譜儀：美國(guó)戴安公司；JJ1000電子天平：常熟雙杰測(cè)試儀器廠；HX-PB915多功能料理機(jī)：佛山海迅電器有限公司；HH-S4A電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；5-21R離心機(jī)：湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司；玻璃蒸餾器、SKG1601電陶爐：廣東艾詩(shī)凱奇有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芒果白蘭地加工工藝流程及操作要點(diǎn)

芒果→挑選清洗→預(yù)處理→打漿→果膠酶處理→含糖量調(diào)整→接種酵母→發(fā)酵→離心→蒸餾→原芒果白蘭地

操作要點(diǎn)：

（1）預(yù)處理：將新鮮成熟的芒果清洗后進(jìn)行去皮去核處理，切成1 cm3左右的小方塊，將其浸泡在含抗壞血酸的溶液（50 mg/L）中，進(jìn)行護(hù)色處理。

（2）果膠酶處理：主要是對(duì)芒果果漿中的果膠進(jìn)行酶解，果膠酶添加量為50 μL/L，在50 ℃下酶解3 h。

（3）糖度調(diào)整：用白砂糖將芒果果漿糖度調(diào)整至28°Bx。

（4）酵母接種：調(diào)整糖度后的芒果果漿進(jìn)行酵母接種，酵母需要提前活化，即將酵母放入燒杯，加入20 mL蒸餾水，放至35 ℃的恒溫水浴鍋中活化15 min，酵母接種量為0.20 g/L。

（5）發(fā)酵：將接種酵母后的芒果果漿放置于18 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，發(fā)酵7 d。

（6）離心：將發(fā)酵結(jié)束的芒果醪液于6 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，得到芒果果酒。

（7）蒸餾：采用夏朗德壺式蒸餾器進(jìn)行二次蒸餾，得到原芒果白蘭地，酒精度為40%vol～43%vol。

1.3.2 白蘭地香氣描述詞的確定

在白蘭地香氣圖譜建立的過(guò)程中，首先要找出較好概括該類型產(chǎn)品風(fēng)格特點(diǎn)的描述詞，在此根據(jù)中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院技術(shù)人員品評(píng)結(jié)果，最終確定了芒果白蘭地特征風(fēng)格描述詞，如表1所示。

表1 芒果白蘭地特征風(fēng)格描述詞[17]Table 1 Characteristic style descriptors of mango brandy

1.3.3 白蘭地香氣圖譜的建立

選5名專業(yè)品評(píng)人員在白酒品評(píng)室內(nèi)對(duì)6種芒果白蘭地進(jìn)行感官品評(píng)，將白蘭地依次倒入50 mL的標(biāo)準(zhǔn)品評(píng)杯中品嘗。每次品嘗微量，品嘗完漱口進(jìn)行下一芒果白蘭地品嘗，按照表1風(fēng)味描述詞打分。將打分結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并繪制香氣圖譜。打分標(biāo)準(zhǔn)如下：

0—沒(méi)有味道；1分—?jiǎng)偰懿煊X(jué)，難以辨識(shí)；2分—非常輕；3分—較輕；4～5分—中等；6～7分—較強(qiáng)；8～9分—主導(dǎo)。

1.3.4 氣相色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器分析

GC條件：CP-WAX 57 CB毛細(xì)管柱（50 m×0.25 mm×0.2 μm），載氣為高純氮?dú)猓∟2）；流速1 mL/min，分流比10∶1；氫氣流速45 mL/min；空氣流速450 mL/min；檢測(cè)器溫度270 ℃；進(jìn)樣器溫度240 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

升溫程序：起始溫度35 ℃恒溫6 min；以4 ℃/min升至60 ℃，以6 ℃/min升至110 ℃，恒溫3 min；以6 ℃/min升至205 ℃，繼續(xù)恒溫13 min。

定性方法：將乙醛、丙醛、異丁醛、甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙縮醛、仲丁醇、正丙醇、正己醛、異丁醇、2-戊醇、正丁醇等62種目標(biāo)化合物用100%乙醇逐步稀釋、分析檢測(cè)，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

定量方法：采用內(nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)物選用叔戊醇、乙酸正丁酯、2-乙基丁酸，向待測(cè)樣品中加入100 μL的1%內(nèi)標(biāo)溶液，混勻后進(jìn)樣分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Office Excel 2013和SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析（analysis of variance，ANOVA），并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。利用Origin 2018軟件進(jìn)行主成分分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母菌株對(duì)芒果白蘭地香氣圖譜的影響

采用酵母Marquise、Persane、Authentique、Raffinee、Eclatante、Italica CR1釀造得到的原白蘭地樣品依次編號(hào)為M、P、A、R、E、C。對(duì)6株酵母菌株釀造的芒果白蘭地感官品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)后繪制香氣雷達(dá)圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同酵母菌株制備芒果白蘭地感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖Fig.1 Radar map of sensory evaluation of mango brandy prepared by different yeast strains

由圖1可知，6株酵母菌株釀制的芒果白蘭地整體風(fēng)格得分由高到低依次為C＞M＞P＞R＞E＞A。C型酵母釀制的芒果白蘭地得分最高，其酒澄清透明，酒香醇和，酒質(zhì)甘冽，具有芒果清香。M型酵母和E型酵母的醇香與花香評(píng)分較高，但有硫臭味、口感不協(xié)調(diào)等導(dǎo)致分值較低，P型酵母和R型酵母復(fù)合酯香與醇香評(píng)分較高，但酒體粗糙，口感苦澀，A型酵母整體評(píng)分比其他酵母低且有異味，酒體粗劣。因此，從圖譜的角度來(lái)看，C型酵母釀制的芒果白蘭地品質(zhì)較佳。

2.2 不同酵母菌株釀造的白蘭地的揮發(fā)性成分分析

進(jìn)一步利用GC-MS測(cè)定6種芒果白蘭地的揮發(fā)性成分，不同種類揮發(fā)性成分測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同酵母菌株對(duì)芒果白蘭地中揮發(fā)性風(fēng)味成分的影響Fig.2 Effect of different yeast strains on volatile flavor components in mango brandy

由圖2可知，共檢測(cè)得到5大類揮發(fā)性化合物，6種芒果白蘭地中揮發(fā)性化合物含量由高到低依次為M＞R＞P＞A＞C＞E。6種酵母所釀制的芒果白蘭地的酸類和醇類物質(zhì)是揮發(fā)性成分中主要的物質(zhì)，占總揮發(fā)性化合物總量的60%以上。酯類物質(zhì)和醛酮類物質(zhì)占總揮發(fā)性化合物總量的31%，而芳香類物質(zhì)占比最低，不到1%。

2.2.1 酸類化合物分析

有機(jī)酸物質(zhì)對(duì)酒品發(fā)酵過(guò)程中的微生物抑制和酒的風(fēng)味有重要影響，含酸量少的酒味道寡淡；但如果酸味過(guò)大，又會(huì)影響酒的風(fēng)味和品質(zhì)[18]。有機(jī)酸的產(chǎn)生主要來(lái)自于水果發(fā)酵過(guò)程中醛類物質(zhì)的氧化，其濃度主要取決于未發(fā)酵水果汁的初始發(fā)酵條件[19]。不同的有機(jī)酸在酒的風(fēng)味形成中既發(fā)揮各自獨(dú)特的作用，又會(huì)相互協(xié)調(diào)，是形成白蘭地獨(dú)特風(fēng)味的重要成分[20]。不同酵母菌株對(duì)芒果白蘭地酸類化合物的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同酵母菌株對(duì)芒果白蘭地酸類化合物的影響Fig.3 Effect of different yeast strains on acids in mango brandy

由圖3可知，6種白蘭地中的酸類化合物含量由高到低依次為C＞A＞R＞M＞P＞E。蘋果酸、乳酸在6種白蘭地中貢獻(xiàn)較大，占總酸含量的81.98%，蘋果酸含量中C型酵母與P型酵母、A型酵母、R型酵母、E型酵母沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），乳酸含量中C型酵母與M型酵母、P型酵母、R型酵母、E型酵母有顯著性差異（P＜0.05），與A型酵母沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。

2.2.2 醇類化合物分析

醇類通常為原料在發(fā)酵的過(guò)程中，通過(guò)酵母的發(fā)酵代謝使發(fā)酵汁中的糖和氨基酸轉(zhuǎn)化為醇，然后經(jīng)過(guò)蒸餾過(guò)程，進(jìn)入到原白蘭地中[21-22]。不同酵母菌株對(duì)芒果白蘭地醇類化合物的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，6種白蘭地中的醇類化合物含量由高到低依次為M＞A＞R＞P＞E＞C。6種白蘭地中，甲醇、正丙醇、異丁醇、活性戊醇、異戊醇在白蘭地中貢獻(xiàn)最大，是白蘭地香氣組成中非常重要的幾類化合物，也是構(gòu)成白蘭地骨架香氣的一部分[21]。異戊醇含量中M型酵母與P型酵母、R型酵母、E型酵母、C型酵母、A型酵母有顯著性差異（P＜0.05），異丁醇含量中R型酵母與P型酵母、A型酵母沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），正丙醇物質(zhì)含量中C型酵母與P型酵母、A型酵母、E型酵母、R型酵母有顯著性差異（P＜0.05）。

圖4 不同酵母菌株對(duì)芒果白蘭地醇類化合物的影響Fig.4 Effect of different yeast strains on alcohols in mango brandy

2.2.3 酯類化合物分析

酯類物質(zhì)是白蘭地?fù)]發(fā)性成分中最為豐富的物質(zhì)，是由酸類物質(zhì)和醇類物質(zhì)在蒸餾過(guò)程中經(jīng)過(guò)一系列的酯化反應(yīng)生成[23-24]。乙酸乙酯是6種白蘭地中含量最高的酯類物質(zhì)，也是白蘭地的骨架香氣成分之一[25-26]。乙酸乙酯具有香蕉、蘋果香氣，芳香帶甜味[27]。不同酵母菌株對(duì)芒果白蘭地酯類化合物的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，6種白蘭地中的酯類化合物含量由高到低依次為P＞E＞R＞M＞A＞C。6種白蘭地中貢獻(xiàn)較大的酯類物質(zhì)有乙酸乙酯、乙酸異戊酯，同時(shí)這2種物質(zhì)也是白蘭地中骨架香氣中比較重要的酯類物質(zhì)。對(duì)于乙酸乙酯含量，C型酵母與E型酵母、R型酵母、P型酵母有顯著性差異（P＜0.05）；對(duì)于乙酸異戊酯含量，E型酵母與C型酵母、A型酵母、M型酵母有顯著性差異（P＜0.05）。

圖5 不同酵母菌株對(duì)芒果白蘭地酯類化合物的影響Fig.5 Effect of different yeast strains on esters in mango brandy

2.2.4 醛酮類化合物分析

醛酮類物質(zhì)是構(gòu)成白蘭地整體香氣不可或缺的重要組成部分[28]。不同酵母菌株對(duì)芒果白蘭地醛酮類化合物的影響見(jiàn)圖6。由圖6可知，6種白蘭地中的醛酮類化合物含量由高到低依次為M＞P＞R＞E＞C＞A。乙醛和乙縮醛是6種白蘭地中共有的醛酮類物質(zhì)化合物，也是6種白蘭地含有的醛酮類物質(zhì)中貢獻(xiàn)最大的化合物。乙醛含量中E型酵母與C型酵母、A型酵母、R型酵母有顯著性差異（P＜0.05），乙縮醛含量中M型酵母與E型酵母、A型酵母有顯著性差異（P＜0.05）。但乙醛在這6種白蘭地中醛酮含量最高。相關(guān)的研究表明，白蘭地中的醛酮類化合物可能來(lái)源于水果原料，或釀造白蘭地的過(guò)程中，且這些醛酮類化合物對(duì)白蘭地的風(fēng)味有重要影響[29-30]。

圖6 不同酵母菌株對(duì)芒果白蘭地醛酮類化合物的影響Fig.6 Effect of different yeast strains on aldehydes and ketones in mango brandy

2.2.5 芳香類化合物分析

不同酵母菌株對(duì)芒果白蘭地芳香類化合物的影響見(jiàn)圖7。由圖7可知，6種白蘭地中的芳香類化合物含量由高到低依次為R＞P＞M＞E＞A＞C，主要表現(xiàn)在芳香類化合物含量的差異性。苯乙醇在這6種白蘭地中含量較高，R型酵母與A型酵母、C型酵母有顯著性差異（P＜0.05）。苯乙醇有清甜的玫瑰花香[31]，有研究認(rèn)為苯乙醇起主要的作用[32-33]，R型酵母中的苯乙醇含量最高，苯甲醛是白蘭地香氣成分中非常重要的芳香類化合物，具有典型水果的香氣[7]。

圖7 不同酵母菌株對(duì)芒果白蘭地芳香類化合物的影響Fig.7 Effect of different yeast strains on aromatic compounds in mango brandy

2.3 基于揮發(fā)性成分不同芒果白蘭地的主成分分析

為進(jìn)一步從整體上呈現(xiàn)6種白蘭地?fù)]發(fā)性物質(zhì)的差異，利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行主成分分析，按照剔除最小特征值的主成分對(duì)應(yīng)的最大特征向量的變量原則，然后一次剔除一個(gè)變量，利用剩余變量再進(jìn)行主成分分析，經(jīng)過(guò)有限次的剔除之后，直至第一主成分（PC1）、第二主成分（PC2）所構(gòu)成的信息量占總信息量的75%以上，相關(guān)矩陣的特征值見(jiàn)表2，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分矩陣見(jiàn)表3。由表2可知，提取的第一、二主成分方差貢獻(xiàn)率累計(jì)達(dá)到78.097%，其中第一主成分構(gòu)成的信息量占42.63%，第二主成分占35.47%。第一主成分和第二主成分對(duì)初始數(shù)據(jù)總方差的解釋率為78%，可以體現(xiàn)出不同的釀酒酵母釀造白蘭地的揮發(fā)性化合物成分信息。

表2 相關(guān)矩陣的特征值Table 2 Eigenvalues of the correlation matrix

表3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分矩陣Table 3 Matrix of volatile flavor substance composition

續(xù)表

6種不同酵母釀造的白蘭地樣品的主成分分析結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可知，不同酵母釀制的白蘭地分布在不同的象限。P和E風(fēng)味物質(zhì)組成相似性較高，對(duì)其影響較大的風(fēng)味物質(zhì)有乙酸乙酯、乙醛、甲酸乙酯、丙醛等。R和A風(fēng)味物質(zhì)組成具有一定的相似性，對(duì)其影響較大的物質(zhì)為乙酸、丙酸和硫酸，而M和C均獨(dú)立位于第一和三象限中，對(duì)C影響較大的物質(zhì)有蘋果酸、硫酸和甲酸乙酯等；M位于第一象限，苯乙酸乙酯、乳酸、棕櫚酸乙酯、甲醇、正丙醇等對(duì)M影響較大。其中第一主成分的代表指標(biāo)為甲醇（0.982）、正丙醇（0.962）、棕櫚酸乙酯（0.879），特征值為5.541，方差貢獻(xiàn)率為42.629%，是最為重要的主成分，反映了在M型酵母中揮發(fā)性化合物里方差貢獻(xiàn)率最高。第二主成分的代表指標(biāo)有丙醛（0.890）、乙酸乙酯（0.764）、乙醛（0.653），特征值為4.61，方差貢獻(xiàn)率為35.467%，主要反映了在P型酵母揮發(fā)性化合物里方差貢獻(xiàn)率最高。

圖8 基于揮發(fā)性風(fēng)味成分的不同酵母菌株制備的白蘭地樣品主成分分析結(jié)果Fig.8 Principal component analysis results of volatile flavor components in brandy samples prepared by different yeast strains

3 結(jié)論

本研究對(duì)6種不同的釀酒酵母發(fā)酵蒸餾得到6種不同的芒果白蘭地，然后采用感官評(píng)價(jià)和氣相色譜分析法進(jìn)行了分析檢測(cè)。可知C型酵母釀制的芒果白蘭地，香味濃郁且清香、口感甘冽，而其他酵母具有異味，口感不協(xié)調(diào)，酒體粗糙、粗劣等問(wèn)題。通過(guò)氣相色譜分析法可知C型酵母產(chǎn)生的酸類物質(zhì)含量較高，M型酵母產(chǎn)生的醇類和醛酮類物質(zhì)含量較高，P型酵母產(chǎn)生的酯類物質(zhì)含量較高，R型酵母產(chǎn)生的芳香類物質(zhì)含量較高，A型酵母與E型酵母產(chǎn)生的各類揮發(fā)性化合物含量均不突出。

所以最終選定釀酒酵母C型酵母作為釀造芒果白蘭地的最佳菌種。進(jìn)一步主成分分析得知，C型酵母釀制的白蘭地風(fēng)味物質(zhì)組成明顯區(qū)別于其他組，對(duì)其影響較大的風(fēng)味物質(zhì)主要是乙酸和甲酸乙酯。這對(duì)不同釀酒酵母的特點(diǎn)的研究以及其用于釀造優(yōu)質(zhì)的芒果白蘭地具有指導(dǎo)意義。