唐佳代，趙益梅*，冉光耀，王芙蓉，孟卓妮，龍亞飛，胡 娜

（1.茅臺(tái)學(xué)院 釀酒工程系，貴州 遵義 564500；2.貴州茅臺(tái)酒股份有限公司，貴州 遵義 564500）

醬香大曲是醬香型白酒生產(chǎn)所需的糖化發(fā)酵劑，在釀造過程中起到糖化、生香及投料等作用[1]。目前，大部分企業(yè)生產(chǎn)醬香大曲仍然秉承傳統(tǒng)釀造工藝，即人工踩曲，其生產(chǎn)成本高，生產(chǎn)效率較低。隨著科技進(jìn)步，機(jī)械化釀造醬香型白酒已成為發(fā)展趨勢，發(fā)展安全高產(chǎn)的機(jī)械化釀造模式勢在必行。醬香型白酒機(jī)械化生產(chǎn)多集中在高溫制曲工藝環(huán)節(jié)，傳統(tǒng)醬香大曲是將曲料倒入模具中，經(jīng)人工踩制而成。機(jī)械仿生壓曲采用自動(dòng)控制系統(tǒng)，對曲塊壓制成型進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控[2]。傳統(tǒng)人工踩曲與機(jī)械仿生壓曲兩種不同的壓曲工藝生產(chǎn)的醬香大曲中的微生物種類、理化指標(biāo)以及發(fā)酵性能存在差異[3]。有研究表明，不同壓曲工藝大曲的特性影響白酒的品質(zhì)，因此，解析其中微生物群落和理化指標(biāo)有助于評價(jià)醬香大曲品質(zhì)，并對醬香型白酒機(jī)械化釀造發(fā)展具有重要意義[4-6]。

基于基因組學(xué)技術(shù)直接研究其中微生物群落的全部微生物，無需分離單菌株，從而打破了大部分釀造微生物不可培養(yǎng)引起的對微生物群落片面化的研究局面[7]。相比于第一代測序技術(shù)成本高、速度慢、通量低，第二代測序技術(shù)通量較高，但讀長短，僅為30～450 bp，且擴(kuò)增易發(fā)生錯(cuò)配。第三代測序技術(shù)是一種具有成本低、速度快、通量高及讀長長等優(yōu)點(diǎn)的測序技術(shù)[7]。目前，常見的第三代測序技術(shù)為Oxford Nanopore的納米孔單分子、單分子脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）測序、單分子實(shí)時(shí)測序技術(shù)[8]。Oxford Nanopore納米孔單分子技術(shù)解鏈與測序同時(shí)進(jìn)行，該技術(shù)的核心為核酸外切酶與α-溶血素納米孔相耦合，且為保證監(jiān)測到每個(gè)堿基，需控制堿基穿過5 nm的納米孔的速度在1核苷酸/ms[9]。該技術(shù)特點(diǎn)是無需聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，避免堿基發(fā)生替換、偏置，且隨著測序深度增加及更正軟件的使用準(zhǔn)確率可達(dá)到99.9%[10]。

本研究采用納米孔單分子測序技術(shù)分析不同壓曲工藝醬香大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)，結(jié)合理化指標(biāo)評價(jià)機(jī)械仿生壓曲與傳統(tǒng)人工踩曲成品曲的品質(zhì)，以期掌握更多醬香型白酒中的微生物信息，為推進(jìn)機(jī)械化生產(chǎn)醬香型白酒奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

機(jī)械仿生壓曲AQ、傳統(tǒng)人工踩曲MQ：貴州省赤水河流域某酒廠成品曲（貯存時(shí)間為6個(gè)月）。取樣時(shí)間為2022年1月，該酒廠制曲車間中3個(gè)曲倉中成品曲各一塊，粉碎混合后用四分法進(jìn)行縮分取樣，備用。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉（分析純）：天津大茂化學(xué)試劑廠；硫酸（分析純）：川東化工集團(tuán)；己酸、乙醇、乙酸（均為分析純）：上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司；乙酸鈉（分析純）：南京化學(xué)試劑股份有限公司；DNA提取試劑盒：美國Zymo Research BIOMICS公司；MegaFi Fidelity DNA Polimerase：加拿大Applied Biological Materials Inc公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1204N電子天平：上海菁海儀器有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、HH-8J數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州潤華電器有限公司；DK-98-Ⅱ電爐：天津市泰斯特儀器有限公司；YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊醫(yī)療股份有限公司；BCD-640WAGM冷藏柜：青島海爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同壓曲工藝醬香大曲理化特性分析

按照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[11]對醬香大曲的水分含量、酸度、糖化力和淀粉含量進(jìn)行測定。

1.3.2 不同壓曲工藝醬香大曲微生物群落的高通量測序

機(jī)械仿生壓曲、傳統(tǒng)人工踩曲兩種壓曲工藝的醬香大曲樣品送至成都羅寧生物科技有限公司，使用DNA提取試劑盒提取樣品中的DNA，以其為模板，采用引物ITS1（5'-GGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS4（5'-AGCCTSCSCTTANTDATATGC-3'）PCR擴(kuò)增真菌內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internally transcribed spacer，ITS）基因序列；采用引物8F（5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）和1492R（5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）PCR擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA區(qū)域基因序列。真菌PCR擴(kuò)增體系：5×MegaFi Buffer 5 μL，10 mmol/L脫氧核糖核苷酸三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）0.5 μL，GSS Depletion Mix 2 μL，上游引物ITS3 1 μL，下游引物ITS4 1 μL，DNA模板2 μL，MegaFi DNA polymerase 0.5 μL，超純水13 μL。細(xì)菌PCR擴(kuò)增體系：5×MegaFi Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，上游引物8F 1 μL，下游引物1492R 1 μL，DNA模板2 μL，MegaFi DNA polymerase 0.5 μL，超純水15 μL。PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性5 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共25～30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸2 min；4 ℃保溫。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)，取線性期PCR產(chǎn)物等量混合后建庫。采用MinION Flow Cell測序試劑盒、Nanopore GridION Mk1測序儀測序。

1.3.3 高通量測序數(shù)據(jù)處理與分析

高通量測序所得序列通過使用NanoFilt去除、過濾掉低質(zhì)量序列，基于Uchime算法和gold數(shù)據(jù)庫去除嵌合體，得到有效數(shù)據(jù)（effiective tag）。使用生信物種注釋軟件Kraken2（http：//ccb.jhu.edu/software/kraken2/）對每一條序列進(jìn)行物種注釋，并統(tǒng)計(jì)物種數(shù)目?；赨NITE數(shù)據(jù)庫（8.2）和SILVA數(shù)據(jù)庫（138）進(jìn)行基因序列比對和注釋分析。使用Kraken2軟件進(jìn)行k-mer比對算法，直接進(jìn)行物種注釋：首先將序列切成若干k-mer；再將k-mer比對到物種分類數(shù)據(jù)庫上獲得其最低共同祖先（lowest common ancestor，LCA）；最后將相同的種，即操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）進(jìn)行合并統(tǒng)計(jì)，本研究沿用第二代測序以O(shè)TU作為一類高相似性序列集合的描述方式，但每個(gè)OTU對應(yīng)每個(gè)種。使用R語言（3.6.0）對樣品Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，用于衡量Alpha多樣性的指標(biāo)主要有Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。Chao1指數(shù)用于衡量樣本中物種的豐度，其數(shù)值與樣本物種總數(shù)成正比[12]。Shannon和Simpson指數(shù)用于綜合衡量樣本物種多樣性[13]，其數(shù)值越大代表群落多樣性越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同壓曲工藝醬香大曲理化特性分析

醬香大曲主要起到糖化、發(fā)酵、投糧和增香等作用[14]。生產(chǎn)實(shí)踐中，醬香大曲的酸度、糖化力、水分和淀粉含量常作為重要的理化指標(biāo)，用于衡量大曲品質(zhì)[15]。大曲酸度應(yīng)在0.10～0.35 mmol/g范圍，適宜的酸度能夠抑制雜菌生長，并為酯化反應(yīng)提供前體物質(zhì)[16]。酸度主要受產(chǎn)酸微生物代謝、脂肪與蛋白質(zhì)水解程度影響，酸度過高或過低均不利于釀造微生物生長繁殖[15]。糖化力指大曲中的淀粉酶將釀造原料中的淀粉水解為可發(fā)酵性糖類的能力，糖化力過高淀粉水解率增加，可能導(dǎo)致堆子升溫增快，從而不利于發(fā)酵，糖化力應(yīng)為（100～300）U[16]。醬香大曲水分含量需＜13%，既要保證微生物生長繁殖，又要避免因水分含量過高導(dǎo)致大曲發(fā)霉變質(zhì)[14]。地方標(biāo)準(zhǔn)DB52/T 871—2014《醬香型白酒釀酒用大曲》中規(guī)定醬香大曲中淀粉含量應(yīng)為53%～60%，大曲中淀粉在醬香型白酒多輪次發(fā)酵中起投糧作用[16]。不同壓曲工藝醬香大曲的理化指標(biāo)見表1。

表1 不同壓曲工藝醬香大曲的理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indexes of sauce-flavor Daqu with different molding processes

由表1可知，不同壓曲工藝醬香大曲樣品的水分含量、酸度與淀粉含量均符合地方標(biāo)準(zhǔn)DB52/T 871—2014《醬香型白酒釀酒用大曲》[16]。傳統(tǒng)人工踩曲MQ水分含量顯著高于機(jī)械仿生壓曲AQ（P＜0.05），大曲水分含量越高越不易貯存；機(jī)械仿生壓曲AQ的糖化力和淀粉含量均顯著高于傳統(tǒng)人工踩曲MQ（P＜0.05），機(jī)械仿生壓曲AQ能夠起到更好的糖化作用和投糧作用；機(jī)械仿生壓曲AQ的酸度略低于傳統(tǒng)人工踩曲MQ，分別為2.3 mmol/g、3.0 mmol/g，但無顯著差異（P＞0.05）。綜上所述，通過機(jī)械仿生壓曲制備的醬香大曲AQ品質(zhì)優(yōu)于傳統(tǒng)人工踩曲的醬香大曲MQ。

2.2 不同壓曲工藝醬香大曲微生物菌群測序結(jié)果分析

從不同壓曲工藝醬香大曲樣品中提取基因組DNA后，分別對ITS（16S rDNA）區(qū)基因序列進(jìn)行測序，通過雙端拼接、過濾嵌合體后共獲得70 826條（45 631條）有效序列，平均堿基長度為525 bp（1 379 bp）?；跈z測到的菌種繪制韋恩圖，結(jié)果見圖1。由圖1a可知，不同壓曲工藝醬香大曲樣品共有63個(gè)真菌菌種，機(jī)械仿生壓曲AQ樣品特有菌種為4個(gè)，序列數(shù)之和在總菌種的序列數(shù)中所占的比例為0.03%，傳統(tǒng)人工踩曲MQ中真菌菌種在機(jī)械仿生壓曲AQ樣品中均存在。由圖1b可知，不同壓曲工藝醬香大曲樣品中共有272個(gè)細(xì)菌菌種，機(jī)械仿生壓曲AQ和傳統(tǒng)人工踩曲MQ樣品特有細(xì)菌菌種分別為29個(gè)和26個(gè)，這些菌種的序列數(shù)之和在總菌種的序列數(shù)中所占的比例分別為0.18%、0.17%。結(jié)果表明，機(jī)械仿生壓曲AQ樣品中微生物菌種數(shù)多于傳統(tǒng)人工踩曲MQ樣品，且具有傳統(tǒng)人工踩曲MQ樣品中的所有真菌菌種。

圖1 不同壓曲工藝醬香大曲樣品真菌（a）及細(xì)菌（b）菌群的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of fungal (a) and bacterial (b) flora in sauceflavor Daqu samples with different molding processes

為了探索樣本物種豐富度隨測序深度的變化趨勢，從不同壓曲工藝醬香大曲樣品中隨機(jī)抽取一定數(shù)量序列數(shù)與序列所代表的物種數(shù)目，以抽取的一系列序列數(shù)和相應(yīng)的物種數(shù)繪制稀釋曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 不同壓曲工藝醬香大曲的物種數(shù)稀釋曲線Fig.2 Dilution curve of species number of sauce-flavor Daqu with different molding processes

由圖2可知，機(jī)械仿生壓曲AQ和人工踩曲MQ樣品的稀釋曲線前期急劇上升，隨著抽取序列數(shù)的增加后趨于平緩。結(jié)果表明，前期隨著抽取序列數(shù)的增加，檢出大量物種；當(dāng)抽檢數(shù)量達(dá)到15 000條序列后，物種不再隨測序數(shù)量增加而顯著增加，表明樣本測序量充分，測序結(jié)果能真實(shí)反映不同壓曲工藝醬香大曲的微生物多樣性。

2.3 不同壓曲工藝醬香大曲微生物菌群多樣性分析

不同壓曲工藝醬香大曲樣品微生物菌群的Alpha多樣性分析結(jié)果分別見表2及表3。由表2及表3可知，各醬香大曲樣本的Coverage數(shù)值均＞0.999，說明測序結(jié)果能夠真實(shí)的反映樣品物種豐度及物種多樣性[17]。在不同壓曲工藝醬香大曲樣品真菌和細(xì)菌菌群Alpha多樣性指數(shù)中，機(jī)械仿生壓曲AQ樣品的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均較高，說明機(jī)械仿生壓曲AQ中物種分布較傳統(tǒng)人工踩曲MQ更均勻、菌群多樣性更高。

表2 不同壓曲工藝醬香大曲樣品真菌菌群的Alpha多樣性分析結(jié)果Table 2 Alpha diversity analysis results of fungal flora of sauceflavor Daqu samples with different molding processes

表3 不同壓曲工藝醬香大曲樣品細(xì)菌菌群的Alpha多樣性分析結(jié)果Table 3 Alpha diversity analysis results of bacterial flora of sauceflavor Daqu samples with different molding processes

2.4 不同壓曲工藝醬香大曲微生物群落結(jié)構(gòu)分析

從機(jī)械仿生壓曲AQ與傳統(tǒng)人工踩曲MQ醬香大曲樣品中共檢測到63個(gè)真菌種，其中，相對豐度＞0.1%的真菌菌種見圖3a。由圖3a可知，兩種大曲樣品中相對豐度較高的菌種均為煙曲霉（Aspergillus fumigatus）（0.34%；0.46%）、微皺籃狀菌（Talaromyces rugulosus）（0.16%；0.15%）、米曲霉（Aspergillus oryzae）（0.19%；0.10%）。傳統(tǒng)人工踩曲MQ醬香大曲樣品中檢出的真菌均在機(jī)械仿生壓曲AQ醬香大曲樣品中檢出。

從機(jī)械仿生壓曲AQ與傳統(tǒng)人工踩曲MQ醬香大曲樣品中共檢測到272個(gè)細(xì)菌種，相對豐度排前20的細(xì)菌菌種見圖3b。由圖3b可知，兩樣品中相對豐度排前10的物種均為丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）（7.22%；6.78%）、綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）（3.90%；4.38%）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）（3.92%；4.00%）、假單胞桿菌（Pseudomonassp.）CC6-YY-74（3.12%；3.18%）、防御假單胞菌（Pseudomonas protegens）（2.70%；2.47%）、沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）（2.12%；2.56%）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）（2.15%；2.20%）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）（2.11%；2.00%），Pseudomonas silesiensis（1.87%；1.89%），貪噬菌屬（Variovoraxsp.）PMC12（2.04%；1.70%）。機(jī)械仿生壓曲AQ醬香大曲樣品中特有的相對豐度較高（相對豐度＞0.02%）的細(xì)菌種為普通擬桿菌（Bacteroides vulgatus）、Pseudomonas cerasi和人類產(chǎn)堿菌（Paenalcaligenes hominis）；傳統(tǒng)人工踩曲MQ醬香大曲樣品中特有的相對豐度較高（相對豐度＞0.02%）的細(xì)菌種為魏格沃斯菌（Wigglesworthia glossinidia）、發(fā)酵氨基酸球菌（Acidaminococcus fermentans）和Alteromonas australica。

圖3 基于種水平上不同壓曲工藝醬香大曲樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Microbial community structure of sauce-flavor Daqu samples with different molding processes based on the species level

3 討論

醬香型大曲的糖化力是保證醬香型白酒“多輪次”取酒和確保酒質(zhì)穩(wěn)定的關(guān)鍵，糖化力在300 U以下時(shí)，糖化力越高且淀粉含量高代表大曲能夠?qū)⒏嗟牡矸鬯鉃槟軌虮晃⑸锢玫目砂l(fā)酵性糖類[17]。醬香大曲的糖化力高低與大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)息息相關(guān)[18]，醬香大曲微生物群落結(jié)構(gòu)相關(guān)研究證實(shí)曲霉屬（Aspergillus）是醬香大曲中種類最為豐富的霉菌，可產(chǎn)生淀粉酶、糖化酶和纖維素酶等水解酶類[19-22]，糖化微生物的結(jié)構(gòu)與醬香大曲中糖化力相關(guān)[23-25]。本研究結(jié)果表明，傳統(tǒng)人工踩曲MQ與機(jī)械仿生壓曲AQ中相對豐度較高的真菌種均為曲霉屬（Aspergillus），包括煙曲霉（Aspergillus fumigatus）和米曲霉（Aspergillus oryzae），其中Aspergillus fumigatus具有較高的纖維素降解能力[26]，Aspergillus oryzae在醬香型白酒發(fā)酵過程中被證實(shí)為糖化菌株[27]。機(jī)械仿生壓曲AQ的糖化力高于傳統(tǒng)人工制曲，該結(jié)果與機(jī)械仿生壓曲AQ中物種分布更均勻、菌群多樣性更高相關(guān)。

4 結(jié)論

本研究采用第三代測序技術(shù)分析對比不同壓曲工藝醬香大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)，并以理化指標(biāo)為依據(jù)對比分析了不同壓曲工藝醬香大曲品質(zhì)。傳統(tǒng)人工踩曲MQ水分含量顯著高于機(jī)械仿生壓曲AQ（P＜0.05）；機(jī)械仿生壓曲AQ的糖化力和淀粉含量顯著高于傳統(tǒng)人工踩曲MQ（P＜0.05），機(jī)械仿生壓曲AQ的酸度與傳統(tǒng)人工踩曲MQ相近（P＞0.05），綜合來看，機(jī)械仿生壓曲AQ的糖化與投糧作用優(yōu)于傳統(tǒng)人工踩曲MQ，且機(jī)械仿生壓曲AQ水分含量較低更易貯存。

不同壓曲工藝醬香大曲樣品中共發(fā)現(xiàn)63個(gè)真菌和272個(gè)細(xì)菌菌種，機(jī)械仿生壓曲AQ樣品特有菌種為4個(gè)，其余59種真菌在傳統(tǒng)人工踩曲MQ與機(jī)械仿生壓曲AQ樣品中均被檢出。機(jī)械仿生壓曲AQ和傳統(tǒng)人工踩曲MQ樣品特有細(xì)菌菌種分別為29個(gè)和26個(gè)。在Alpha多樣性指數(shù)中，機(jī)械仿生壓曲AQ樣品的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均較高。機(jī)械仿生壓曲AQ中物種分布較為均勻、檢測出物種總數(shù)較高，且真菌與細(xì)菌群落多樣性和總數(shù)均高于傳統(tǒng)人工踩曲MQ。通過在UNITE和SILVA分類學(xué)數(shù)據(jù)庫比對，在不同壓曲工藝醬香大曲樣品中鑒別出相對豐度較高的真菌種均為煙曲霉（Aspergillus fumigatus）、微皺籃狀菌（Talaromycesrugulosus）和米曲霉（Aspergillusoryzae）；相對豐度較高的細(xì)菌種均為丁香假單胞菌（Pseudomonassyringae）、綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）、假單胞桿菌（Pseudomonassp.）CC6-YY-74、防御假單胞菌（Pseudomonas protegens）、沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、Pseudomonas silesiensis、貪噬菌屬（Variovoraxsp.）PMC12。綜合理化指標(biāo)和微生物群落結(jié)構(gòu)結(jié)果，機(jī)械仿生壓曲AQ的品質(zhì)要高于傳統(tǒng)人工踩曲MQ。

基于第三代測序技術(shù)與理化指標(biāo)測定，初步掌握不同壓曲工藝醬香大曲中微生物菌種概況，對比分析機(jī)械仿生壓曲與傳統(tǒng)人工踩曲生產(chǎn)的醬香大曲品質(zhì)。進(jìn)一步將開展不同壓曲工藝醬香大曲中微生物組學(xué)與酶學(xué)、風(fēng)味組的相關(guān)性研究，并為微生物資源開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。