高熳熳，胡江南，馬立娟，杜麗平*，田曉菊，張惠玲，楊偉明

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021；3.寧夏志輝源石葡萄酒莊有限公司，寧夏 銀川 750026）

葡萄汁發(fā)酵成葡萄酒是一個復(fù)雜的生化過程。過去，釀酒師常利用商業(yè)酵母進(jìn)行純種發(fā)酵，雖然可避免發(fā)酵遲緩或停滯的風(fēng)險(xiǎn)，但不能很好地體現(xiàn)葡萄酒的復(fù)雜性和典型性[1]。為了改善葡萄酒的風(fēng)味概況和地域風(fēng)格，滿足不同風(fēng)格和復(fù)雜程度的葡萄酒產(chǎn)品市場要求，一些能夠體現(xiàn)“地域特色”的本土非釀酒酵母菌（non-Saccharomyces cerevisiae）被應(yīng)用于葡萄酒發(fā)酵中。

畢赤克魯維酵母（Pichia kluyveri）作為非釀酒酵母中最受關(guān)注的菌種之一，在提高葡萄酒花香及果香特征方面具有極大的應(yīng)用潛力[2]。但因其酒精耐受力差，往往不能單獨(dú)完成酒精發(fā)酵，因此常將其與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）混合發(fā)酵來提高葡萄酒的品質(zhì)。DUTRAIVE O等[3]研究發(fā)現(xiàn)，將P.kluyveri與釀酒酵母混合發(fā)酵葡萄酒可顯著提高葡萄酒的總酯、甘油和戊酸濃度；GE Q等[4]研究發(fā)現(xiàn)，P.kluyveri可顯著增加葡萄酒芳樟醇、對二甲苯和橙花醇氧化物的含量。因此將具有優(yōu)良釀酒特性的本土非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵有助于體現(xiàn)葡萄酒的產(chǎn)區(qū)或地域典型性，對于避免產(chǎn)品同質(zhì)化、獲得高品質(zhì)葡萄酒，具有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究以‘赤霞珠’葡萄為原料，以分離篩選于寧夏銀川紅寺堡產(chǎn)區(qū)的優(yōu)良本土畢赤克魯維酵母和商業(yè)釀酒酵母作為發(fā)酵劑，探究混菌發(fā)酵對葡萄酒理化特性和香氣成分的影響，以期為發(fā)掘具有地域特性的優(yōu)良菌株及建立多菌種發(fā)酵工藝模式提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘赤霞珠’葡萄：于2021年10月3日購買于寧夏銀川，還原糖含量為280 g/L，可滴定酸（以酒石酸計(jì)）含量為4.98 g/L，pH 3.58。

畢赤克魯維酵母：篩選于寧夏銀川紅寺堡產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄表皮。釀酒酵母：法國LAMOTHE ABIET公司。

酵母浸粉：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；蛋白胨（分化試劑）：天津市英博生化試劑有限公司；葡萄糖（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；瓊脂粉（分化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉（分析純）：天津市北方化玻購銷中心；硫酸（分析純）：天津市化學(xué)試劑一廠；無水乙醇（色譜純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；4-甲基-2-戊醇（色譜純）：上海安譜試驗(yàn)科技股份有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，自然pH，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

PL403臺式離心機(jī)、S20 pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；ZXJD-A1270超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；L-550恒溫培養(yǎng)箱：湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭：美國Supelco公司；1100LC高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）、7890B-7000D氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、CP-WAX 57 CB色譜柱（60 m×0.25 mm×0.4 μm）、頂空固相微萃?。╤eadspace-solid phase microextraction technique，HS-SPME）裝置：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

將畢赤克魯維酵母接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃活化培養(yǎng)24 h，再重復(fù)活化一次，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。釀酒酵母按照產(chǎn)品說明進(jìn)行活化。

1.3.2 發(fā)酵試驗(yàn)

‘赤霞珠’葡萄除梗破碎后分裝于三角瓶中，70 ℃滅菌15 min。將活化好的菌株6 000 r/min離心5 min后收集菌體，經(jīng)0.9%的生理鹽水洗滌兩次后接入三角瓶中。畢赤克魯維酵母接種量為107CFU/mL，釀酒酵母的接種量為106CFU/mL，接種方式為順序接種，即先接種非釀酒酵母，48 h后再接種釀酒酵母，以畢赤克魯維酵母和釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵為對照（其中Mix表示畢赤克魯維酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵，Sc、Pk分別表示釀酒酵母、畢赤克魯維酵母單獨(dú)發(fā)酵），于25 ℃條件下靜置發(fā)酵，通過每天測定CO2質(zhì)量損失監(jiān)測發(fā)酵進(jìn)程，若連續(xù)兩天的質(zhì)量變化＜0.2 g，則認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后將酒樣10 000 r/min離心10 min，上清液用于后續(xù)分析，每個試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 測定方法

總糖、總酸、pH、揮發(fā)酸等：參照GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定；酒精度：參照GB 5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測定》。

甘油含量的測定：參照高瑩瑩等[5]的方法。色譜柱為Bio-Rad HPX-87H（300 mm×7.8 mm）；檢測器為示差折光檢測器（refractive index detector，RID）；流動相為5 mmol/L稀硫酸，流速為0.6 mL/min；檢測器溫度45 ℃，柱溫65 ℃，進(jìn)樣量20 μL。每個樣品重復(fù)3次。

有機(jī)酸含量的測定：使用高效液相色譜儀[6]（紫外檢測器）測定有機(jī)酸的含量。色譜柱為Aminex HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm），流動相為5 mmol/L稀硫酸，流速0.6 mL/min，柱溫60 ℃，進(jìn)樣體積20 μL，檢測波長為210 nm。每個樣品重復(fù)3次。

揮發(fā)性成分測定：采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）技術(shù)對葡萄酒香氣成分進(jìn)行檢測。

HS-SPME條件：取發(fā)酵樣品8 mL置于20 mL頂空瓶中，加入2.5 g NaCl和10 μL 4-甲基-2-戊醇（內(nèi)標(biāo)，2.055 g/L），60 ℃平衡15 min，萃取45 min。

GC-MS條件：CP-WAX 57 CB 色譜柱（60 m×0.25 mm×0.4 μm），萃取頭在進(jìn)樣口200 ℃解吸5 min，采用不分流模式進(jìn)樣，載氣為氦氣（＞99.99%），流速為1.0 mL/min，程序升溫：初始溫度40 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升至100 ℃，以4 ℃/min升至190 ℃，保持5 min，總運(yùn)行時間59.5 min。質(zhì)量選擇檢測器（mass selective detector，MSD）傳輸線250 ℃，質(zhì)譜選擇SCAN模式進(jìn)行掃描。質(zhì)譜結(jié)果利用美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）14譜庫進(jìn)行各揮發(fā)性物質(zhì)的定性，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.3.4 葡萄酒感官評價

葡萄酒感官品評小組由10名（5名男性，5名女性）天津科技大學(xué)葡萄酒專業(yè)老師和學(xué)生組成，每位品嘗員均經(jīng)過專業(yè)品評培訓(xùn)，分別從濃郁度、果香味、花香味、余味、生青味、酸味這6個方面對酒樣進(jìn)行評價，以8分結(jié)構(gòu)數(shù)值量化為標(biāo)準(zhǔn)。感官分析過程中，每一供試酒樣重復(fù)分析3次。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Office 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；SPSS 23.0軟件對不同發(fā)酵處理酒樣的理化指標(biāo)及揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行單因素方差分析，鄧肯法（Duncan）進(jìn)行事后多重比較，P＜0.05表示差異顯著；用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵組發(fā)酵動力學(xué)曲線

不同發(fā)酵組發(fā)酵動力學(xué)曲線見圖1。由圖1可知，釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵組（Sc）的起酵速度比混合發(fā)酵組（Mix）快。與畢赤克魯維酵母（Pk）單獨(dú)發(fā)酵相比，接種釀酒酵母使混合發(fā)酵組（Mix）發(fā)酵速度加快。Sc組和Mix組都在第9天完成發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束時，Sc組釋放15.53 g CO2，Mix組釋放17.13 g CO2。而Pk組發(fā)酵速度緩慢，到后期停止發(fā)酵，說明其發(fā)酵能力較弱，不能單獨(dú)完成酒精發(fā)酵。

圖1 不同發(fā)酵組發(fā)酵動力學(xué)曲線Fig.1 Fermentation kinetics curves of different fermentation groups

2.2 葡萄酒基本理化指標(biāo)分析

不同發(fā)酵組酒精發(fā)酵結(jié)束后酒樣的基本理化指標(biāo)見表1。由表1可知，Sc組和Mix組酒樣中殘?zhí)呛繛?.58 g/L、1.61 g/L，均低于4 g/L；酒精含量為12.33%vol、12.08%vol，說明Sc組和Mix組均完成了酒精發(fā)酵，且兩組之間殘?zhí)呛亢途凭繜o顯著差異。而Pk組的殘?zhí)呛枯^高，為74.00 g/L；酒精含量僅為6.46%vol，是因?yàn)槠洳荒塥?dú)立完成酒精發(fā)酵，未能充分利用糖，與其他兩組差異顯著。葡萄酒的pH值一般為2.8～3.8，過高容易遭到微生物的侵害，過低則葡萄酒的口感較為酸澀，本試驗(yàn)中3個酒樣的pH值均在此范圍內(nèi)。揮發(fā)酸是由微生物產(chǎn)生的腐敗代謝產(chǎn)物之一，其含量過高會給葡萄酒帶來一定負(fù)面影響[7]。目前國內(nèi)外都對葡萄酒中的揮發(fā)酸含量作出了嚴(yán)格規(guī)定，GB 15037—2006《葡萄酒》對干紅葡萄酒揮發(fā)酸含量的要求是≤1.2 g/L（以醋酸計(jì)），試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與Sc組相比，Pk組和Mix組酒樣的揮發(fā)酸含量增加明顯（P＜0.05），但均在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，說明該株畢赤克魯維酵母產(chǎn)揮發(fā)酸的能力較強(qiáng)。

表1 不同發(fā)酵組‘赤霞珠’葡萄酒基本理化指標(biāo)Table 1 Basic physicochemical indexes of 'Cabernet Sauvignon'wine in different fermentation groups

2.3 甘油含量分析

甘油（glycerol）是酵母酒精發(fā)酵的主要副產(chǎn)物之一，通過酵母的糖代謝途徑產(chǎn)生，具有一定的甜味，可使葡萄酒口感圓潤，并增加口感的復(fù)雜性。如圖2所示，與Sc組相比，Pk組和Mix組酒樣的甘油含量增加明顯（P＜0.05），尤其是Mix組，甘油含量增加了3.06 g/L，說明畢赤克魯維酵母產(chǎn)甘油能力較強(qiáng)，這與DUTRAIVE O等[3]的研究結(jié)果一致。

圖2 不同發(fā)酵組‘赤霞珠’葡萄酒甘油含量Fig.2 Glycerol content of 'Cabernet Sauvignon' wines in different fermentation groups

2.4 有機(jī)酸含量分析

葡萄酒中的有機(jī)酸可對葡萄酒的穩(wěn)定性、陳釀特性和感官質(zhì)量產(chǎn)生較大影響。不同發(fā)酵組酒精發(fā)酵結(jié)束后酒樣的有機(jī)酸含量見表2。由表2可知，Sc組和Mix組的蘋果酸含量無明顯差別，而Pk組的蘋果酸含量高于其他兩組，這可能與畢赤克魯維酵母未完成酒精發(fā)酵相關(guān)；琥珀酸復(fù)雜的味感能夠呈現(xiàn)葡萄酒的醇厚感，其中Sc組的琥珀酸含量最高，其次是Mix組和Pk組，說明混菌發(fā)酵并未對琥珀酸含量產(chǎn)生較大影響；此外對于酒石酸和乳酸含量，三個發(fā)酵組無明顯差異。

表2 不同發(fā)酵組‘赤霞珠’葡萄酒有機(jī)酸含量Table 2 Organic acid content of 'Cabernet Sauvignon' wine in different fermentation groups

2.5 香氣成分分析

葡萄酒品質(zhì)與其揮發(fā)性香氣成分密切相關(guān)[8]。不同發(fā)酵組的葡萄酒香氣成分見表3。

由表3可知，在所有葡萄酒樣中共檢測分析出36種香氣物質(zhì)，其中包括16種醇類、13種酯類、3種酸類和4種醛酮類。

表3 不同發(fā)酵組‘赤霞珠’葡萄酒香氣成分Table 3 Volatile compounds of 'Cabernet Sauvignon' wine in different fermentation groups

續(xù)表

高級醇的含量對葡萄酒的品質(zhì)具有較大影響，當(dāng)其含量低于300 mg/L時能夠使葡萄酒的香氣更加豐富，但當(dāng)其總含量超過400 mg/L時，就會給人帶來強(qiáng)烈的刺鼻味和不悅感[20]。試驗(yàn)3個發(fā)酵組酒樣中高級醇的含量分別為

85.74 mg/L、237.04 mg/L、285.44 mg/L，可對葡萄酒產(chǎn)生積極影響。接種畢赤克魯維酵母則會使高級醇含量降低16.96%，這與夏鴻川等[21]的研究結(jié)果相符。同時，與Sc組相比，Mix組可以提高苯甲醇的含量，進(jìn)而給葡萄酒帶來甜味，且Mix組中苯乙醇含量占高級醇總量的47.39%，可給葡萄酒帶來蜂蜜、玫瑰、丁香花等宜人香味。

酯類是葡萄酒果香的主要貢獻(xiàn)者[22]。本試驗(yàn)酒樣中鑒定出13種酯類物質(zhì)，其中Mix組和Sc組共有8種達(dá)到其閾值，包括乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、9-癸烯酸乙酯和十二烷酸乙酯。同時，與Sc組相比，Mix組可以顯著提高乙酸乙酯（8.90倍）、乙酸異戊酯（1.38倍）和乙酸苯乙酯（1.81倍）含量。當(dāng)乙酸乙酯含量超過150 mg/L時，可產(chǎn)生“指甲油去除劑”的異味，但本試驗(yàn)中Mix組乙酸乙酯含量為36.91 mg/L，可為葡萄酒帶來甜味和水果香；乙酸異戊酯可為葡萄酒增添果香和香蕉香，Mix組中乙酸異戊酯的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其閾值；乙酸苯乙酯是一種特殊的芳香化合物，當(dāng)其含量超過0.25 mg/L時，能夠給葡萄酒增添玫瑰花的芳香[23]，而Mix組中乙酸苯乙酯含量可達(dá)10.03 mg/L，說明畢赤克魯維酵母的添加可為葡萄酒的香氣作出重要貢獻(xiàn)，這與WHITENER M E B等[24]的研究結(jié)果一致。此外，Pk組和Mix組中都產(chǎn)生了Sc組所沒有的十六烷酸乙酯，其可為葡萄酒帶來奶油香，豐富葡萄酒的香氣成分。

葡萄酒的品質(zhì)受酸類化合物的影響，其中對葡萄酒的香氣起著重要貢獻(xiàn)作用的是飽和脂肪酸，在其接近氣味閾值時能夠增加葡萄酒香氣的豐富性。然而在過高的濃度下，會給葡萄酒帶來“汗味”、“腐臭”和“脂肪”等氣味[25]。Mix組辛酸含量下降，可減少其帶來的黃油味和苦杏仁味。同時Mix組的苯甲醛和3,5-二甲基苯甲醛含量增加，為葡萄酒提供櫻桃及薔薇花香。

利用TBtools v1.0692軟件對3個不同發(fā)酵處理的赤霞珠葡萄酒中香氣成分進(jìn)行熱圖聚類分析，探究不同發(fā)酵處理下赤霞珠葡萄酒中主要香氣成分間差異。由圖3可知，36種香氣成分被聚為3類。

圖3 不同發(fā)酵組‘赤霞珠’葡萄酒香氣成分聚類分析熱圖Fig.3 Clustering analysis heat map of aroma components of'Cabernet Sauvignon'wine in different fermentation group

第一類香氣成分主要是由畢赤克魯維單獨(dú)發(fā)酵產(chǎn)生的，包括2,3-丁二醇、乙酸乙酯、乙酸等9種物質(zhì)，其中2,3-丁二醇、乙酸乙酯和乙酸異戊酯主要表現(xiàn)為果香和花香，但乙酸含量較高，影響了葡萄酒的風(fēng)味。第二類香氣成分主要是由釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵產(chǎn)生的，包括異戊醇、苯乙醇、丁二酸二乙酯、9-癸烯酸乙酯等14種物質(zhì)，其香氣成分主要表現(xiàn)為花香、果香、奶油和脂肪的香氣等，增加了葡萄酒香氣的豐富性和愉悅性。其中苯乙醇含量顯著高于Pk組和Mix組，其含量是其香氣閾值的8.48倍，給葡萄酒帶來了蜂蜜、玫瑰和丁香花的香氣；辛酸乙酯含量是其香氣閾值的422倍，給葡萄酒帶來了濃郁的果香。第三類香氣成分在Mix組中含量較高，主要包括乙酸苯乙酯、苯甲醇等，其中乙酸苯乙酯含量顯著高于Pk組和Sc組，可為葡萄酒帶來熱帶水果、玫瑰和蜂蜜的香氣。畢赤克魯維的參與顯著改變了葡萄酒的香氣成分組成，其在葡萄酒整體香氣形成中的作用有待深入研究。

2.6 感官分析

各試驗(yàn)組酒樣的感官分析雷達(dá)圖（圖4）表明，Mix組的余味、濃郁度、果香和花香得分均高于Sc組，顯著高于Pk組（P＜0.05）。這是因?yàn)楫叧嗫唆斁S酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵后顯著增加了葡萄酒中酯類物質(zhì)的含量（P＜0.05），尤其是乙酸乙酯和乙酸苯乙酯，賦予了葡萄酒濃郁的花香和果香。而畢赤克魯維酵母由于不能單獨(dú)完成酒精發(fā)酵，感官得分較低。綜上，畢赤克魯維酵母與釀酒酵母共接種發(fā)酵有利葡萄酒品質(zhì)的提升。

圖4 不同發(fā)酵組‘赤霞珠’葡萄酒感官分析雷達(dá)圖Fig.4 Sensory analysis radar map of 'Cabernet Sauvignon' wine in different fermentation groups

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選用‘赤霞珠’葡萄為原料，畢赤克魯維酵母和釀酒酵母為發(fā)酵劑，目的在于研究本土畢赤克魯維酵母對‘赤霞珠’葡萄酒相關(guān)釀酒參數(shù)、香氣成分和感官特性的影響。研究發(fā)現(xiàn)，本土畢赤克魯維酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵能夠增加葡萄酒的甘油含量，同時增加葡萄酒酯類揮發(fā)性香氣物質(zhì)的含量，尤其是乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯，給葡萄酒帶來較多的花香。感官評價結(jié)果也表明混合發(fā)酵的葡萄酒果香味和花香味較為濃郁，口感較好。綜上，本土畢赤克魯維酵母有利于提升葡萄酒品質(zhì)。后續(xù)可進(jìn)一步對工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，為生產(chǎn)具有地域特色的優(yōu)質(zhì)葡萄酒提供參考依據(jù)。