韓 勇

（山西藥科職業(yè)學(xué)院，山西太原 030031）

植物揮發(fā)油又稱為植物精油（王建寶等，2011），是存在于植物中的次生代謝物（何敏等，2015），是一類揮發(fā)性油狀物質(zhì)（吳迪等，2018）。植物揮發(fā)油已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、養(yǎng)殖、日用品等行業(yè)（鄧永飛等，2020；陳衛(wèi)東等，2019；任澎等，2018；李冰等，2017）。其中具有抑菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等生物活性的植物揮發(fā)油，在食品、飼料等領(lǐng)域呈現(xiàn)出良好的發(fā)展?jié)摿Γㄍ跹?021；李娜等，2021；汪天龍等，2020）。

水蔓菁（Veronica linariifolia）是玄參科婆婆納屬的全草（李夢(mèng)等，2019），味苦、性微寒（張子梅等，2011）。水蔓菁在民間有長(zhǎng)期廣泛的食用和藥用習(xí)慣（張阜炳等，2019）?，F(xiàn)有研究表明，其主要化學(xué)組成有揮發(fā)油、黃酮類、酚類化合物等成分，其中揮發(fā)油是水蔓菁的主要組成成分之一（韓勇，2021）。水蔓菁揮發(fā)油具有祛痰、鎮(zhèn)咳等活性（李峰，2002）。但目前對(duì)于其抗氧化的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。研究表明，具有抗氧化性的揮發(fā)油用于動(dòng)物養(yǎng)殖生產(chǎn)，可有效降低動(dòng)物的氧化應(yīng)激（溫鵬飛等，2017）。高油食品及油脂在食用前易氧化、水解而酸敗變質(zhì)，因此需要使用抗氧化劑（周孟倩，2009）。本研究采用超聲波法提取水蔓菁中的揮發(fā)油成分，運(yùn)用響應(yīng)面試驗(yàn)分析方法優(yōu)化了水蔓菁揮發(fā)油的超聲提取工藝，并通過(guò)測(cè)定水蔓菁揮發(fā)油的DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率、總還原力，對(duì)超聲波法提取所得揮發(fā)油的抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，旨在為充分有效的利用水蔓菁揮發(fā)油資源提供試驗(yàn)參考，并有望成為食品和飼料的新型天然抗氧化劑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 水蔓菁，采于山西省運(yùn)城市萬(wàn)榮縣。無(wú)水乙醇、無(wú)水硫酸鈉、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、抗壞血酸、硫酸亞鐵、水楊酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵等，均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器DXF-02C型手提式粉碎機(jī)，廣州市大祥電子機(jī)械設(shè)備有限公司；UV3000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；FK124型電子分析天平，北京朗科興業(yè)稱重設(shè)備有限公司；TL-650CT多用途恒溫超聲波提取機(jī)，江蘇天翎儀器有限公司。

1.3 水蔓菁揮發(fā)油提取 使用粉碎機(jī)將水蔓菁粉碎成細(xì)粉，精確稱取10.0 g水蔓菁粉末置于提取燒杯中，按照液料比5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1（mL/g）加入無(wú)水乙醇，在提取溫度30、40、50、60、70、80℃下，用超聲波法提取，提取時(shí)間分別為20、30、40、50、60、70 min。提取液過(guò)濾，將濾液減壓干燥，加入無(wú)水硫酸鈉后過(guò)濾，得水蔓菁揮發(fā)油。將水蔓菁揮發(fā)油提取率作為試驗(yàn)指標(biāo)，研究評(píng)價(jià)超聲波提取法中的液料比、提取溫度和超聲時(shí)間對(duì)水蔓菁揮發(fā)油提取效果的影響。

通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)分析方法中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化超聲波法提取水蔓菁揮發(fā)油的最佳條件。提取優(yōu)化試驗(yàn)的自變量為液料比（A）、提取溫度（B）和超聲時(shí)間（C），試驗(yàn)的響應(yīng)值為水蔓菁揮發(fā)油提取率（Y），響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

使用Design Expert試驗(yàn)分析軟件來(lái)分析優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)，水蔓菁揮發(fā)油提取率（Y）為試驗(yàn)指標(biāo)，計(jì)算公式如下：

式中：m1為水蔓菁細(xì)粉質(zhì)量，g；m2為水蔓菁揮發(fā)油質(zhì)量，g。

1.4 抗氧化試驗(yàn)

1.4.1 清除DPPH自由基 用無(wú)水乙醇配制成不同 濃 度 的 水 蔓 菁 揮 發(fā) 油 溶 液（2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg/mL），將3 mL水蔓菁揮發(fā)油溶液與3 mL DPPH試劑溶液在暗處充分混合，25℃下混合液避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)吸光值（A1），用無(wú)水乙醇代替DPPH試劑溶液，測(cè)吸光值（A2），用無(wú)水乙醇代替水蔓菁揮發(fā)油溶液，測(cè)吸光值（A0），抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照（敢小雙等，2018）。DPPH自由基清除率的計(jì)算公式如下：

1.4.2 清除羥基自由基 取不同濃度的水蔓菁揮發(fā)油溶液2 mL，加入2 mL 6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液，2 mL 6 mmol/L的過(guò)氧化氫溶液，混勻后室溫靜置10 min，再加入2 mL 6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，混勻后于50℃保溫30 min，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值（A1），用無(wú)水乙醇代替水楊酸，測(cè)吸光值（A2），用無(wú)水乙醇代替水蔓菁揮發(fā)油溶液，測(cè)吸光值（A0），抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照（李曉娟等，2021）。羥基自由基清除率的計(jì)算公式如下：

1.4.3 還原力測(cè)定 取不同濃度的水蔓菁揮發(fā)油溶液2 mL，加入2 mL pH為6.6的磷酸鹽緩沖液和2 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后50℃保溫20 min，再加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸，混勻后3000 r/min離心10 min，取上清液2 mL，加入2 mL蒸餾水和1 mL 0.1%的三氯化鐵，反應(yīng)10 min后在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值，抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照（羅敏等，2018）。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)油提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 液料比對(duì)水蔓菁揮發(fā)油提取率的影響 由圖1可知，增加溶液的液料比，水蔓菁揮發(fā)油提取率不斷增加。液料比大于15:1（mL/g）后，提取率增加輻度較小，原因可能是溶液總量較多，揮發(fā)油的濃度相對(duì)下降，導(dǎo)致超聲波提取的效率降低，不能完全提取水蔓菁中的揮發(fā)油成分，因此確定提取液的液料比為15:1（mL/g）。

圖1 液料比對(duì)水蔓菁揮發(fā)油提取率的影響

2.1.2 提取溫度對(duì)水蔓菁揮發(fā)油提取率的影響由圖2可知，隨著提取溫度的升高，水蔓菁揮發(fā)油提取率持續(xù)增加，當(dāng)溶液的提取溫度超過(guò)50℃以后，揮發(fā)油提取率增加不顯著，而且隨著溶液溫度的提高，增加了水蔓菁揮發(fā)油和乙醇的揮發(fā)量，也可能增加溶液中雜質(zhì)的溶出，因而確定提取溫度為50℃。

圖2 提取溫度對(duì)水蔓菁揮發(fā)油提取率的影響

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)水蔓菁揮發(fā)油提取率的影響由圖3可知，當(dāng)溶液的超聲時(shí)間為30 min時(shí)，水蔓菁揮發(fā)油提取率達(dá)最高值，繼續(xù)增加超聲時(shí)間，揮發(fā)油提取率將緩慢降低，可能是在超聲提取過(guò)程中，由于超聲時(shí)間增加，溶液的雜質(zhì)溶出較多，從而影響揮發(fā)油的提取，因此確定超聲時(shí)間為30 min。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)水蔓菁揮發(fā)油提取率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)揮發(fā)油提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行響應(yīng)面的Box-Behnken設(shè)計(jì)分析優(yōu)化試驗(yàn)。分析優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表2，優(yōu)化試驗(yàn)的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 Box-Behnke試驗(yàn)結(jié)果

表3 Box-Behnke試驗(yàn)方差分析

使用試驗(yàn)分析軟件分析優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)，獲得回歸模型方程：

回歸方程R2為0.9803，回歸模型P值<0.0 001為極顯著可靠，失擬項(xiàng)P值>0.05為不顯著，CV%為1.81，信噪比為20.171，均表明試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷念A(yù)測(cè)值與優(yōu)化試驗(yàn)值高度相關(guān)，所得回歸模型可用來(lái)分析優(yōu)化水蔓菁揮發(fā)油的超聲波提取條件。由表2結(jié)果可知，在影響揮發(fā)油提取率的提取條件中，影響效果是提取溫度＞液料比＞超聲時(shí)間。

對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)分析方法所得回歸模型進(jìn)行數(shù)據(jù)診斷，得模型數(shù)據(jù)診斷圖（圖4）。殘差正態(tài)概率見(jiàn)圖4A，試驗(yàn)所得殘差沒(méi)有偏離方差，符合正態(tài)分布規(guī)律。殘差與預(yù)測(cè)值對(duì)應(yīng)關(guān)系見(jiàn)圖4B，試驗(yàn)殘差與模型預(yù)測(cè)值呈現(xiàn)無(wú)規(guī)律且較分散情況。殘差與運(yùn)行數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)關(guān)系見(jiàn)圖4C，試驗(yàn)殘差與運(yùn)行數(shù)據(jù)也呈現(xiàn)無(wú)規(guī)律且較分散情況，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)的殘差范圍均在±3之內(nèi)。預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值對(duì)應(yīng)關(guān)系見(jiàn)圖4D，模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際試驗(yàn)值對(duì)應(yīng)關(guān)系良好，所得數(shù)據(jù)均接近直線分布。模型數(shù)據(jù)診斷圖充分表明回歸模型可靠性高，擬合程度好，可用來(lái)對(duì)水蔓菁揮發(fā)油的超聲波提取條件進(jìn)行分析優(yōu)化（張守花等，2021）。

圖4 模型數(shù)據(jù)診斷圖

根據(jù)回歸模型的數(shù)據(jù)分析，得到自變量交互作用的響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化分析圖（圖5），反映了不同因素交互作用對(duì)揮發(fā)油提取率的影響。

圖5 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化分析圖

通過(guò)試驗(yàn)分析軟件，得水蔓菁揮發(fā)油提取工藝的最優(yōu)條件為液料比16.62:1（mL/g）、提取溫度52.63℃、超聲時(shí)間29.69 min。響應(yīng)面試驗(yàn)預(yù)測(cè)的揮發(fā)油提取率為1.14%。結(jié)合實(shí)際的超聲波提取工藝操作，將揮發(fā)油提取的最佳條件優(yōu)化為液料比16.6:1（mL/g）、提取溫度53℃、超聲時(shí)間30 min。在此試驗(yàn)條件下，進(jìn)行3次揮發(fā)油提取平行試驗(yàn)，揮發(fā)油平均提取率為1.13%。

2.3 抗氧化試驗(yàn)

2.3.1 水蔓菁揮發(fā)油溶液對(duì)DPPH自由基的清除率試驗(yàn) 由圖6可知，隨著揮發(fā)油濃度的增加，對(duì)DPPH自由基的清除率逐漸增強(qiáng)。當(dāng)揮發(fā)油濃度為8 mg/mL時(shí)，清除率較高且穩(wěn)定，當(dāng)揮發(fā)油濃度為12 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到88.5%。但清除作用略小于抗壞血酸（Vc）。結(jié)果表明，水蔓菁揮發(fā)油在一定濃度下，對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除能力。

圖6 清除DPPH自由基

2.3.2 水蔓菁揮發(fā)油溶液對(duì)羥基自由基的清除率試驗(yàn) 由圖7可知，羥基自由基的清除率隨著揮發(fā)油濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，當(dāng)揮發(fā)油濃度為12 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到82.7%。結(jié)果表明，揮發(fā)油達(dá)到一定濃度時(shí)，對(duì)羥基自由基有較強(qiáng)的清除能力。與同濃度Vc相比較，揮發(fā)油對(duì)羥基自由基的清除率比Vc要略低。

2.3.3 水蔓菁揮發(fā)油還原力測(cè)定試驗(yàn) 由圖8可知，水蔓菁揮發(fā)油具有較好的還原力，隨著揮發(fā)油濃度的持續(xù)增加，還原力也不斷增強(qiáng)。與同濃度Vc相比較，揮發(fā)油的還原力比Vc要略低，但揮發(fā)油在較高濃度時(shí)，也表現(xiàn)出良好的還原力。

圖8 還原力測(cè)定

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)超聲波法對(duì)水蔓菁中的揮發(fā)油成分進(jìn)行了提取分離，運(yùn)用響應(yīng)面試驗(yàn)分析優(yōu)化方法對(duì)揮發(fā)油提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。得到最優(yōu)的揮發(fā)油提取參數(shù)為液料比16.6:1（mL/g）、提取溫度53℃、超聲時(shí)間30 min，在此提取條件下，水蔓菁揮發(fā)油提取率為1.13%?？寡趸囼?yàn)結(jié)果表明，抗氧化活性隨著水蔓菁揮發(fā)油濃度的提高而增強(qiáng)，揮發(fā)油濃度為12 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率為88.5%，對(duì)羥基自由基的清除率為82.7%，并表現(xiàn)出較強(qiáng)的還原力。超聲波法提取所得水蔓菁揮發(fā)油具有良好的抗氧化能力。