馬鴻志，武文宇，于子強(qiáng)，趙繼華，高 明，汪群慧

1) 北京科技大學(xué)能源與環(huán)境工程學(xué)院環(huán)境科學(xué)與工程系，北京 100083 2) 工業(yè)典型污染物資源化處理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083

隨著有機(jī)廢物處理壓力的日益增大，開發(fā)合適的有機(jī)廢物資源化技術(shù)迫在眉睫[1].微生物合成己酸是一種基于羧酸平臺的技術(shù)，將短鏈的醇、酸通過厭氧發(fā)酵中的β 氧化逆循環(huán)進(jìn)行碳鏈延長，合成高價值的己酸[2].β 氧化逆循環(huán)是一種在乙酰輔酶A 輔助下，通過逆β 氧化將羧酸的碳鏈每次延長兩個碳的厭氧代謝途徑.每次逆β 氧化為一個循環(huán)，其中代謝模式與相關(guān)酶基本一致.以乙酸為例，乙酸在第一次逆β 氧化中被乙酰輔酶A 延長碳鏈為丁酸，之后丁酸在第二次逆β 氧化中被乙酰輔酶A 延長為己酸.

在己酸合成過程中，合適的微生物十分重要，以純菌（如以乙醇為底物的克氏梭菌(Clostridium kluyveri)和以乳酸為底物的埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdeniiin)）為接種物，以乙醇、乳酸以及乙酸為底物的微生物合成己酸技術(shù)已較為成熟[3].近年來，以低成本混菌為接種物，以實(shí)際有機(jī)廢物為底物的微生物合成己酸技術(shù)在資源化領(lǐng)域取得了一定的成就.Wu 等[4]將富含乳酸、乙醇的中國釀酒廢水作為底物，以釀酒廠窖泥與污水處理廠剩余污泥作為混合接種物，進(jìn)行了序批式實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)物中己酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到了59.23%，產(chǎn)量為5.55 g·L-1，實(shí)現(xiàn)了釀酒廢水與剩余污泥的資源化.Zhu 等[5]將富含乳酸的黃水為底物，以釀酒廠窖泥為接種物，在序批式反應(yīng)器中三次增添底物，己酸產(chǎn)量達(dá)到23 g·L-1，產(chǎn)物中己酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到了84.74%.劉春梅[6]以果蔬垃圾發(fā)酵液為底物，以污泥為接種物，在乙醇與果蔬垃圾發(fā)酵液質(zhì)量比為4∶1，pH值為7.5 的條件下，己酸產(chǎn)量達(dá)到了14.9 g·L-1.

盡管微生物合成己酸在有機(jī)廢物資源化領(lǐng)域得到了一定的成果，但仍存在著影響因素過多、產(chǎn)量較低等問題[7].目前的研究多介紹微生物合成己酸過程中的功能微生物、底物種類以及產(chǎn)物產(chǎn)率[8-9].同時，在機(jī)理描述時往往忽略各反應(yīng)步驟之間的能量代謝與還原酶的供給關(guān)系[10].β 氧化逆循環(huán)過程中涉及多個與能量代謝相關(guān)的步驟，以及與熱力學(xué)相關(guān)的還原酶供給關(guān)系，對能量代謝與還原酶供給關(guān)系的明確有助于明晰反應(yīng)機(jī)理，提高產(chǎn)物產(chǎn)率.本研究將介紹碳鏈延長的基本原理，并開展對碳鏈延長過程中的能量、還原酶供給關(guān)系的分析，結(jié)合研究現(xiàn)狀介紹微生物合成己酸過程中的兩種典型影響因素：pH 與頂空氣體，并分析其作用機(jī)理.綜述生物電化學(xué)強(qiáng)化己酸合成的研究進(jìn)展，探討該技術(shù)目前的局限性以及未來的發(fā)展方向，以期提供將己酸產(chǎn)率提高的策略.

1 微生物合成己酸途徑與能量、還原酶的供給關(guān)系

微生物合成己酸是通過β 氧化逆循環(huán)實(shí)現(xiàn)的，在這個過程中發(fā)生了電子供體的氧化與電子受體的還原.一般常用乙醇與乳酸作為電子供體，乙酸作為電子受體.由于乙醇與乳酸的代謝途徑不同，將分別進(jìn)行討論，并探討其中的競爭途徑.此外，將對電子受體的還原以及整個β 氧化逆循環(huán)過程中的能量代謝與還原酶的供給關(guān)系進(jìn)行分析.

1.1 乳酸作為電子供體的氧化過程

圖1 為乳酸作為電子供體參與β 氧化逆循環(huán)的代謝途徑，乳酸首先被乳酸脫氫酶氧化為丙酮酸，之后與發(fā)酵液中的輔酶A 結(jié)合生成乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）.值得注意的是，在乳酸厭氧發(fā)酵過程中，存在著競爭途徑.當(dāng)乳酸濃度過高時，乳酸會被轉(zhuǎn)化為丙烯酰輔酶A，從而進(jìn)行奇數(shù)碳的碳鏈延長（丙酸、戊酸），無法生成偶數(shù)碳的己酸.一旦乳酸-丙烯酸酯途徑開始占主導(dǎo)，偶數(shù)碳的己酸合成將很難開展[11].然而，由于不同研究中發(fā)酵系統(tǒng)的微生物多樣性與設(shè)備復(fù)雜性，很難確定乳酸-丙烯酸酯途徑的乳酸濃度閾值.在Prabhu等[12]接種純菌（Megasphaera elsdeniiin）乳酸碳鏈延長研究中，乳酸質(zhì)量濃度達(dá)到3.15 g·L-1時乳酸-丙烯酸酯途徑已經(jīng)占主導(dǎo)地位；在Kucek 等[11]的升流式厭氧連續(xù)流反應(yīng)器中，乳酸質(zhì)量濃度負(fù)荷為8.50 g·L-1·d-1時，偶數(shù)碳的己酸合成占主導(dǎo)地位，當(dāng)乳酸質(zhì)量濃度負(fù)荷提升到15.14 g·L-1·d-1時，乳酸-丙烯酸酯途徑占主導(dǎo)地位；在Zhu 等[5]的厭氧反應(yīng)器中，盡管乳酸投加量高達(dá)30 g·L-1，偶數(shù)碳的己酸合成仍占主導(dǎo)地位.因此，在以乳酸作為電子供體時，為避免乳酸-丙烯酸酯途徑的競爭，乳酸濃度不宜過高，決定主導(dǎo)途徑的乳酸濃度閾值需要結(jié)合實(shí)際情況確定.

圖1 乳酸的乙酰輔酶A 氧化途徑和其競爭途徑Fig.1 Acetyl-CoA oxidation pathway and competitive pathway of lactic acid

除競爭途徑外，乳酸代謝過程還存在著不同的電子選擇路徑.丙酮酸向乙酰輔酶A 的轉(zhuǎn)化過程中存在著Rnf（一種以NAD+（還原性輔酶Ⅰ的氧化形式）為電子受體的酶復(fù)合物，命名來源于Rhodobacter capsulatusnitrogen fixation，即莢膜紅桿菌的固氮行為）電子傳遞鏈與Ech（Energy-converting ferredoxin-dependent hydrogenase complexoll，以質(zhì)子為電子受體的酶復(fù)合物）電子傳遞鏈這兩種選擇路徑，前者會消耗NAD+，后者則消耗質(zhì)子[13].盡管兩種電子傳遞鏈的轉(zhuǎn)化目標(biāo)都為乙酰輔酶A，但Ech 電子傳遞鏈會顯著升高厭氧系統(tǒng)的pH，導(dǎo)致發(fā)酵體系pH 失衡，從而使β 氧化逆循環(huán)受到不良的影響[14].因此，Rnf 電子傳遞鏈?zhǔn)侨樗岽x過程中更佳的選擇路徑，在確定Ech 電子傳遞鏈存在時應(yīng)及時調(diào)控發(fā)酵液的pH，避免發(fā)酵體系pH失衡.

圖中，CoA 表示酶，NADH 為還原性輔酶Ⅰ，NAD+為還原性輔酶Ⅰ的氧化形式，F(xiàn)dred為還原態(tài)鐵氧還蛋白，F(xiàn)dOX氧化態(tài)鐵氧還蛋白.

1.2 乙醇作為電子供體的氧化過程

乙醇作為電子供體參與β 氧化逆循環(huán)，其代謝途徑如圖2 所示：乙醇首先被乙醇脫氫酶氧化為乙醛，乙醛被乙醛脫氫酶氧化為乙酰輔酶A.此時，部分乙酰輔酶A 可能會被氧化為乙酸，乙酸作為電子受體參與后續(xù)反應(yīng).需要注意的是，乙酸作為乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的底物，可能被消耗進(jìn)行甲烷的合成，導(dǎo)致電子受體的流失，通常采用pH調(diào)節(jié)與添加產(chǎn)甲烷抑制劑對產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行抑制[9,15].另外一種對乙醇轉(zhuǎn)化己酸的抑制途徑是乙醇的過度氧化（Excessive ethanol oxidation,EEO）[16].EEO 主要由于CO2分壓過高導(dǎo)致，該競爭途徑會使得更多的乙酰輔酶A 轉(zhuǎn)化為乙酸，導(dǎo)致后續(xù)步驟中乙酰輔酶A 的缺失，從而使己酸的合成受到抑制.因此，在己酸合成中應(yīng)時刻監(jiān)測發(fā)酵液的乙酸濃度與頂空氣體組成，當(dāng)乙酸濃度升高時調(diào)整反應(yīng)器的相關(guān)參數(shù)，從而避免EEO 的發(fā)生.

圖2 乙醇的乙酰輔酶A 氧化途徑和其競爭途徑Fig.2 Acetyl-CoA oxidation pathway and competitive pathway of ethanol

1.3 電子受體的還原

β 氧化逆循環(huán)也需要電子受體的還原，一般是指乙酸還原為丁酸，丁酸還原為己酸.其還原途徑如圖3 所示：乙酰輔酶A 自我縮合，生成乙酰乙酰輔酶A，之后在還原型輔酶Ⅱ（NAD(P)H）的作用下還原并脫水，轉(zhuǎn)化為丁烯酰輔酶A.丁烯酰輔酶A 被丁酰輔酶A 脫氫酶還原為丁酰輔酶A 后，與乙酸結(jié)合生成丁酸與乙酰輔酶A.丁酰輔酶A 也可以與乙酰輔酶A 結(jié)合，在經(jīng)過還原脫水后被己酰輔酶A 脫氫酶還原為己酰輔酶A，之后結(jié)合丁酸生成己酸與丁酰輔酶A，完成一次乙酸向己酸的轉(zhuǎn)化[13].綜上，乙酸的碳鏈被乙酰輔酶A 延長兩個碳生成丁酸，丁酸的碳鏈再被丁酰輔酶A 與乙酰輔酶A 延長兩個碳生成己酸.在微生物合成己酸過程中，丁酸作為中間產(chǎn)物會被首先合成，之后再進(jìn)行己酸的合成，兩者的時間間隔范圍可從短約2 h 至長達(dá)144 h 不等[4,17].

圖3 丁酸與己酸的生成機(jī)理Fig.3 Diagrams illustrating the mechanism of formation of butyric and caproic acids

1.4 還原酶的供給與能量代謝

β 氧化逆循環(huán)過程中存在許多還原型輔酶Ⅰ（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）參與的氧化還原反應(yīng)，同時會有反應(yīng)能量的變化，本節(jié)將重點(diǎn)介紹β 氧化逆循環(huán)過程中的還原酶供給關(guān)系與能量代謝.

1.4.1 還原酶的供給

乙醇和乳酸向乙酰輔酶A 的轉(zhuǎn)化都是在NAD+的作用下實(shí)現(xiàn)的.在氧化過程中，NAD+會從中間產(chǎn)物得到H+，并從電子供體處得到電子，完成向NADH 的轉(zhuǎn)化.1 mol 乙醇轉(zhuǎn)化為1 mol 乙酰輔酶A 時會轉(zhuǎn)化2 mol NAD+為NADH.1 mol 乳酸轉(zhuǎn)化為1 mol 乙酰輔酶A 時，通過Rnf 電子傳遞鏈會轉(zhuǎn)化2 mol NAD+為NADH，通過Ech 電子傳遞鏈時會轉(zhuǎn)化1 mol NAD+為NADH.丁酸與己酸的生成需要NADH 的參與.每1 mol 乙酰輔酶A 生成1 mol 丁酸（己酸），丁酰輔酶A 脫氫酶（己酰輔酶A 脫氫酶）需消耗1.4 mol NADH（消耗2 mol NADH，但同時鐵氧化還原蛋白的轉(zhuǎn)化會生成0.6 mol NADH）[18].綜上，如圖4 所示，電子供體氧化生產(chǎn)NADH，而電子受體還原消耗NADH.因此，1 mol電子供體向1 mol 乙酰輔酶A 轉(zhuǎn)化生成的1～2 mol NADH，可以提供到1 mol 乙酰輔酶A 向1 mol丁酸或己酸的轉(zhuǎn)化過程中.

圖4 β 氧化逆循環(huán)中還原酶的供給Fig.4 Reductase supply in reverse β oxidation

1.4.2 能量的供給與電子分岔

厭氧發(fā)酵過程中微生物需要足夠的能量維持自身的生長代謝.不同于好氧過程，厭氧發(fā)酵過程中由于缺乏氧氣作為電子受體，部分能量伴隨電子供體中電子的轉(zhuǎn)移而進(jìn)入到其他電子受體中，如β 氧化逆循環(huán)中的己酸.因此，在合成己酸過程中，微生物往往會選擇最佳途徑來保證足夠的能量供給，明確β 氧化逆循環(huán)過程中的能量代謝至關(guān)重要.本部分內(nèi)容將總結(jié)細(xì)化前文的己酸合成途徑，并標(biāo)注關(guān)鍵的能量代謝位點(diǎn)，從酶與電子傳遞的角度進(jìn)一步明確微生物合成己酸過程中ATP的合成與厭氧微生物對不同電子氧化還原電位的利用.

β 氧化逆循環(huán)過程中伴隨著底物水平磷酸化（Substrate level phosphorylation,SLP）與電子傳遞磷酸化（Electron transport phosphorylation,ETP）兩種ATP 合成方式[19].前者來源于磷酸基團(tuán)向二磷酸腺苷（Adenosine diphosphate,ADP）的轉(zhuǎn)移，后者來源于電化學(xué)離子梯度作用下還原態(tài)鐵氧還蛋白（Fdred）向氧化態(tài)鐵氧還蛋白（FdOX）的氧化.圖5與圖6 分別展示了電子供體氧化與電子受體還原過程中的ATP 合成.如圖5 所示，SLP 發(fā)生在乙酰輔酶A 被氧化為乙酸的過程中，乙酰輔酶A 先轉(zhuǎn)化為磷酸乙酰酐，之后磷酸乙酰酐的磷酸基脫落，發(fā)酵液中游離的ADP 會與磷酸基結(jié)合，進(jìn)而生成三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP），即能量.同理，丁酰輔酶與己酰輔酶A 被氧化為丁酸和己酸時也會產(chǎn)生ATP[20].然而，如圖6 所示，在β 氧化逆循環(huán)中，該過程有乙酸或丁酸的參與，則不會產(chǎn)生ATP.β 氧化逆循環(huán)中丁酰輔酶A（己酰輔酶A）到丁酸（己酸）的步驟類似于基團(tuán)的交換，而SLP 則是由氧化過程中磷酸基脫落造成的，這是兩種本質(zhì)不同但產(chǎn)物相同的反應(yīng)類型.若微生物將丁酰輔酶A（己酰輔酶A）通過SLP 轉(zhuǎn)化為丁酸（己酸），盡管ATP 產(chǎn)量增加，但將導(dǎo)致乙酰輔酶A 缺失，從而導(dǎo)致β 氧化逆循環(huán)受阻，使碳鏈延長過程停滯在丁酸.從能量代謝的角度來說，若β 氧化逆循環(huán)中碳鏈延長被停滯在丁酸，則可能是因?yàn)槲⑸镄枰ㄟ^SLP 供給的能量維持自身生長代謝，而非通過β 氧化逆循環(huán)將能量轉(zhuǎn)移到己酸中導(dǎo)致的.ETP 發(fā)生在丙酮酸的氧化（圖5）與丁烯酰輔酶A、2-己烯酰輔酶A 的還原過程（圖6）中，這些過程都涉及Fdred的氧化.如圖5 所示，這種氧化是在Rnf 或Ech 上發(fā)生的，Na+或H+向胞外移動，形成離子電化學(xué)梯度，此時ATP 合成酶會結(jié)合胞外的離子電化學(xué)梯度進(jìn)行ATP 的生產(chǎn)[14].這兩種來源不同的ATP 都可以在電子受體還原時為碳鏈的延長提供能量.

圖5 電子供體氧化過程中的能量代謝Fig.5 Energy metabolism during electron donor oxidation

圖6 電子受體還原過程中的能量代謝Fig.6 Energy metabolism during electron acceptor reduction

在ETP 過程中Fdred被氧化為FdOX，之后FdOX需要被還原為Fdred繼續(xù)參與電子的傳遞，維持微生物的基礎(chǔ)代謝.然而，F(xiàn)dOX向Fdred的轉(zhuǎn)化是熱力學(xué)困難的過程，因?yàn)榇穗妼Φ难趸€原電勢E（FdOX/Fdred）=-510 mV，在厭氧發(fā)酵中基本不存在可以還原FdOX的電對（E（H+/H2）=-414 mV，E（NAD+/NADH）=-300 mV）[21].為解釋FdOX還原的熱力學(xué)不利，在早期的研究中，Thauer 等[22]認(rèn)為乙酰輔酶A 是這一過程的高度特異性激活劑，然而這種假設(shè)并不能從熱力學(xué)上得到支持.Kaplan和Kennedy[23]則認(rèn)為厭氧微生物會避免通過ETP獲取能量，因當(dāng)時的研究并未明確NADH 可以還原FdOX.

近些年來，電子分岔的發(fā)現(xiàn)給出了答案.Seedorf 等[24]提出了一種Clostridium kluyveri通過耦合放能反應(yīng)來驅(qū)動耗能反應(yīng)進(jìn)行的假設(shè).Herrmann 等[19]細(xì)化了這種代謝方式，并提出了厭氧微生物的電子分岔理論.從熱力學(xué)的角度來講，電子分岔是指一個熱力學(xué)無法自發(fā)進(jìn)行的反應(yīng)（ΔG＞0）被另一個熱力學(xué)自發(fā)進(jìn)行的反應(yīng)（ΔG＜0）所激活了，這與Seedorf 等[24]的觀點(diǎn)相同.從電子傳遞的角度來講，電子分岔是指來源于相同分子的一對電子（該對電子不一定都存在于同一個分子中，但必須是同一種分子）被一種黃素基電子傳遞蛋白所分開，分別置于高電位與低電位.以Clostridium kluyveri引導(dǎo)的碳鏈延長過程為例，NADH 在電子分岔的作用下將FdOX還原.圖6 介紹了該過程中的電子傳遞，將來自NADH 的兩個電子分別命名為e-1與e-2.在丁烯酰輔酶A 還原的過程中，Clostridium kluyveri的黃素基電子傳遞蛋白與丁酰輔酶A 脫氫酶緊密結(jié)合形成復(fù)合物，一分子的NADH 的e-1與e-2被該復(fù)合物分開，e-2進(jìn)入丁酰輔酶A 脫氫酶參與丁烯酰輔酶A 的還原（E（丁烯酰輔酶A/丁酰輔酶A）=-10 mV）；e-1進(jìn)入到FdOX中，之后下一個分子的NADH 將一個電子提供到FdOX中，實(shí)現(xiàn)FdOX向Fdred的還原（式(1)）.從氧化還原電位的角度來說，各具有-300 mV 還原力的NADH 中的一對電子，其中一個電子僅發(fā)揮了-10 mV 的還原力去還原丁烯酰輔酶A，理論上這多余的還原力無法繼續(xù)參與該對電子的反應(yīng)，然而電子分岔使得該還原力轉(zhuǎn)移到了另一個電子上，使得其能發(fā)揮至少-510 mV 的還原力，將FdOX還原.

除此之外，H2也可以通過電子分岔將FdOX還原，且不需要借助脫氫酶.如圖5 所示，氫氣的e-1與e-2被分開，其中e-2電子進(jìn)入電勢更高的狀態(tài)，將NAD+還原為NADH，e-1進(jìn)入FdOX，下一對氫氣的電子重復(fù)此過程，則能實(shí)現(xiàn)FdOX的還原（式(2)）[25].

如圖5 所示，在乳酸的氧化中同樣存在電子分岔現(xiàn)象.這種分岔表現(xiàn)于乳酸向丙酮酸的轉(zhuǎn)化可以通過電子分岔進(jìn)行逆向反應(yīng)，NADH 中的e-1與e-2分別將丙酮酸（E（丙酮酸/乳酸）=-190 mV）與FdOX還原（式(3)）[26].

電子分岔被認(rèn)為是厭氧微生物中能量代謝的重要過程.厭氧發(fā)酵過程的熱力學(xué)不利在于微生物代謝缺乏足夠的能量供給.在這種情況下，微生物需要減少能量的損耗.電子分岔可以將厭氧環(huán)境中還原型物質(zhì)的還原電位進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化為ATP.從能量的角度來說，在β 氧化逆循環(huán)中，電子分岔可以從SLP 和ETP 兩個方面為微生物提供能量.以乙酰輔酶A 的代謝的為例，1 mol 乙酰輔酶A 氧化為1 mol 乙酸提供1 mol ATP，還原為丁酸提供0.5 mol ATP（此處假設(shè)不再進(jìn)行β 氧化逆循環(huán)）.當(dāng)電子分岔不發(fā)生時，1 mol 丁烯酰輔酶A 轉(zhuǎn)化為丁酸需要1 mol NADH，而當(dāng)NADH 的電子被電子分岔分開至FdOX與丁酰輔酶A 脫氫酶時，1 mol 丁烯酰輔酶A 轉(zhuǎn)化為丁酸則需要2 mol NADH[19].因此，更大的NADH 需求量導(dǎo)致乙酰輔酶A 更少的轉(zhuǎn)化為丁酸，而是轉(zhuǎn)化為乙酸，從而加強(qiáng)了SLP 的能量供給.因該過程中電子分岔的發(fā)生導(dǎo)致更多Fdred的生成，由Fdred驅(qū)動的ETP 更加劇烈，ETP 的能量供給也被加強(qiáng).從還原力的角度來說，電子分岔避免了還原力的浪費(fèi)，例如前文中描述的，分別具有-300 mV 氧化還原電位的NADH 的一對電子，其中一個發(fā)揮了-10 mV 的還原力將丁烯酰輔酶A 還原后，該氧化還原電位差值并沒有被浪費(fèi)，而是被轉(zhuǎn)移到了另一個電子中，使其能發(fā)揮-510 mV 的還原力.

在碳鏈延長過程中，電子分岔可以分為三種，第一種是導(dǎo)致乙酰輔酶A 氧化的丁酰輔酶A 脫氫酶-NADH-FdOX電子分岔，第二種是NAD+-H2-FdOX電子分岔，第三種是可逆的丙酮酸-NADHFdOX電子分岔.在β 氧化逆循環(huán)中對第一種電子分岔的抑制可以提高碳鏈延長效率，對第二種電子分岔的促進(jìn)可能會向厭氧系統(tǒng)提供更強(qiáng)的還原力，第三種電子分岔導(dǎo)致的乳酸氧化受阻暫未見報(bào)道.值得關(guān)注的是，當(dāng)?shù)谝环N電子分岔發(fā)生時，乙酰輔酶A 被更多的轉(zhuǎn)化為乙酸，這是EEO 的一個表現(xiàn).因此有理由懷疑，丁酰輔酶A 脫氫酶-NADH-FdOX電子分岔與EEO 有關(guān)，或者能調(diào)控EEO.隨著電子分岔研究的深入，尋找合適的手段去調(diào)控電子分岔的發(fā)生甚至電子的流向，可能將進(jìn)一步提高己酸甚至更長鏈酸的產(chǎn)量.

2 影響因素

2.1 PH

pH 是微生物合成己酸過程中的重要影響因素，合理地調(diào)控會大幅度提高己酸的產(chǎn)量.pH 會從功能微生物的偏好范圍、產(chǎn)物累積以及競爭途徑三方面影響己酸的生成.下面分別就pH 對乳酸和乙醇為電子供體開展碳鏈延長的影響進(jìn)行討論.

2.1.1 pH 對以乙醇為電子供體的碳鏈延長的影響

Clostridium kluyveri是一種研究最多，應(yīng)用最廣的以乙醇為底物的己酸功能菌.研究表明，Clostridium kluyveri可以在pH 為5.2～8.0 的范圍內(nèi)生長[27].在β 氧化逆循環(huán)過程中，Clostridium kluyver在pH 為6.8 時獲得最高的己酸產(chǎn)率，pH 從7.0 到5.5 的降低會導(dǎo)致己酸功能菌的生長率降低約40%[28-29].San-Valero 等[30]以Clostridium kluyveri為接種物，在pH 為6.8 時獲得了高達(dá)21.4 g·L-1的己酸產(chǎn)量.Zhang 等[31]研究了初始pH 對Clostridium kluyveri己酸生產(chǎn)的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)初始pH 為7.4 時己酸產(chǎn)量最高，當(dāng)pH 下降至約6.6～7.0 時己酸開始迅速累積，最終獲得了16.5 g·L-1的己酸產(chǎn)量.低的pH 會導(dǎo)致羧酸以未解離的方式存在，累積的羧酸會造成產(chǎn)物抑制[32].在Yu 等[33]的研究中，以最佳醇酸比的條件進(jìn)行了不同pH 下的己酸生產(chǎn).結(jié)果表明，在pH 為5.5 時，己酸生產(chǎn)受到抑制，丁酸成為了主要的產(chǎn)物.Yu 等[33]認(rèn)為，更多的丁酸積累是由于微生物將底物更多代謝為丁酸，而不是未解離毒性更大的己酸.在Ge 等[34]的連續(xù)流己酸生產(chǎn)厭氧反應(yīng)器中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH 為5.5，未離解的己酸在濃度高于0.0075 mol·L-1時會對己酸功能菌造成生物毒性，當(dāng)厭氧反應(yīng)器中己酸質(zhì)量濃度積累到5.48 g·L-1時，微生物會更多的積累丁酸，這可能也源于微生物為避免生物毒性的一種反應(yīng).從功能微生物的最適pH 范圍與產(chǎn)物抑制的角度來說，偏向于中性的pH 是更適合乙醇為底物的碳鏈延長的.然而，中性的pH 也有利于產(chǎn)甲烷菌的代謝，產(chǎn)甲烷競爭途徑導(dǎo)致了碳源的流失[35].酸性條件可以降低產(chǎn)甲烷菌的活性，且產(chǎn)甲烷菌對于未解離羧酸的耐受能力弱于己酸功能菌[36].Wu 等[15]的研究表明，大于0.005 mol·L-1的未解離的羧酸足以完全抑制產(chǎn)甲烷菌，此時的pH 約為5.4，甲烷產(chǎn)量為0，且在不添加產(chǎn)甲烷抑制劑的情況下仍具有一定的己酸產(chǎn)率（此時己酸質(zhì)量濃度約為1.91 g·L-1，相比初始pH 為6.5 時產(chǎn)量提高約10.76%）.因此，為避免產(chǎn)甲烷競爭途徑的影響，許多研究在pH＜6 的條件下進(jìn)行了以乙醇為底物的碳鏈延長.Vasudevan 等[37]在pH 為5.44 時獲得了1 g·L-1的己酸產(chǎn)率.Crognale 等[38]以餐廚垃圾提取物中的乙醇為主要電子供體進(jìn)行己酸生產(chǎn)，當(dāng)有機(jī)負(fù)荷（以化學(xué)需氧量為標(biāo)準(zhǔn)）為15 g·L-1·d-1時，pH 大部分時間保持在6 以下，最終獲得了4.8 g ·L-1的己酸產(chǎn)量.Wang等[39]以污泥為接種物的產(chǎn)己酸研究表明，pH 為6 時，產(chǎn)甲烷菌已經(jīng)被抑制.這些在較低pH 進(jìn)行的研究在不投加產(chǎn)甲烷抑制劑的條件下，實(shí)現(xiàn)了對甲烷菌的抑制，減少了對己酸功能菌的競爭并節(jié)約成本，但相應(yīng)己酸產(chǎn)量較低.綜上所述，pH 為5.5～6 應(yīng)該是一個更合適的范圍（圖7）.然而，該pH 范圍內(nèi)隨著己酸產(chǎn)量的提高，未解離的己酸對己酸功能菌產(chǎn)生抑制的可能性也極高，需要開展在線提取己酸等方式從而避免產(chǎn)物毒性累積，但該方法會提高生產(chǎn)成本.在現(xiàn)階段添加產(chǎn)甲烷菌抑制劑，采用接近中性的pH 可能是提高己酸產(chǎn)率更好的選擇，研發(fā)經(jīng)濟(jì)的產(chǎn)物分離技術(shù)也應(yīng)是微生物合成己酸的研究方向.

圖7 幾種典型己酸功能菌的pH 工作范圍Fig.7 pH range of several typical caproic acid functional bacteria

2.1.2 pH 對以乳酸為電子供體的碳鏈延長的影響

以乳酸為底物的碳鏈延長過程中主要采用混菌為接種物，大部分己酸功能菌可適應(yīng)偏酸性的pH 條件.Zhu 等[40]利用CPB6，一種新分離的瘤胃科菌種進(jìn)行了己酸生產(chǎn)，發(fā)現(xiàn)其在pH 值為5.5～6 時表現(xiàn)最好.Kucek 等[11]以Megasphaera elsdeniiin為主要功能微生物菌群的馴化混菌為接種物，通過在線提取進(jìn)行了以乳酸為電子供體的己酸連續(xù)生產(chǎn).在這個連續(xù)生產(chǎn)過程中pH 值＜5.5，這是因?yàn)镸egasphaera elsdeniiin是一種能耐受低pH 的菌種，同時在線提取也避免了未解離己酸帶來的產(chǎn)物抑制.偏酸性的條件同樣可以抑制乳酸-丙烯酸酯途徑[41].丙酸桿菌已被證明能在pH 值為6.5～7 時從乳酸中產(chǎn)生乙酸和丙酸，在pH值＜6 時丙酸桿菌的生長速率迅速下降[42].在Xie等[43]以乳酸為電子供體，丁酸為電子受體的研究中，采用低濃度乳酸與低pH（pH 值為5.0）的調(diào)控策略，有效抑制了乳酸-丙烯酸酯途徑.Candry等[41]配置了與實(shí)際廢水相同構(gòu)成，把糖類物質(zhì)替換成乳酸的模擬廢水，并接種了馴化的混菌.結(jié)果表明，pH 值＞6 時乳酸-丙烯酸酯途徑為主導(dǎo)途徑，導(dǎo)致己酸產(chǎn)量極低；pH 值＜6 時中雖然無法完全抑制乳酸-丙烯酸酯途徑，但己酸產(chǎn)量明顯提升.Candry 等[41]從熱力學(xué)角度解釋了pH 對乳酸-丙烯酸酯途徑的影響，接近中性的pH 會使微生物通過乳酸-丙烯酸酯途徑獲得更高的能量，隨著pH的降低，微生物生成己酸將獲得更多的能量.在Nzeteo 等[44]以餐廚垃圾滲濾液中的乳酸為主要電子供體，Clostridiumsp.為主要己酸功能菌的己酸生產(chǎn)研究中，pH 降至5.5 時己酸生成速率下降，pH 降至5.0 時己酸生成被完全抑制.因此，以乳酸為底物進(jìn)行碳鏈延長時，控制pH 在5.0～6.0 的范圍既可保證己酸的生產(chǎn)，又可以抑制乳酸-丙烯酸酯途徑的競爭.然而，由于混菌體系的復(fù)雜性，也存在例外.Zhu 等[5]利用實(shí)際廢水中的乳酸生產(chǎn)己酸，接種物為馴化的酒窖窖泥，其中Clostridium IV是馴化混菌中的主要己酸功能菌.在pH 值為6.0～6.5 的條件下，且不進(jìn)行在線提取時，最高己酸生產(chǎn)速率達(dá)到2.97 g·L-1·d-1.與Kucek 等[11]的研究不同的是，在pH 值＞6 的情況下，Zhu 等[5]的反應(yīng)器中未出現(xiàn)乳酸-丙烯酸酯途徑的痕跡，原因可能是氧化乳酸的菌群與進(jìn)行β 氧化逆循環(huán)的菌群不同，即Clostridium IV負(fù)責(zé)碳鏈延長，而其他菌群負(fù)責(zé)乳酸的氧化，不同菌群的相互協(xié)作使乳酸-丙烯酸酯途徑受到抑制.在Gao 等[45]的釀酒廢水產(chǎn)己酸的研究中，接種物同樣為馴化的窖泥，但并未實(shí)時調(diào)控pH，pH 從6.3 降至5.2，期間每克揮發(fā)性固體獲得了0.20 g 的己酸，且無乳酸-丙烯酸酯途徑的干擾，主要功能菌為Caproiciproducens，這個過程中也可能存在不同菌群的相互協(xié)作.綜上，以乳酸為電子供體，進(jìn)行在線提取己酸時，應(yīng)盡量控制pH 在5.0～6.0 的范圍內(nèi)，這樣可避免乳酸-丙烯酸酯途徑的競爭（圖7）.除此之外，以混菌為接種物，調(diào)控不同菌群的相互協(xié)作，可能同樣會抑制乳酸-丙烯酸酯途徑，同時強(qiáng)化己酸生產(chǎn).

2.2 頂空氣體

CO2與H2作為微生物合成己酸過程中的兩種典型頂空氣體，可以參與到β 氧化逆循環(huán)中從而提高己酸的產(chǎn)量，明確CO2與H2的作用機(jī)理至關(guān)重要.

在碳中和、碳達(dá)峰的背景下，CO2作為一種合適的資源化底物，其在微生物合成己酸中的應(yīng)用成為了研究的熱點(diǎn).CO2從三個方面影響己酸的生產(chǎn).第一個方面，Clostridium kluyveri可通過化能自養(yǎng)代謝將CO2用于合成自身的蛋白質(zhì)[46].Tomlinson 和Barker[47]以乙酸鹽和CO2為底物培養(yǎng)Clostridium kluyveri，利用同位素示蹤法確認(rèn)Clostridium kluyveri細(xì)胞內(nèi)部25%的碳來自CO2，11%的碳來自于乙酸鹽.第二個方面，CO2可以通過還原乙酰輔酶A 途徑轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，或進(jìn)一步被氧化為乙酸，從而參與β 氧化逆循環(huán).Roghair 等[16]研究了CO2濃度負(fù)荷對碳鏈延長過程中乙醇消耗的影響，結(jié)果表明高CO2濃度負(fù)荷（每升底物每天通入CO22.5 L）下己酸產(chǎn)量為10.8 g ·L-1·d-1，低CO2濃度負(fù)荷（每升底物每天通入CO20.5 L）下己酸產(chǎn)量為2.9 g ·L-1·d-1.San-Valero 等[30]通過碳 酸氫鈉調(diào)節(jié)pH，向發(fā)酵液中補(bǔ)充了CO2，己酸產(chǎn)量從18.3 g·L-1提升到21.4 g·L-1.第三個方面，高CO2濃度負(fù)荷會造成EEO 的發(fā)生，導(dǎo)致乙酰輔酶A 更多的轉(zhuǎn)化為乙酸，而不是參與己酸的合成.在Roghair等[16]的研究中，高CO2濃度負(fù)荷使EEO 的影響從16%提升到了29%.Grootscholten 等[35]將每升底物的CO2的濃度負(fù)荷從2.4 L·d-1提高到4.8 L·d-1，未觀察到碳鏈的延長，且EEO 現(xiàn)象更加嚴(yán)重.因此，提供適量的CO2有助于微生物合成己酸，但濃度負(fù)荷不宜過高，較低的濃度負(fù)荷會更高效地利用碳源轉(zhuǎn)化為己酸.

H2作為還原性物質(zhì)，可以降低發(fā)酵體系的氧化還原電位，同時可以被厭氧微生物利用，作為電子供體與CO2通過還原乙酰輔酶A 途徑生成乙酰輔酶A 和乙酸，參與β 氧化逆循環(huán).在pH 值為7，溫度為25 ℃時，該反應(yīng)ΔG=-94.96 kJ·mol-1，反應(yīng)易于進(jìn)行[48].除此之外，H2分壓也從多個方面影響著己酸的合成.首先，H2可以通過與CO2的反應(yīng)，或者本身的分壓來降低CO2的分壓，從而避免EEO[49].但是過高的H2分壓將會導(dǎo)致β 氧化逆循環(huán)的能量供給不足[18].這來源于：（1）過高的H2分壓使得乙酰輔酶A 向乙酸的轉(zhuǎn)化受阻，進(jìn)而影響SLP 提供ATP 的過程；（2）過高的H2分壓抑制了Ech 上發(fā)生的H+還原，導(dǎo)致ETP 提供ATP 的過程受影響.盡管該情況下，微生物仍可通過前文所提及的電子分岔（如NAD+-H2-FdOX電子分岔，通過H2將FdOX還原，繼而進(jìn)行ETP）將H2的還原力轉(zhuǎn)化為ATP，從而進(jìn)行碳鏈的延長[24].但這種轉(zhuǎn)化的完成將延長發(fā)酵時間，造成己酸合成效率的降低.Stams[50]通過熱力學(xué)計(jì)算，得出H2分壓＜10 kPa 時可避免高分壓的負(fù)面影響.過低的H2分壓同樣會抑制己酸的合成[13].當(dāng)H2分壓＜10-2kPa 時，H+通過ETP 合成一個ATP 所需要的能量大于一個ATP釋放的能量，造成凈能量損失，使β 氧化逆循環(huán)的能量供給受到抑制[51].這種情況下微生物可能會通過脂肪酸β 氧化獲取能量，導(dǎo)致碳鏈縮短[35].低H2分壓主要由氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌對H2的消耗導(dǎo)致.González-Tenorio 等[52]利用有機(jī)廢物為底物，CO2與H2作為頂空氣體進(jìn)行了己酸的生產(chǎn)，在H2被快速代謝時檢測到了甲烷的生成，其分壓最高可達(dá)頂空氣體的約25%.通過調(diào)整pH 或添加產(chǎn)甲烷抑制劑可以抑制產(chǎn)甲烷菌的活性，解決H2分壓過低導(dǎo)致的己酸合成受到抑制的問題[50].Grootscholten 等[35]認(rèn)為，微生物合成己酸過程中應(yīng)保持H2分壓＞3 kPa，以此來保證對EEO 的抑制.綜上所述，β 氧化逆循環(huán)中H2分壓應(yīng)保持在3 kPa到10 kPa 之間.

上述關(guān)于H2分壓的討論主要基于以乙醇為電子供體的己酸合成過程.當(dāng)電子供體為乳酸時，過高的H2分壓（H2分壓＞10 kPa）可能將不再造成上述不良影響.在Wu 等[32]以乳酸為電子供體的產(chǎn)己酸研究中，相比不添加H2，H2分壓為150 kPa 時乳酸-丙烯酸酯途徑被抑制，中鏈脂肪酸產(chǎn)率提高約1.65 倍.盡管高H2分壓可能抑制ETP 過程從而造成能量供給障礙，但Wu 等[32]的研究中長達(dá)30 d 的發(fā)酵時間足夠使微生物將H2的氧化還原電位轉(zhuǎn)化為能量以供給自身生長代謝，這可能是盡管ETP 被抑制，但己酸產(chǎn)率仍然提高的原因.因此，在以乳酸為電子供體進(jìn)行碳鏈延長時，提高H2分壓并適當(dāng)延長發(fā)酵時間，可抑制乳酸-丙烯酸酯途徑并提高己酸產(chǎn)量.

2.3 生物電化學(xué)系統(tǒng)強(qiáng)化己酸合成

生物電化學(xué)系統(tǒng)（Bioelectrochemical system，BES）可以通過外加陰極增強(qiáng)發(fā)酵過程的還原驅(qū)動力，在微生物合成己酸中的應(yīng)用成為了近年來研究的熱點(diǎn)[53].2013 年，Eerten-Jansen 等[54]僅以乙酸為底物，在BES 中將乙酸還原為己酸，己酸產(chǎn)量接近0.8 g·L-1.該研究中并沒有傳統(tǒng)的電子供體（如乙醇和乳酸），表明生物陰極可以作為電子供體參與β 氧化逆循環(huán).該研究提出了兩種外加陰極電子的去向，其一是電子通過電解水轉(zhuǎn)移到氫氣中，然后還原乙酸為乙醇；其二是電活性微生物在陰極上直接將電子轉(zhuǎn)移入細(xì)胞內(nèi)，同時結(jié)合游離的H+將乙酸還原為乙醇.這兩種電子流動皆表明該研究中的己酸仍來源于乙醇與乙酸驅(qū)動的β 氧化逆循環(huán)，而非構(gòu)建了新的己酸合成途徑.但該項(xiàng)研究提供了一種利用BES 生產(chǎn)己酸的技術(shù)，使人們意識到BES 強(qiáng)化己酸合成的可能性.Andersen等[55]發(fā)現(xiàn)對發(fā)酵液通電可以促進(jìn)乳酸的碳鏈延長，己酸產(chǎn)量提高了3%，這項(xiàng)研究說明BES 強(qiáng)化了以乳酸為電子供體的己酸生產(chǎn).Jiang 等[56]以乙醇與乙酸為底物，研究了生物陰極對碳鏈延長過程的影響.結(jié)果表明，與開路控制相比，BES 中產(chǎn)物的己酸電子選擇性提高了約28%，這項(xiàng)研究說明BES 強(qiáng)化了以乙醇為電子供體的己酸生產(chǎn).Cheng等[57]對乙醇與乙酸驅(qū)動的碳鏈延長進(jìn)行了深入研究，評估了不同乙醇乙酸比例下BES 對己酸產(chǎn)量的提升，并證明己酸產(chǎn)量隨著醇酸比的升高而升高.在醇酸比為3∶1 時，相比開路系統(tǒng)，BES 提高了26.1%的己酸濃度.

對CO2的固定是近些年來BES 強(qiáng)化己酸合成研究的重點(diǎn).早期的研究發(fā)現(xiàn)BES 能將CO2通過厭氧發(fā)酵固定為甲烷和乙酸，這來源于生物陰極對還原乙酰輔酶A 途徑的強(qiáng)化[58-59].Raes 等[60]以CO2與乙酸為底物進(jìn)行BES 混合微生物培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)高電流密度會顯著增加丁酸鹽的累積，并生產(chǎn)微量的己酸.這表明生物陰極促進(jìn)了CO2的還原乙酰輔酶A 途徑，并且CO2通過生物陰極參與了碳鏈延長.近些年來，在BES 中以CO2為底物進(jìn)行己酸生產(chǎn)受到了重視[61].Igor 等[62]以CO2為唯一碳源，在 BES 中進(jìn)行了碳鏈的延伸，中鏈脂肪酸產(chǎn)量達(dá)到1.2 g·L-1.然而，CO2作為唯一碳源，其既要通過還原乙酰輔酶A 途徑轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A 作為電子供體，又要進(jìn)一步被氧化為乙酸作為電子受體，這可能會造成底物供給的不足.因此，應(yīng)該考慮將CO2與其他物質(zhì)協(xié)同發(fā)酵進(jìn)行己酸生產(chǎn).Jiang 等[63]使用CO2和乙醇為底物進(jìn)行了己酸的生產(chǎn)，外加陰極使產(chǎn)物中的己酸電子回收效率從32.22%提高到91.47%.乙醇的添加彌補(bǔ)了電子供體的不足，克服了以CO2為唯一碳源時存在的電子供體或電子受體缺少的問題，且BES 同時促進(jìn)了CO2的還原乙酰輔酶A 途徑與乙醇為電子供體的碳鏈延長.

綜上，BES 強(qiáng)化己酸合成技術(shù)具有十足的潛力，與自然發(fā)酵相同的是，BES 也面臨著產(chǎn)甲烷抑制、熱力學(xué)瓶頸以及底物的供給等問題[61].不同的是，BES 對β 氧化逆循環(huán)過程的促進(jìn)機(jī)理尚不清晰，且缺乏BES 對乳酸為電子供體的碳鏈延長的影響的研究[64].結(jié)合近些年來在厭氧微生物體內(nèi)，尤其是Clostridium kluyveri內(nèi)發(fā)現(xiàn)的電子分岔現(xiàn)象，可能會將外加電勢與胞內(nèi)的鐵氧化還原蛋白的氧化還原電勢結(jié)合起來，這值得深入的研究.從結(jié)構(gòu)優(yōu)化的角度出發(fā)，未來的研究可以通過調(diào)整電解池的參數(shù)、修飾電極以及優(yōu)化產(chǎn)物的在線提取來提升己酸產(chǎn)率[65].同時，可以將基因工程、代謝工程與BES 強(qiáng)化己酸合成結(jié)合，提高微生物的工作效率[66].從應(yīng)用的角度出發(fā)，以實(shí)際廢水、廢氣為底物的BES 強(qiáng)化己酸合成也應(yīng)是重點(diǎn)研究方向[46].

3 結(jié)論與展望

本文介紹了碳鏈延長過程中還原酶與能量的供給關(guān)系，分析了pH、頂空氣體對碳鏈延長的影響機(jī)理并提供了相應(yīng)策略.在β 氧化逆循環(huán)過程中，電子供體的氧化為電子受體的還原提供了還原酶，并存在三種能量合成途徑：SLP、ETP，以及將氧化還原電位轉(zhuǎn)化為能量的第三種能量代謝方式——電子分岔.調(diào)控電子分岔的發(fā)生以及電子的流向，可能將進(jìn)一步提高己酸的產(chǎn)量.對以pH與頂空氣體為代表的影響因素分析表明：（1）pH值＜6 時可以同時實(shí)現(xiàn)對產(chǎn)甲烷途徑與乳酸-丙烯酸酯途徑的抑制，需要研究低成本的底物分離技術(shù)，避免己酸的毒性抑制并提高產(chǎn)率.現(xiàn)階段添加產(chǎn)甲烷菌抑制劑，采用接近中性的pH 可能是提高己酸產(chǎn)率更好的選擇；（2）CO2作為底物參與微生物合成己酸有助于碳固定，但應(yīng)避免過高CO2分壓引起的EEO；（3）合適的H2分壓應(yīng)保持在3 kPa到10 kPa 之間，以抑制乙醇過度氧化的發(fā)生，同時避免電子供體氧化的熱力學(xué)不利；（4）生物電化學(xué)強(qiáng)化己酸合成技術(shù)具有巨大的潛力，未來應(yīng)深入研究其對β 氧化逆循環(huán)過程的影響機(jī)理，并以實(shí)際廢水廢氣為底物的開展己酸生產(chǎn).