李東潤(rùn)，劉 奧，許清烽，張宇婷

(遼寧何氏醫(yī)學(xué)院，沈陽 110000)

菊花在我國(guó)有悠久的用藥歷史，是藥食同源的中藥，來源于菊科植物菊(ChrysanthemummorifoliumRamat.)的干燥頭狀花序，具有平肝明目、清熱解毒等功效，常用于治療風(fēng)熱感冒、眼目昏花、目赤腫痛等癥狀[1-2]。菊花品種繁多，成分復(fù)雜，化學(xué)成分受到生長(zhǎng)環(huán)境、產(chǎn)地、種質(zhì)資源、采收期等因素的影響。

花青素(anthocyanins)是植物次生代謝中產(chǎn)生的黃酮類化合物，可使果實(shí)和花等產(chǎn)生特定的顏色。其中，花青素合成酶(ANS)位于花青素合成途徑的下游區(qū)段，是催化無色花色素轉(zhuǎn)變成為有色花色素的關(guān)鍵酶之一[3]。研究表明，花青素具有抗菌消炎、抗氧化、抗衰老等作用[4]。

利用生物信息學(xué)方法，對(duì)菊花ANS的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析，為菊花ANS基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。對(duì)擬南芥(Arabidopsisthaliana)、紅花(Carthamustinctorius)、辛夷(Magnoliasprengeri)、玫瑰(RosarugosaThunb)、白桑(Morusalbavar.multicaulis)、茶(Camelliasinensis)等不同藥用植物的LDOX/ANS基因的核苷酸及氨基酸序列的組成、生化特性、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等進(jìn)行推測(cè)和分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以期明確該酶的結(jié)構(gòu)和功能。

1 材料與方法

1.1 材料

菊花花青素合成酶ANS序列來源于Genbank美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)。

1.2 方法

ORF Finder在線工具查找ANS基因序列，ExPASy ProtParam工具分析ANS蛋白的理化性質(zhì)(https://web.expasy.org/protparam/)，使用ExPASy ProtScale工具分析ANS的親/疏水性，利用SignalP-5.0工具在線預(yù)測(cè)ANS的信號(hào)肽，確認(rèn)其是否為跨膜蛋白。利用PSORT工具預(yù)測(cè)ANS蛋白的亞細(xì)胞定位。用Predict protein和SWISS-MODEL工具分析二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 ANS序列分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載ANS基因序列，下載基因全長(zhǎng)為1 238 bp，經(jīng)blastp匹配，含有1個(gè)完整的開放閱讀框序列，長(zhǎng)度為1 062 bp，起始于第78 bp，終止于第1 139 bp，氨基酸為353個(gè)。

圖1 菊花BLAST匹配Fig.1 Chrysanthemum BLAST matching

2.2 ANS蛋白理化性質(zhì)分析

ANS蛋白分子質(zhì)量為 39.59 kD，分子式為 C1811H2855N477O535S11，理論等電點(diǎn)是5.73，脂肪系數(shù)為90.87，平均疏水性為-0.409，表明ANS蛋白是親水性蛋白。半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為41.45，屬于穩(wěn)定蛋白。ANS蛋白氨基酸組成中，亮氨酸含量最高，占總氨基酸數(shù)的10.1%；脯氨酸和色氨酸含量最低，占總氨基酸數(shù)的1.4%。其中，負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)為(Asp + Glu)51個(gè)，正電荷氨基酸殘基總數(shù)為(Arg + Lys)42個(gè)。詳見表1。

表1 不同植物L(fēng)DOX/ANS基因及對(duì)應(yīng)氨基酸序列的組成成分及理化性質(zhì)Tab.1 Composition and physicochemical properties of LDOX/ANS genes and corresponding amino acid sequences in different plants

2.3 ANS蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析

采用SignalP 5.0 Server在線軟件，分析預(yù)測(cè)8種不同來源ANS的信號(hào)肽。結(jié)果顯示，所有ANS均不含信號(hào)肽，說明ANS屬于非分泌性蛋白。亞細(xì)胞定位應(yīng)用Cell PLoc server在線工具，分析得到菊花和百合位于細(xì)胞質(zhì)，其他位于葉綠體。上述所有蛋白均沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果與跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果一致。

圖2 菊花信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.2 Chrysanthemum signal peptide prediction

2.4 ANS二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過SOPMA分析工具，預(yù)測(cè)菊花ANS氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果詳見表2，其中，菊花ANS蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)元件是ɑ-螺旋、無規(guī)則卷曲、β-折疊、延伸鏈。對(duì)擬南芥及其他物種的氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果相似，說明菊花ANS與實(shí)驗(yàn)中的大多數(shù)植物ANS蛋白一樣，具有穩(wěn)定的青花素合成酶結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步推斷菊花ANS基因可能在青花素代謝途徑中具有重要的作用。利用SWISS-MODEL在線工具，對(duì)ANS的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其三級(jí)結(jié)構(gòu)組成與二級(jí)結(jié)構(gòu)一致。

表2 ANS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要構(gòu)成組件比例Tab.2 Main constitutes proportions of the secondary structure of ANS proteins

圖3 菊花二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Chrysanthemum secondary structural analysis

圖4 菊花開放閱讀框(ORF)分析Fig.4 Analysis of Chrysanthemum Open Reading Frame (ORF)

2.5 比對(duì)分析ANS核苷酸序列及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

用MEGA-X軟件對(duì)擬南芥、菊花、紅花、辛夷、玫瑰、百合、白桑、茶、巖藻在實(shí)驗(yàn)中選定的9種植物的核苷酸序列做物種核苷酸序列，進(jìn)行多序列比對(duì)分析，采用鄰接法(Neighbor-Joining Tree，NJ)、最大似然法(Maximum-Likelihood Tree，ML)、最小進(jìn)化法(Minimum-Evolution，ME)，分別進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。結(jié)果表明，3種系統(tǒng)進(jìn)化分析方法所得的結(jié)果較一致，其中，菊科紅花和菊科菊花的3種統(tǒng)計(jì)結(jié)果高度一致，在進(jìn)化上分支上，得到的結(jié)果都是分為一支，這一結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)分類的歸屬一致，另外，采用NJ法和ML法顯示，在進(jìn)化上與十字花科的擬南芥進(jìn)化距離更近，估計(jì)該基因在作用機(jī)制上也更加接近。

圖5 不同物種ANS基因基于鄰接法的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of ANS genes in different species based on neighbor-joining method

圖6 不同物種ANS基因基于ML系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of ANS genes in different species based on ML

圖7 不同物種ANS基因基于ME系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.7 Phylogenetic analysis of ANS genes in different species based on ME

3 結(jié)論與討論

ANS作為花青素合成后期的關(guān)鍵酶一直受到了廣泛關(guān)注[5]。在花青素生物合成中，ANS 基因發(fā)揮著重要的作用，主要通過2-酮戊二酸離子和Fe2+，將無色的花青素催化成顯色的花青素[6-9]。從生物信息學(xué)角度，以菊花為研究對(duì)象，對(duì)擬南芥、菊花、紅花、辛夷、玫瑰、百合、白桑、茶共計(jì)9種藥用植物的LDOX/ANS基因的核苷酸及氨基酸序列的組成、理化性質(zhì)、信號(hào)肽、親疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。研究結(jié)果顯示，菊花ANS基因全長(zhǎng)1 238 bp，含有1個(gè)完整的開放閱讀框序列，氨基酸為353個(gè)。ANS蛋白分子質(zhì)量為39.59 kD，屬于穩(wěn)定蛋白，ANS屬于非分泌性蛋白，亞細(xì)胞定位位于細(xì)胞質(zhì)，沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，與信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果一致。對(duì)菊花ANS二級(jí)結(jié)構(gòu)域三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析表明，菊花具有穩(wěn)定的青花素合成酶結(jié)構(gòu)，推斷在青花素代謝途徑中，菊花ANS基因保守，意味著代謝中具有重要的、不可替代的作用。通過3種系統(tǒng)進(jìn)化分析方法得到的結(jié)果一致較高，其中菊科紅花和菊科菊花在3種統(tǒng)計(jì)中的結(jié)果高度一致，在進(jìn)化分支上，得到的結(jié)果都是分為一支，這與形態(tài)學(xué)上的分類是一致的。結(jié)果顯示，菊花ANS基因及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)等多個(gè)方面與其他植物有較高的一致性，推測(cè)菊花ANS基因的重要性與其他植物生物學(xué)功能具有相同或相似的特點(diǎn)，后期如開展實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)一步驗(yàn)證。