甘鈺華，魏 群，馬湘蒙，楊尚茹，毛 瑞

（廣西大學(xué) 資源環(huán)境與材料學(xué)院，南寧 530004）

微藻在廢水處理方面具有巨大的潛力，廢水的處理效率在很大程度上取決于微藻的生長情況。微藻的培養(yǎng)受到光照、溫度、溶解氧、pH、營養(yǎng)物質(zhì)等參數(shù)的影響[1-2]，其中光照是影響微藻光合作用的重要因素之一[3-4]。光強(qiáng)度和光質(zhì)是光照的兩個(gè)重要參數(shù)，對微藻生長具有重要的調(diào)控作用[5]。光強(qiáng)度過高會(huì)導(dǎo)致光氧化和光抑制，而光強(qiáng)度過低會(huì)由于光限制導(dǎo)致微藻生長速率下降[6]。特定波長會(huì)影響微藻的生長和細(xì)胞生理指標(biāo)[7-8]，Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)Spirulina platensis在紅光照明下的生物量積累速率要高于藍(lán)光和白光。Shu等[10]研究表明Chlorella sp.在藍(lán)光照明下的脂質(zhì)含量比紅光高。Blair等[11]采用藍(lán)光照明培養(yǎng)Chlorella vulgaris，與紅光和白光相比，藍(lán)光的生物量有所增加。Yan等[12]在不同的光質(zhì)下利用Chlorella sp.進(jìn)行沼液的凈化和沼氣的提純，研究結(jié)果表明，紅色∶藍(lán)色=5∶5的混合LED是最佳的光質(zhì)組合，微藻的干重為506.30±38.47 mg/L，總氮（total nitrogen，TN）和總磷（total phosphorus，TP）的去除率分別達(dá)到了77.27±6.35%和79.32±6.83%。綜上所述，光質(zhì)在微藻的生長過程中起著重要的作用，由于微藻細(xì)胞代謝途徑、光合色素積累和光受體的差異，不同的光質(zhì)條件可能影響微藻的生長和脫氮除磷效率。

目前，微藻的補(bǔ)光研究基本上都是集中于補(bǔ)充光強(qiáng)、延長光周期或組合光對微藻生長的影響[13-17]，而針對白光條件下補(bǔ)充某特定光質(zhì)對微藻生長影響和脫氮除磷效果的研究甚少。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了白紅光（WR）、白藍(lán)光（WB）、白綠光（WG）和白光（W）的光質(zhì)組合，比較分析了在不同補(bǔ)光條件下的蛋白核小球藻的光密度（OD680）、生長速率、脂質(zhì)含量和光合色素含量等指標(biāo)變化情況以及脫氮除磷效果。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

（1）藻種：蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）購自中國科學(xué)院水生生物研究所。

（2）補(bǔ)光光源：耐特輝LED（長330 mm、寬22 mm、高34 mm），功率為4 W。補(bǔ)充光源的三種LED分別為藍(lán)光B（390～455 nm）、綠光G（492～580 nm）和紅光R（622～760 nm）；白光W（400～700 nm）作為對照。三個(gè)實(shí)驗(yàn)組為WR、WB、WG，對照組為W，實(shí)驗(yàn)通過調(diào)整紅藍(lán)綠LED燈的距離將光量子通量密度（photosynthetic photon flux density，PPFD）控制在80 μmol/（m2·s)。

（3）模擬生活污水：模擬生活污水的配方[18]見表1。

表1 模擬生活污水配方Table 1 Formula of simulated domestic wastewater

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 微藻擴(kuò)培

記號(hào)筆、量筒、酒精燈、玻璃棒等物品與高壓滅菌冷卻后的BG-11培養(yǎng)基[19]一同置于超凈工作臺(tái)中紫外滅菌30 min，然后按藻液與培養(yǎng)基1∶10的比例接種，用牛皮紙密封錐形瓶口并搖勻。在25±1℃、光強(qiáng)6 000 lx連續(xù)光照下培養(yǎng)，每天定時(shí)搖瓶3次。

1.2.2 LED補(bǔ)光對蛋白核小球藻生長和脫氮除磷的影響實(shí)驗(yàn)

藻液取樣放入離心管，將樣品放入離心機(jī)，以4 000 r/min離心10 min，去除上清液并用純水洗滌，以上步驟重復(fù)3次（防止培養(yǎng)基中的氮磷元素以及微藻代謝物對新的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾），獲得的蛋白核小球藻備用；將蛋白核小球藻和配制好的模擬生活污水混合在1 L錐形瓶中，藻液體積為800 mL，初始OD680值為0.20，初始pH為7.0±0.1。用氣泵以1 vvm（air volume/culture volume/minute）的速度供應(yīng)二氧化碳用于微藻生長。在25±1℃和6 000 lx條件下進(jìn)行4 d的實(shí)驗(yàn)，測定OD680、光合色素和脂質(zhì)含量、TN和TP等指標(biāo)。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行樣。

1.3 指標(biāo)檢測方法

（1）OD680：用分光光度法測定[20]。

（2）光合色素：采用Cheirsilp等[21]的改良方法進(jìn)行測量。取5 mL藻液加入離心管中，4 000 r/min離心10 min后倒掉上清液。往離心管中加入5 mL 90%丙酮對色素進(jìn)行提取，超聲破碎10 min。劇烈渦旋2 min混勻，在4℃的黑暗環(huán)境中反應(yīng)2 h后以4 000 r/min離心10 min，在450 nm、630 nm、664 nm、647 nm、750 nm處，以90%丙酮作為空白參比，測量上清液的吸光度。

葉綠素a（Chlorophyll a,Chl a）、葉綠素b（Chlorophyll b,Chl b）的含量根據(jù)式（1）和（2）計(jì)算：

類胡蘿卜素（Car）的含量根據(jù)式（3）[22]計(jì)算：

式中：CChla，CChlb，CCar的含量單位為mg/L；A表示在一定波長（450 nm，630 nm，647 nm，750 nm）的吸光度值。

（3）脂質(zhì)含量：采用氯仿甲醇共溶劑提取法[23]。取20 mL藻液滴入離心管中，以8 000 r/min離心10 min后倒掉上清液。往離心管中加入15 mL氯仿/甲醇（2∶1）溶液和150 μL 1 mol/L HCl溶液，將離心管橫置于搖床上震蕩3 h后加入5 mL 0.9%NaCl溶液，渦旋2 min混勻后以8 000 r/min離心10 min。用無菌注射器將離心分層的有機(jī)相抽取至已稱重的錫紙盤內(nèi)，隨后將錫紙盤置于通風(fēng)櫥的電熱板中80℃干燥至恒重[24]，按照式（4）計(jì)算。

式中：Wlipid為微藻脂質(zhì)含量，%；Li和DWi分別為第i天的微藻脂質(zhì)產(chǎn)量和藻粉的質(zhì)量，均為g。

（4）TN：用過硫酸鉀氧化-紫外分光光度法測定。

（5）TP：用鉬酸銨分光光度法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

氮和磷去除率R，微藻的比生長率μ，微藻生物量產(chǎn)率P的計(jì)算公式如下：

式中：R為氮和磷去除率，%；Ci和C0分別為第i天和初始的氮磷濃度，mg/L。μ為比生長速率，d-1；Xi和X0分別為第i天的微藻濃度和初始微藻濃度，g/L。P為生物量產(chǎn)率，g/（L·d）。

2 結(jié)果與討論

2.1 數(shù)據(jù)處理

2.1.1 OD680、比生長速率μ和生物量產(chǎn)率P

不同補(bǔ)光條件下蛋白核小球藻的生長情況如圖1所示。從圖1可知，實(shí)驗(yàn)組和對照組的微藻在實(shí)驗(yàn)前2 d內(nèi)迅速生長繁殖，而后生長趨于平緩。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后WR、WB、WG實(shí)驗(yàn)組和W對照組的OD680分別為 1.908、2.032、1.923、1.459。因此，相比于對照組，補(bǔ)充紅光、藍(lán)光和綠光均可刺激蛋白核小球藻生長，但是微藻的生長情況因光質(zhì)的變化而不同，與Mutaf等[25]、Gordon等[26]的研究結(jié)論一致。

圖1 不同補(bǔ)光下蛋白核小球藻的OD680隨時(shí)間的變化Fig.1 Chlorella pyrenoidosa OD680changes with different supplementary light over time

不同補(bǔ)光下蛋白核小球藻的比生長速率和生物量產(chǎn)率變化情況，如圖2所示。由圖2可知，WB實(shí)驗(yàn)組的比生長速率和生物量產(chǎn)率均為最高，分別為0.12/d、0.096 g/（L·d）；WR實(shí)驗(yàn)組次之，比生長速率和生物量產(chǎn)率分別為0.10/d、0.084 g/（L·d）；WG實(shí)驗(yàn)組最低，比生長速率和生物量產(chǎn)率分別為0.06/d、0.051 g/（L·d）。蛋白核小球藻的光合色素對不同種類的光質(zhì)的吸收存在差異，進(jìn)而影響微藻的光合速率，因而在不同補(bǔ)光條件下的蛋白核小球藻呈現(xiàn)出不同的比生長速率，蛋白核小球藻細(xì)胞對藍(lán)光具有極強(qiáng)的光捕獲能力。另外，由于藍(lán)光促進(jìn)了微藻光合作用中酶的活性和能量傳遞等活動(dòng)[27]，從而加快微藻的生長速度，因此，WB組的微藻生物量產(chǎn)率更高。

圖2 不同補(bǔ)光下蛋白核小球藻的比生長速率和生物量產(chǎn)率Fig.2 Specific growth rate(μ)and biomass productivity(P)of Chlorella pyrenoidosa under different supplementary light

2.1.2 光合色素

不同補(bǔ)光下蛋白核小球藻的光合色素含量情況如圖3所示。由圖3可知，實(shí)驗(yàn)組的微藻光合色素含量為：WG＞W(wǎng)R＞W(wǎng)B＞W(wǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，WG實(shí)驗(yàn)組蛋白核小球藻的光合色素含量明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)4 d后WG組的Chl a、Chl b和Car含量分別達(dá)到了10.61 mg/L、3.52 mg/L、4.52 mg/L；WR實(shí)驗(yàn)組的Chl a、Chl b和Car含量分別達(dá)到了8.21 mg/L、2.57 mg/L、3.58 mg/L；WB 實(shí)驗(yàn)組的Chl a、Chl b和Car含量分別達(dá)到了6.98 mg/L、2.38 mg/L、3.44 mg/L。相比之下，W對照組的光合色素含量最低，Chl a、Chl b和Car含量分別為5.23 mg/L、1.56 mg/L、2.57 mg/L。綜上所述，蛋白核小球藻在綠光脅迫條件下，通過調(diào)整其光系統(tǒng)復(fù)合體中捕獲光子的“觸角”來響應(yīng)環(huán)境的變化[28]，合成更多主要吸收紅藍(lán)光質(zhì)的Chl a和Chl b，微藻濃度和光合色素含量之間卻無線性關(guān)系[29]，因此，盡管在WB的光照條件下蛋白核小球藻的生物量產(chǎn)率和比生長速率最高，但不是誘導(dǎo)色素合成的最有效光照組合。

圖3 不同補(bǔ)光下蛋白核小球藻的光合色素含量Fig.3 Photosynthetic pigments content of Chlorella pyrenoidosa under different supplementary light

2.1.3 脂質(zhì)含量

不同補(bǔ)光下蛋白核小球藻的脂質(zhì)含量隨時(shí)間的變化如圖4所示。由圖4可知，WR實(shí)驗(yàn)組生長2 d后的蛋白核小球藻脂質(zhì)含量由初始值20.16%降到15.24%，而后回升，第4 d蛋白核小球藻的脂質(zhì)含量達(dá)到干重的24.01%。高脂質(zhì)含量通常伴隨著較低的生長速率與高脂質(zhì)產(chǎn)量[30]，WR實(shí)驗(yàn)組蛋白核小球藻在前2 d迅速生長繁殖，第3、4 d微藻生長速率有所減緩，因此，WR實(shí)驗(yàn)組短期內(nèi)（前2 d）蛋白小球藻脂質(zhì)含量較低，而在第4 d蛋白核小球藻的脂質(zhì)含量回升到了24.01%。與WR實(shí)驗(yàn)組相反的是，WB實(shí)驗(yàn)組的蛋白核小球藻生長2 d后的脂質(zhì)含量由初始值20.16%增加到22.6%，而到第4 d又降低到17.70%，這可能是由于藍(lán)光可以有效刺激碳酸酐酶（CA酶）和核酮糖二磷酸羧化酶（Rubisco酶）的活性，從而在微藻細(xì)胞體內(nèi)積累甘油三酯。但是由于藍(lán)光的能量較高，長時(shí)間的藍(lán)光應(yīng)激不利于微藻脂質(zhì)的積累[31]。

圖4 不同補(bǔ)光下蛋白核小球藻脂質(zhì)含量隨時(shí)間的變化Fig.4 Changes of lipid content of Chlorella pyrenoidosa under different supplementary light over time

補(bǔ)充綠光可以刺激蛋白核小球藻脂質(zhì)積累，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)WG實(shí)驗(yàn)組的微藻脂質(zhì)含量最高，達(dá)到27.67%，表明較高的脂質(zhì)產(chǎn)量需要一定的壓力脅迫，綠光可能觸發(fā)了微藻中與脂質(zhì)相關(guān)的代謝反應(yīng)使其得到較高的脂質(zhì)產(chǎn)量，例如，蛋白質(zhì)和DNA等細(xì)胞內(nèi)化合物的降解以及脂質(zhì)和碳水化合物等能量豐富的化合物的積累[32]。

2.2 補(bǔ)光對蛋白核小球藻脫氮除磷的影響

2.2.1 TN濃度變化

不同補(bǔ)光下蛋白核小球藻的TN濃度隨時(shí)間變化情況如圖5所示。由圖5可知，在WR、WB、WG實(shí)驗(yàn)組和W對照組中，TN由初始平均濃度58.61 mg/L分別降至5.32 mg/L、7.57 mg/L、9.28 mg/L和3.66 mg/L，去除率分別為90.92%、87.08%、84.17%和93.76%。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)WR實(shí)驗(yàn)組在前2 d的TN去除效果比其他實(shí)驗(yàn)組差，微藻細(xì)胞對氮的吸收速率較低。因?yàn)榈奈账俾适怯绊懳⒃寮?xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成的關(guān)鍵因素[33]，因此，WR實(shí)驗(yàn)組前2 d的脂質(zhì)含量最低（圖5）。

圖5 不同補(bǔ)光下TN濃度隨時(shí)間的變化Fig.5 Changes of TN concentration with different supplementary light over time

2.2.2 TP濃度變化

不同補(bǔ)光下蛋白核小球藻的TP濃度隨時(shí)間的變化情況如圖6所示。由圖6可知，WR、WB和WG實(shí)驗(yàn)組的TP濃度由初始值10 mg/L分別降至1.06 mg/L、0.96 mg/L和1.08 mg/L，而W對照組TP濃度僅降到2.72 mg/L。WR、WB和WG實(shí)驗(yàn)組的TP去除率分別達(dá)到了89.4%、90.4%和89.2%，而W對照組的TP去除率為72.8%。表明補(bǔ)充紅光、藍(lán)光和綠光均能提高蛋白核小球藻的磷去除率。微藻對磷酸鹽的吸收率受到光質(zhì)的影響，并且藍(lán)光可以提高微藻細(xì)胞對的吸收率[34]。另外，由于藍(lán)光促進(jìn)了微藻光合作用中酶（CA酶和Rubisco酶）的活性，提高了磷酸鹽在微藻光合作用過程中被利用的速率，因而WB實(shí)驗(yàn)組磷的去除率高于WR和WG實(shí)驗(yàn)組。

圖6 不同補(bǔ)光下TP濃度隨時(shí)間的變化Fig.6 Changes of TP concentration with different supplementary light over time

從圖6可知，前2 d的TP去除速率較高，這是因?yàn)楦邼舛攘状龠M(jìn)蛋白核小球藻的短時(shí)間吸附和吸收，使其具有更高的磷吸收速率[35]。此外，相比于碳源和氮源，微藻細(xì)胞對磷源的需求量不大，微藻細(xì)胞對于磷吸附去除在于過量吸附，微藻細(xì)胞處理富含磷的污水后，細(xì)胞中的“磷庫”儲(chǔ)存充足并達(dá)到磷吸附飽和狀態(tài)，因此，蛋白核小球藻處理污水的第2～3 d內(nèi)磷濃度變化不大。微藻消耗細(xì)胞中儲(chǔ)存的“磷庫”進(jìn)行細(xì)胞增殖后繼續(xù)吸附磷，從而繼續(xù)吸附/吸收污水中的磷酸鹽，因此，在第4 d污水中的磷濃度有所下降。

3 結(jié)論

1）補(bǔ)充藍(lán)光有利于蛋白核小球藻的生長，提高微藻生物量產(chǎn)率。WB實(shí)驗(yàn)組的比生長速率μ和生物量產(chǎn)率P分別為0.12/d和0.096 g/（L·d）。

2）補(bǔ)充綠光有利于蛋白核小球藻脂質(zhì)積累。WG實(shí)驗(yàn)組蛋白核小球藻處理污水4 d后的脂質(zhì)含量從初始時(shí)的20.16%提高到27.67%。

3）補(bǔ)光能提高蛋白核小球藻除磷效果。在WR、WB和WG光照條件下的磷去除率均比W對照組高；WB光照的TP去除率最高，達(dá)到90.4%。