高武林，韋超，郭曉燁

(北京市房山區(qū)第一醫(yī)院 普外科，北京 102400)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上第六大常見惡性腫瘤，也是我國癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]。在我國，大約有1億人是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)攜帶者，這與70%～90%的肝癌進(jìn)展有關(guān)[2]。外科手術(shù)被認(rèn)為是HCC最主要的治療方案。但即使是根治性切除，術(shù)后仍有較多患者復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，其遠(yuǎn)期生存預(yù)后仍不理想[3]。因此，迫切需要尋找評估HBV-HCC治療反應(yīng)和預(yù)后的可靠預(yù)測因子?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一個結(jié)構(gòu)上相關(guān)但遺傳學(xué)不同的含鋅酶家族，參與調(diào)節(jié)癌細(xì)胞生長、分化、凋亡和免疫監(jiān)控[4]。MMP-9作為一種分泌蛋白酶，可通過促進(jìn)新血管形成和淋巴管生成加速腫瘤轉(zhuǎn)移，在癌細(xì)胞侵襲、腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤血管生成中起重要作用[5]。先前已在不同的惡性腫瘤組織中觀察到MMP-9的過度表達(dá)，其過表達(dá)通常與不良預(yù)后有關(guān)[6-7]。但是國內(nèi)臨床學(xué)者對于MMP-9在HBV-HCC患者預(yù)后中的作用關(guān)注度有限。因此，本研究通過分析術(shù)前血清MMP-9與HBV-HCC患者臨床特征的關(guān)系，旨在探討術(shù)前血清MMP-9對HBV-HCC患者肝切除術(shù)后生存的預(yù)測作用，為尋找可靠的生物標(biāo)志物和改進(jìn)臨床治療策略提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年1月至2016年11月在我院普外科行根治性肝切除術(shù)的868例HBV-HCC患者(HBV-HCC組)的臨床資料，其中男727例，女141例，年齡12～82歲，中位年齡50.0歲。所有患者術(shù)前均接受常規(guī)評估，包括完整的血液學(xué)和血清生化檢查、計算機(jī)斷層掃描(CT)和磁共振成像(MRI)掃描。納入標(biāo)準(zhǔn)：HCC的診斷是基于特異性影像學(xué)表現(xiàn)，α-甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)升高≥400 ng·ml-1持續(xù)1個月或AFP≥200 ng·ml-1持續(xù)2個月，或組織學(xué)確認(rèn)[8]；無肝外轉(zhuǎn)移證據(jù)；HBV表面抗原(HBV surface antigen，HBsAg)檢測陽性；術(shù)后經(jīng)病理檢查無殘余腫瘤及切緣陰性(R0)。排除標(biāo)準(zhǔn)：除乙型肝炎以外的其他傳染病，如丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或艾滋病毒的單一或共同感染；自身免疫性肝炎、藥物性肝炎、酒精性肝病、脂肪性肝炎、肝移植史；入院前3個月消化道出血和(或)輸血；心肺腎等嚴(yán)重功能障礙或其他慢性消耗性疾??；心血管疾病、經(jīng)頸靜脈肝內(nèi)門體分流或門靜脈血栓形成。另外納入250例慢性乙型肝炎(CHB)患者作為CHB組。CHB被定義為在登記前至少6個月內(nèi)HBsAg呈陽性，且沒有肝硬化或肝癌的證據(jù)。根據(jù)病史、體檢結(jié)果、生化、超聲檢查結(jié)果診斷為CHB。選擇277例腎功能和肝功能正常，無任何肝病史、飲酒史、心血管疾病或血液疾病史，排除其他急慢性疾病的健康志愿者納入健康對照組。CHB組、健康對照組人群年齡、性別構(gòu)成與HBV-HCC患者相匹配。該研究得到了本院倫理委員會的批準(zhǔn)，并獲得了書面知情同意書。本研究對患者的后續(xù)管理沒有影響。

1.2 資料收集

收集所有研究對象的人口統(tǒng)計學(xué)和臨床資料，采用日立7600-20全自動生化分析儀測定總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotranseferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、白蛋白(albumin，ALB)水平。上述指標(biāo)的分界值均是根據(jù)檢驗科提供的正常參考范圍而設(shè)定。術(shù)前1周內(nèi)收集所有血液指標(biāo)，根據(jù)病理報告記錄腫瘤最大直徑、病灶數(shù)量、腫瘤Ishak纖維化分期和癌旁組織Ishak炎癥評分，以及肝包膜浸潤情況、分化程度、微血管浸潤和微衛(wèi)星不穩(wěn)定情況。

1.3 血清MMP-9檢測

分別在術(shù)前及術(shù)后隨訪各時間點采集所有受試者清晨空腹靜脈血5 ml于抗凝管中，置于4 ℃環(huán)境下，4 000 r·min-1離心15 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存待測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血清MMP-9和AFP水平，試劑盒均購自武漢菲恩生物科技有限公司。所有檢測均由對研究終點不知情的技術(shù)人員進(jìn)行。

1.4 隨訪

最后一次跟進(jìn)時間是2021年12月31日，或者患者死亡時。術(shù)后第1年，每3個月隨訪1次，隨后每3～6個月隨訪1次。每次隨訪由專業(yè)醫(yī)生獨立進(jìn)行血液學(xué)檢測和肝臟超聲檢查。每6個月進(jìn)行1次腹部CT掃描。如果懷疑復(fù)發(fā)，立即進(jìn)行CT或MRI檢查以確認(rèn)診斷。確診復(fù)發(fā)的患者接受進(jìn)一步治療。如果復(fù)發(fā)的腫瘤是局限性的，建議進(jìn)行二次肝切除、射頻消融或經(jīng)皮乙醇注射。如果復(fù)發(fā)的腫瘤是多發(fā)性或彌漫性的，則進(jìn)行經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞。治療決定基于復(fù)發(fā)模式和肝功能儲備。無病生存期(disease-free survival，DFS)定義為手術(shù)日期至復(fù)發(fā)、任何原因死亡或已知患者無病的最后日期之間的時間?？偵嫫?overall survival，OS)定義為手術(shù)日期至隨訪截止時間或死亡時間。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均使用SPSS 26.0軟件輸入和分析。用中位值(IQR)描述連續(xù)變量，3組間比較采用K-W檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney檢驗；二分類變量以率(%)表示，并進(jìn)行卡方檢驗。繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線以確定血清MMP-9的診斷價值。建立Kaplan-Meier生存曲線，并采用COX回歸比例風(fēng)險模型分析影響HBV-HCC患者術(shù)后生存預(yù)后的危險因素。統(tǒng)計學(xué)顯著性假設(shè)為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 3組受試者血清MMP-9水平比較

與健康對照組[27.82(9.45，41.50)ng·ml-1]比較，CHB組[37.46(13.51，91.24)ng·ml-1]和HBV-HCC組[74.60(46.70，122.08)ng·ml-1]患者血清MMP-9水平均有所升高(H=11.274，P<0.05)，且HBV-HCC組患者基線血清MMP-9水平顯著高于CHB組(Z=-6.081，P<0.05)。經(jīng)ROC曲線分析，血清MMP-9水平用于區(qū)分CHB和HBV-HCC的曲線下面積(AUC)為0.726(95%CI：0.693～0.760)，用于診斷HBV-HCC的AUC為0.773(95%CI：0.742～0.804)，見圖1。

圖1 基線血清MMP-9水平用于區(qū)分HBV-HCC和CHB(A)、HBV-HCC和CHB+健康對照(B)的ROC曲線Fig 1 ROC curve of baseline serum MMP-9 level used to distinguish HBV-HCC vs. CHB (A) or HBV-HCC vs. CHB+healthy control (B)

2.2 MMP-9水平與HCC患者不同臨床特征的關(guān)系

根據(jù)MMP-9水平中位值將患者分為低MMP-9組(<74.60 ng·ml-1)和高M(jìn)MP-9組(≥74.60 ng·ml-1)。血清MMP-9的表達(dá)與患者腫瘤直徑、病灶數(shù)量、BCLC分期、HBV-DNA、肝包膜浸潤、分化程度、微血管浸潤、微衛(wèi)星不穩(wěn)定有關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、性別、AFP、白蛋白-膽紅素(ALBI)評分、白細(xì)胞(WBC)、淋巴細(xì)胞計數(shù)(TLC)、血小板(PLT)、TBIL、ALT、AST、ALB、癌旁組織Ishak炎癥評分、Ishak纖維化均無關(guān)(P>0.05)，見表1。

表1 MMP-9水平與HBV-HCC患者不同臨床特征的關(guān)系Tab 1 Relationship between MMP-9 level and different clinical features of patients with HBV-HCC

(續(xù)表)

2.3 MMP-9水平與HCC患者肝切除術(shù)后生存的關(guān)系

隨訪期間，高M(jìn)MP-9組和低MMP-9組術(shù)后中位生存時間分別為29、49個月，高M(jìn)MP-9組1、3、5年OS分別為73.9%(321/434)、44.0%(191/434)、32.9%(143/434)，低MMP-9組1、3、5年OS分別為99.3%(431/434)、85.0%(369/434)、74.9%(325/434)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Log Rankχ2=202.610，P<0.001)；高M(jìn)MP-9組1、3、5年DFS分別為52.7%(229/434)、24.6%(107/434)、8.7%(38/434)，低MMP-9組1、3、5年DFS分別為85.2%(370/434)、58.0%(252/434)、24.6%(107/434)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Log Rankχ2=149.134，P<0.001)。見圖2。

圖2 隨訪5年期間Kaplan-Meier曲線Fig 2 Kaplan-Meier curve during 5-year follow-up

2.4 Cox回歸分析

經(jīng)單因素和多因素Cox回歸比例風(fēng)險模型分析，術(shù)前血清MMP-9、ALBI、AFP、PLT、腫瘤直徑、分化程度、有無微血管浸潤和微衛(wèi)星不穩(wěn)定是影響患者OS的獨立危險因素(P<0.05)，術(shù)前血清MMP-9水平、腫瘤直徑、病灶數(shù)量、HBVDNA、AST、有無微血管浸潤和微衛(wèi)星不穩(wěn)定是影響患者DFS的獨立危險因素(P<0.05)，見表2。

表2 單因素和多因素Cox回歸分析影響術(shù)后生存預(yù)后的危險因素Tab 2 Risk factors influencing postoperative survival prognosis by univariate and multivariate Cox regression analysis

3 討 論

HCC是最常見的惡性腫瘤之一，肝切除術(shù)后生存預(yù)后較差[1]。HBV感染可促進(jìn)術(shù)后復(fù)發(fā)，引起過度炎癥，損害殘余肝功能，加重肝切除術(shù)后殘肝纖維化，降低HBV-HCC患者肝切除術(shù)后的生存率[9]。因此，尋找一些可以預(yù)測術(shù)后生存預(yù)后的潛在標(biāo)志物將有助于更有針對性的預(yù)防治療。本研究結(jié)果顯示，HBV感染患者血清MMP-9水平較健康對照人群普遍升高，且HBV-HCC患者較CHB患者升高更明顯，高M(jìn)MP-9水平是HBV-HCC預(yù)后的獨立危險因素，并與疾病進(jìn)展、HBV DNA拷貝數(shù)有關(guān)，進(jìn)一步經(jīng)ROC曲線證實，血清MMP-9水平可在慢性HBV感染中高度區(qū)分HCC和非HCC疾病。此外，血清MMP-9水平升高也與HBV-HCCMMPs主要作為無活性的前蛋白分泌并在被其他細(xì)胞外蛋白酶切割后激活，在血管生成、細(xì)胞遷移以及一些病理進(jìn)展(包括癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移)中發(fā)揮作用[4]。MMP-9是Ⅳ型膠原酶，對基底膜具有很高的活性，可降解細(xì)胞外基質(zhì)[10]。研究證實，包含整合的HBV基因組的Hep3B細(xì)胞能夠持續(xù)分泌HBsAg，并表達(dá)HBV基因組RNA，從而促進(jìn)MMP-9前體分子(proMMP-9)分泌[11]。通過酶譜分析，在Hep3B細(xì)胞中可檢測到少量活性MMP-9，而感染HBV的Hep3B細(xì)胞中MMP-9表達(dá)迅速上調(diào)?；钚訫MP-9表達(dá)上調(diào)會進(jìn)一步促進(jìn)纖溶酶的侵襲潛力[12]，這也部分解釋了HBV感染者血清MMP-9水平升高的原因。此外，從分子機(jī)制分析，MMP-9被認(rèn)為是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控因子，腫瘤細(xì)胞中MMP-9的過表達(dá)會增強(qiáng)基底膜的降解，促進(jìn)附近血管的侵襲，然后向遠(yuǎn)處組織外溢形成新的轉(zhuǎn)移位點[13]。MMP-9是屬于鋅金屬蛋白酶家族的經(jīng)典酶，參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解；而腫瘤的惡性進(jìn)展通常伴隨細(xì)胞外基質(zhì)的降解[14]，因此HBV-HCC患者血清MMP-9水平較CHB組患者會進(jìn)一步升高。

患者預(yù)后不良相關(guān)。這些結(jié)果均支持MMP-9參與HBV-HCC的發(fā)生和進(jìn)展，表明血清MMP-9水平的測定不僅對HBV-HCC具有診斷價值，還具有良好的預(yù)后預(yù)測價值。

目前MMP-9已被證明在人肝癌細(xì)胞和各種其他類型的癌癥中分泌，包括肺癌、結(jié)腸癌、胃癌和乳腺癌，并與胃癌和胰腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)[6-7]。在微環(huán)境方面，各種基質(zhì)細(xì)胞被迫招募并定位于惡性腫瘤，增強(qiáng)了原發(fā)癌的侵襲性，促進(jìn)了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，進(jìn)而導(dǎo)致患者治療失敗或預(yù)后不良[15-16]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages，TAMs)與骨髓來源的抑制細(xì)胞相關(guān)，是促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的炎癥的關(guān)鍵原型組成部分。實體腫瘤通常被巨噬細(xì)胞浸潤。有研究[17]認(rèn)為MMP-9主要是由TAMs分泌，通過MMP-9/PI3K/AKT/Snail依賴途徑誘導(dǎo)腫瘤上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，這可能是導(dǎo)致術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的重要機(jī)制之一，而阻斷MMP-9信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)有望成為抑制胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)的潛在策略之一。同樣地，Wu等[14]也證實MMP-9的表達(dá)主要是由錨定在多形核中性粒細(xì)胞表面的CD11b/CD18整合素誘導(dǎo)的，CD11b/CD18則來源于HCC基質(zhì)M2外顯子。因此即使手術(shù)切除腫瘤組織，殘余的TAMs仍可促進(jìn)MMP-9釋放，MMP-9可以減弱血管和淋巴管的基底膜，使癌細(xì)胞直接浸潤到血管系統(tǒng)，參與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲[18]。在之前的對HCC患者研究[19-21]顯示，MMP-9表達(dá)已被證明是侵襲性、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良的標(biāo)志物。這些基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)均明確證實MMP-9促癌因子的活性，這也從分子機(jī)制方面解釋了本研究結(jié)果，即術(shù)前血清MMP-9水平升高預(yù)示著HBV-HCC患者預(yù)后不良。另外還需說明的一點，本研究中血清MMP-9水平與AFP無關(guān)，且MMP-9對預(yù)后的影響也是獨立于AFP的表達(dá)，提示血清MMP-9水平有可能作為HBV-HCC(包括AFP陰性HCC)的預(yù)后生物標(biāo)志物。

綜上，本研究表明血清MMP-9水平升高與HBV-HCC的不良預(yù)后相關(guān)，這點支持了MMP-9參與疾病進(jìn)展以及血清MMP-9作為HBV-HCC預(yù)后生物標(biāo)志物的可能性。為了證實這些結(jié)果，還需要對與各種病因相關(guān)的大樣本HCC患者進(jìn)行研究。