郭欣，郭楠，蔡云朗，徐延華

(1.濟(jì)南市婦幼保健院 婦科，山東 濟(jì)南 250000； 2.山東省第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院 藥學(xué)部，山東 濟(jì)南 250000； 3.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210009)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，因早期癥狀不易被發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者就診時(shí)已處于晚期[1]。盡管目前抗血管生成藥物及聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly[ADP-ribose]polymerase,PARP)抑制劑在卵巢癌的治療中已處于一線地位，但紫杉醇聯(lián)合鉑類的方案仍是治療基石。對(duì)于無PARP基因突變的患者，臨床治療仍以化療為主。紫杉醇聯(lián)合鉑類藥物的化療方式使得卵巢癌患者的5年生存率接近50%，在有效治療后仍有約70%的患者復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)瘤表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性。腫瘤組織中的腫瘤干細(xì)胞在腫瘤的增殖、侵襲、復(fù)發(fā)、耐藥等過程中發(fā)揮著重要作用[2-3]。本課題組前期通過中空介孔二氧化硅(hollow mesoporous silica nanoparticles,HMSN)設(shè)計(jì)的HMSN-COOH@DOXfluorescence NVP包載阿霉素(doxorubicin,DOX)及胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)特異性的阻斷劑NVP-AEW541，可有效逆轉(zhuǎn)卵巢癌干細(xì)胞的耐藥性，促進(jìn)其凋亡，抑制其增殖[4]。但前期實(shí)驗(yàn)均在二維平面上進(jìn)行，為進(jìn)一步檢測此復(fù)合載藥系統(tǒng)的化療效果，本研究設(shè)計(jì)了三維細(xì)胞培養(yǎng)模型，此培養(yǎng)平臺(tái)上的細(xì)胞形態(tài)及微環(huán)境更接近體內(nèi)真實(shí)狀態(tài)，藥物、營養(yǎng)物質(zhì)和氣體擴(kuò)散屬性更接近于活體組織，并且可以與相鄰細(xì)胞建立更為緊密的聯(lián)系，同時(shí)也可更為精確地預(yù)測動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

1972年，研究者們就已經(jīng)開始探究細(xì)胞在平面及具備黏附功能的三維立體結(jié)構(gòu)中的生長差異[5]。Bissell的研究強(qiáng)調(diào)了三維細(xì)胞培養(yǎng)在創(chuàng)建精準(zhǔn)體外模型中的重要作用，并使三維細(xì)胞培養(yǎng)的理念及其獨(dú)特的仿生性等優(yōu)勢(shì)被認(rèn)同[6]。構(gòu)建三維細(xì)胞仿生模型的宗旨即為使得單個(gè)細(xì)胞可維持正常的三維形狀，具備同在體相似的分化、接受及傳遞信號(hào)等功能?；谌S仿生模型在細(xì)胞分化、異質(zhì)性、信息傳遞、基因表達(dá)等方面的優(yōu)勢(shì)，使其成為藥物篩選、精準(zhǔn)醫(yī)療等方面不可或缺的一部分[7-9]。

本研究采用的三維培養(yǎng)平臺(tái)為光子晶體微載體，光子晶體微載體利用單乳液微流控裝置生成單分散乳液液滴，再經(jīng)緩慢干燥固化使得二氧化硅納米粒子自組裝形成光子晶體微載體，并通過高溫煅燒提高微載體的機(jī)械強(qiáng)度。由于微載體是通過單分散的二氧化硅納米粒子自組裝得到的，其納米粒子之間會(huì)形成貫通的納米孔道，再將生物相容性水凝膠灌注到載體中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)[10-12]。本研究首先檢測常規(guī)化療藥物DOX、紫杉醇(PTX)、順鉑(CDDP)和5-氟尿嘧啶(5-FU)在三維培養(yǎng)平臺(tái)和二維培養(yǎng)平面對(duì)CD117+CD44+A2780和A2780細(xì)胞增殖抑制和促凋亡中的作用，再檢測課題組建立的復(fù)合載藥系統(tǒng)在三維和二維培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)兩株細(xì)胞的化療效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

CD117+CD44+A2780和A2780細(xì)胞株購自南京凱基生物公司，光子晶體微載體由東南大學(xué)生物電子學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 干細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)CD117+CD44+A2780，含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)A2780細(xì)胞，均置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長情況3～4 d傳代1次。

1.2.2 三維細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)的構(gòu)建 分別收集CD117+CD44+A2780和A2780細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)·ml-1。取多個(gè)光子晶體微載體鋪在96孔板的孔洞中，滴加1 ml的細(xì)胞懸液于光子晶體微載體表面，添加對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，經(jīng)Hoechst33342染色后熒光顯微鏡觀察并將這些光子晶體微載體轉(zhuǎn)移至6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后熒光顯微鏡再次染色觀察此微載體。

1.2.3 三維培養(yǎng)平臺(tái)及二維培養(yǎng)平面的細(xì)胞增殖 按照1.2.2的方式構(gòu)建光子晶體微載體的三維培養(yǎng)平臺(tái)，細(xì)胞分別在6孔板中培養(yǎng)24、36、48、72 h后，將光子晶體微載體從培養(yǎng)基中取出并放置在平皿中，加入PBS后用吸管用力吹打微載體，顯微鏡下觀察當(dāng)光子晶體微載體表面幾乎無細(xì)胞附著時(shí)取出，離心收集細(xì)胞加入培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。同時(shí)，在相同時(shí)間點(diǎn)胰酶消化收集二維平面培養(yǎng)的細(xì)胞，按照同樣的方式進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.4 三維及二維培養(yǎng)環(huán)境中細(xì)胞的化療敏感性 按照上述方式構(gòu)建兩株細(xì)胞的三維培養(yǎng)平臺(tái)，待光子晶體微載體轉(zhuǎn)至6孔板后分別加入DOX、PTX、CDDP和5-FU，調(diào)整終濃度為20 μg·ml-1。再收集2×105個(gè)·ml-1的CD117+CD44+A2780和A2780細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞的密度接種在6孔板上，加入相應(yīng)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同樣再加入DOX、PTX、CDDP和5-FU，并調(diào)整終濃度為20 μg·ml-1。每組細(xì)胞在與藥物共孵育24 h后通過MTT比色法測定抑制率。

1.2.5 三維及二維培養(yǎng)環(huán)境中細(xì)胞的化療凋亡率 按照1.2.2的方式構(gòu)建光子晶體微載體的三維培養(yǎng)平臺(tái)和相應(yīng)的二維培養(yǎng)平面，待細(xì)胞培養(yǎng)72 h后加入10 μmol的CDDP、DOX、PTX和5-FU共孵育12 h，各組收集5×105個(gè)細(xì)胞，加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞和5 μl Annexin V-FITC混勻后再加入5 μl Propidium Iodide，室溫下避光反應(yīng)5～15 min后上機(jī)檢測各組的細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)對(duì)三維培養(yǎng)細(xì)胞的化療效果 根據(jù)課題組之前的研究，按照同樣的方法構(gòu)建HMSN-COOH@DOXfluorescence NVP復(fù)合載藥系統(tǒng)，取1 mg分散在10 ml PBS中，在三維和二維培養(yǎng)的CD117+CD44+A2780及A2780細(xì)胞中每組分別加入200、400 μl后共孵育12 h，各組收集5×105個(gè)細(xì)胞，加入500 μl的Binding Buffer和5 μl Annexin V-FITC混勻后再加入5 μl Propidium Iodide，室溫下避光反應(yīng)5～15 min 后上機(jī)檢測各組的凋亡率。

1.3 分組

再將實(shí)驗(yàn)分為HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)組和游離藥物組，在三維和二維培養(yǎng)的CD117+CD44+A2780及A2780細(xì)胞中加入400 μl HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)，游離藥物組加入與此等量的游離DOX和NVP，分別與細(xì)胞共孵育12 h 后，按照上述方式檢測各組的細(xì)胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 光子晶體微載體三維細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)的構(gòu)建

將細(xì)胞接種于光子晶體微載體24 h后，經(jīng)熒光顯微鏡觀察可發(fā)現(xiàn)大量的細(xì)胞已附著在此微載體上，接種48 h后附著的細(xì)胞逐漸增多(圖1)。

A.CD117+CD44+A2780接種24 h；B.CD117+CD44+A2780接種48 h；C.A2780接種24 h；D.A2780接種48 h圖1 光子晶體微載體三維細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)A.The CD117+CD44+A2780 cell after inoculated 24 h; B.The CD117+CD44+A2780 cell after inoculated 48 h; C.A2780 cell after inoculated 24 h; D.A2780 cell after inoculated 48 hFig 1 3D cultivation of photonic crystal microcarriers

2.2 三維培養(yǎng)平臺(tái)和二維培養(yǎng)平面的細(xì)胞增殖

分別在24、36、48、72 h后收集三維平臺(tái)及二維培養(yǎng)平面中的CD117+CD44+A2780細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)兩組細(xì)胞量；在相同時(shí)間點(diǎn)收集兩種培養(yǎng)平臺(tái)或平面中的A2780細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)兩組細(xì)胞量(表1)。CD117+CD44+A2780細(xì)胞在三維培養(yǎng)平臺(tái)的增殖速度要明顯快于同時(shí)間的二維培養(yǎng)平面(P<0.05)，同樣A2780細(xì)胞在三維培養(yǎng)平臺(tái)的生長速度也顯著增長(P<0.05)，見圖2。

圖2 CD117+CD44+A2780和A2780細(xì)胞在三維培養(yǎng)平臺(tái)和二維培養(yǎng)平面的細(xì)胞增殖Fig 2 The cell proliferation of CD117+CD44+A2780 and A2780 on conventional and three-dimensional bionic platforms

表1 CD117+CD44+A2780和A2780細(xì)胞株在三維培養(yǎng)平臺(tái)和二維培養(yǎng)平面中的細(xì)胞量 ×105個(gè)·ml-1Tab 1 The cell count of CD117+CD44+A2780 and A2780 on conventional and three-dimensional bionic platforms ×105 ml-1

2.3 三維和二維培養(yǎng)環(huán)境中細(xì)胞的化療敏感性

三維和二維培養(yǎng)環(huán)境中20 μg·ml-1的DOX、PTX、CDDP和5-FU對(duì)CD117+CD44+A2780細(xì)胞的抑制率明顯低于對(duì)A2780細(xì)胞的抑制率(P<0.05)(表2)。三維培養(yǎng)環(huán)境中CD117+CD44+A2780細(xì)胞比二維環(huán)境中的CD117+CD44+A2780細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)以上化療藥物更強(qiáng)的耐藥性(P<0.05)，同時(shí)三維培養(yǎng)平臺(tái)中的A2780比二維培養(yǎng)平面上的A2780的耐藥性更強(qiáng)，抑制率更低(P<0.05)(圖3)。

圖3 三維和二維培養(yǎng)環(huán)境中CD117+CD44+A2780和A2780細(xì)胞的化療敏感性(* P<0.05)Fig 3 The chemosensitivity in CD117+CD44+A278 and A2780 cell group on conventional and three-dimensional bionic platforms(* P<0.05)

表2 化療藥物在二維培養(yǎng)平面和三維培養(yǎng)平臺(tái)對(duì)兩組細(xì)胞的抑制率 %Tab 2 The inhibition rate of chemotherapy drugs on two cell groups on conventional and three-dimensional bionic platforms %

2.4 三維和二維培養(yǎng)環(huán)境中細(xì)胞凋亡率

根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果，三維培養(yǎng)環(huán)境中CD117+CD44+A2780和A2780細(xì)胞的凋亡率均低于二維培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)的細(xì)胞(表3)，三維培養(yǎng)環(huán)境中的細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗凋亡作用和耐藥性(P<0.05)(圖4)。

圖4 三維和二維培養(yǎng)環(huán)境中CD117+CD44+A2780和A2780細(xì)胞的凋亡率(* P<0.05)Fig 4 The apoptosis rates in CD117+CD44+A278 and A2780 cell groups on conventional and three-dimensional bionic platforms(* P<0.05)

表3 CD117+CD44+A2780和A2780細(xì)胞株在兩培養(yǎng)平臺(tái)(平面)不同藥物組中的凋亡率 %Tab 3 The apoptosis rates of chemotherapy drugs in two cell groups on conventional and three-dimensional bionic platforms %

2.5 HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)對(duì)三維培養(yǎng)細(xì)胞的化療效果

HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)的用量在200、400 μl時(shí)，A2780在三維和二維培養(yǎng)環(huán)境中的凋亡率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。200 μl HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)對(duì)二維培養(yǎng)的CD117+CD44+A2780細(xì)胞的促凋亡作用要強(qiáng)于三維環(huán)境中培養(yǎng)的細(xì)胞(P<0.05)；當(dāng)HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)的用量提高至400 μl時(shí)，兩種培養(yǎng)環(huán)境中細(xì)胞的凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表4)。不同濃度的HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)對(duì)三維和二維的培養(yǎng)環(huán)境中的細(xì)胞均有較好的促凋亡作用，HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)在三維細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞均展現(xiàn)出較為有效、穩(wěn)定的促凋亡作用。

表4 HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)在三維及二維培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)兩株細(xì)胞的促凋亡作用 %Tab 4 The apoptosis rates of HMSN compound drug delivery system on two cell groups on conventional and three-dimensional bionic platforms %

游離藥物對(duì)三維環(huán)境中培養(yǎng)的CD117+CD44+A2780和A2780細(xì)胞的促凋亡作用均小于二維培養(yǎng)環(huán)境(P<0.05)。在三維培養(yǎng)平臺(tái)中HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)組CD117+CD44+A2780和A2780細(xì)胞的凋亡率顯著高于游離對(duì)照組，說明在三維細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)依然能夠發(fā)揮有效的促凋亡作用，特別是對(duì)耐藥性和抗凋亡作用較強(qiáng)的CD117+CD44+A2780同時(shí)具有高效的殺傷作用，為進(jìn)一步進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)提供了依據(jù)。見表5、圖5。

表5 游離藥物在三維及二維培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)兩株細(xì)胞的促凋亡作用 %Tab 5 The apoptosis rates of free drug on two cell groups on conventional and three-dimensional bionic platforms %

圖5 在三維和二維培養(yǎng)環(huán)境中HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)和游離對(duì)照組CD117+CD44+A2780和A2780細(xì)胞的化療敏感性(* P<0.05)Fig 5 The apoptosis rates of CD117+CD44+A278 and A2780 cells in HMSN compound drug delivery system and free drug groups on conventional and three-dimensional bionic platforms(* P<0.05)

3 討 論

卵巢癌的高死亡率與化療耐藥密切相關(guān)，近些年來針對(duì)卵巢癌的靶向治療一直是探究的熱點(diǎn)，其中借助生物材料的靶向藥物傳輸成為重點(diǎn)的研究方向[13]。針對(duì)卵巢癌研發(fā)的新型藥物除了在常規(guī)的二維培養(yǎng)平面進(jìn)行其藥效的評(píng)估，更重要的是盡量模擬腫瘤細(xì)胞的在體狀態(tài)，將藥物應(yīng)用在三維的細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)中，更為精確地評(píng)估藥效，同時(shí)能更為精準(zhǔn)地預(yù)測動(dòng)物實(shí)驗(yàn)效果。

本研究借助光子晶體微載體構(gòu)建了腫瘤細(xì)胞的三維培養(yǎng)平臺(tái)，光子晶體微載體可為腫瘤細(xì)胞提供有效的附著表面，同時(shí)光子晶體微載體可懸浮在培養(yǎng)基中，卵巢癌細(xì)胞與表面接觸不如二維平面培養(yǎng)中那樣緊密，為卵巢癌細(xì)胞提供了更為立體的仿生的增殖環(huán)境[14-15]。通過熒光顯微鏡觀察，我們可以發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞在光子晶體微載體表面聚集，會(huì)形成丘狀細(xì)胞團(tuán)，此三維培養(yǎng)平臺(tái)既實(shí)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)又實(shí)現(xiàn)了懸浮培養(yǎng)。

在體的腫瘤細(xì)胞常常表現(xiàn)出更為頑強(qiáng)的耐藥性，進(jìn)一步降低了臨床化療的效果，本研究將具有腫瘤干細(xì)胞特性的A2780和耐藥性強(qiáng)的CD117+CD44+A2780細(xì)胞接種培養(yǎng)在光子晶體微載體的三維培養(yǎng)平臺(tái)中[16]，與傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)平面相比，在此三維培養(yǎng)平臺(tái)中細(xì)胞對(duì)常規(guī)的化療藥物敏感性均顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)本研究的光子晶體微載體培養(yǎng)平臺(tái)具有良好的仿生效果，可以作為藥物初步篩選的平臺(tái)。我們課題組基于實(shí)體腫瘤的組織增強(qiáng)滲透和保留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect,EPR)和卵巢癌腫瘤高表達(dá)IGF-1R設(shè)計(jì)了HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)，按照同樣的方式檢測此復(fù)合載藥系統(tǒng)在三維環(huán)境中的化療效果。HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)對(duì)三維培養(yǎng)環(huán)境中的CD117+CD44+A2780和A2780細(xì)胞均展現(xiàn)出較強(qiáng)的促凋亡作用，當(dāng)HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)的劑量達(dá)到400 μl 時(shí)，其對(duì)三維培養(yǎng)和二維培養(yǎng)環(huán)境中的兩株細(xì)胞的促凋亡作用無明顯差異，同時(shí)其促凋亡作用顯著強(qiáng)于等量的游離對(duì)照組，HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)在三維培養(yǎng)平臺(tái)中對(duì)于腫瘤細(xì)胞和耐藥性強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞均可發(fā)揮良好的促凋亡作用。

光子晶體微載體作為新型的生物仿生材料，為腫瘤細(xì)胞的三維培養(yǎng)模型的構(gòu)建提供了基礎(chǔ)，為化療藥物的初步篩選提供了理想的仿生環(huán)境。HMSN復(fù)合載藥系統(tǒng)在三維環(huán)境中對(duì)腫瘤細(xì)胞，特別是耐藥性細(xì)胞仍然能夠發(fā)揮有效的抗腫瘤作用，為其在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和在體實(shí)驗(yàn)效果的預(yù)期提供了有力的依據(jù)。