趙貴軍，諶穎蓮，曾德軍，竭 航，張承露，吳佳勇，封孝蘭

(1. 重慶市藥物種植研究所，重慶 南川 408435；2. 重慶金佛山森林生態(tài)系統(tǒng)野外科學(xué)觀測研究站，重慶 南川 408435)

【研究意義】麝香是名貴的動物中藥材，對于治療心腦血管等疾病具有較好的療效[1-2]，但目前麝香的生物合成機制尚不明確，產(chǎn)量較低，價格昂貴，極大地限制了麝香的臨床應(yīng)用，因此解析麝香的生物合成機制對于麝香生產(chǎn)效能的提高具有重要意義。【前人研究進展】麝鼠香與天然麝香的主要成分相似，是麝香較好的替代品，麝鼠也成為研究麝香生物合成機制的理想動物模型，利用組學(xué)測序分析麝鼠香生物合成過程中產(chǎn)生的中間分子是解析麝鼠香生物合成機制的重要手段[3-6]。麝香酮是麝香的主要藥用和香用化學(xué)成分，學(xué)名3-甲基環(huán)十五烷酮，分子式為C16H30O，麝香中麝香酮含量大于2%[7-8]。前人研究表明，麝香中含有大量的長鏈脂肪酸、固醇類物質(zhì)，提示含有C16的長鏈脂肪酸可能是麝香生物合成過程中產(chǎn)生的次生物質(zhì)[9-12]。麝鼠香與天然麝香含有相同的麝香酮、降麝香酮烷酮等主要成分，可以用做天然麝香的替代品[2-3]，而麝香酮和降麝香酮含有相同的環(huán)碳鏈結(jié)構(gòu)，提示環(huán)碳鏈分子結(jié)構(gòu)的形成對于麝香和麝鼠香的生物合成具有較大的關(guān)聯(lián)性。【本研究切入點】研究通過原代培養(yǎng)分離繁殖期的麝鼠香腺上皮細胞，并用外源雄性激素進行誘導(dǎo)[13-16]，以體香腺和肝臟組織為對照，利用代謝組學(xué)測序的方法分析次生碳鏈分子成分，探明環(huán)碳分子架構(gòu)的生物合成過程，為進一步解析麝香的生物合成機制提供關(guān)鍵信息?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分析麝鼠香次生碳鏈分子成分和環(huán)碳分子架構(gòu)的生物合成過程，為解析麝香的生物合成機理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為麝香的生物體外合成研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

9只12～18月齡繁殖期雄性麝鼠(5—6月)，由重慶市藥物種植研究所動物中心飼養(yǎng)繁育。將麝鼠處死后迅速采集麝鼠香腺和肝臟組織，送至北京諾禾致源生物科技有限公司采用GC-MS進行非靶標(biāo)代謝組學(xué)測序。

胎牛血清(北京沃卡威生物技術(shù)公司)、100×青霉素—鏈霉素雙抗(上海生工生物技術(shù)有限公司)、PBS(北京索萊寶科技有限公司)、胰蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司)、DMEM高糖培養(yǎng)基(北京沃卡威生物技術(shù)公司)、丙酸睪酮(華中藥業(yè)股份有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 麝鼠香腺上皮細胞原代培養(yǎng) 將麝鼠處死后迅速采集麝鼠香腺組織，置于無菌操作臺下使用PBS沖洗后取香囊頂端的香腺剝離剪碎，放入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基的25 cm2細胞培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待組織塊培養(yǎng)2～3 d后，組織塊四周出現(xiàn)單層細胞層，再使用胰酶消化后傳代接種，分為誘導(dǎo)組和對照組，每組3個重復(fù)，待生長匯聚到約50%后，誘導(dǎo)組替換5 mL含有1 mg/mL的丙酸睪酮(Testosterone Propionate，TP)完全培養(yǎng)基，對照組替換無睪酮完全培養(yǎng)基5 mL，培養(yǎng)48 h后收集細胞代謝物，送至北京諾禾致源生物科技有限公司采用GC-MS進行非靶標(biāo)代謝組學(xué)測序。

1.2.2 代謝組學(xué)測序分析 樣品委托北京諾禾致源生物科技有限公司進行非靶標(biāo)代謝組學(xué)測序和結(jié)果注釋，注釋使用高分辨率二級圖譜數(shù)據(jù)庫mzCloud、mzVault及MassList一級數(shù)據(jù)庫進行分子特征峰匹配鑒定，根據(jù)設(shè)置的ppm、信噪比(Signal-to-Noise ratio，S/N)、加合離子等信息進行峰提取，同時對峰面積進行定量分析。通過代謝物表達情況的PCA降維分析，對樣本進行質(zhì)控鑒定；使用KEGG數(shù)據(jù)庫(www.genome.jp/kegg/pathway)對代謝通路進行注釋，并通過抽樣概率對通路進行富集分析，使用R 4.0軟件進行統(tǒng)計分析，利用ggplot2和pheatmap語言包繪制火山圖和熱圖(github.com/YLCHEN1992/cstatplot)，使用GraphPad Prism 9.0繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本的PCA降維分析

降維后變異方差來源分別為PC1和PC2，累計方差值越高代表性越強，以PC1和PC2降維數(shù)值為參考，將樣品投射到二維平面，根據(jù)樣品的聚集情況判斷樣品之間的特征一致性和類型，結(jié)果顯示(圖1)，離體培養(yǎng)的香腺上皮細胞、香腺組織與肝臟組織能被明顯區(qū)分(變異方差來源累計86.381%)，在離體培養(yǎng)的香腺上皮細胞中，TP誘導(dǎo)組和對照組差異不明顯；進一步對離體培養(yǎng)細胞使用共有差異代謝物表達進行降維分析，結(jié)果顯示誘導(dǎo)組與對照組能夠明顯區(qū)分開(方差變異來源累計97.133%)。

A. 全部測序樣本的PCA降維分析;B. 離體培養(yǎng)誘導(dǎo)組與對照組的PCA降維分析

2.2 香腺上皮細胞TP誘導(dǎo)模型差異代謝物分析

通過麝鼠香腺上皮細胞離體培養(yǎng)，在TP誘導(dǎo)組細胞培養(yǎng)液中能夠檢測出大量雄性激素類似物高表達，如睪酮、睪酮β-D-葡糖苷酸、甲羥孕酮、前列腺素等；同時誘導(dǎo)組出現(xiàn)甲氧麻黃酮、犬尿酸、N-乙酰-L-谷氨酸和黃曲霉素G1類分子的低表達。根據(jù)x軸的表達變化Fold Change系數(shù)與轉(zhuǎn)換P值，由圖2可以看出，與對照組相比，誘導(dǎo)組在neg、pos數(shù)據(jù)庫中分別有19、28個代謝分子合成上調(diào)，總共有4個代謝分子合成下調(diào)，各樣品組均未檢測到降麝香酮(環(huán)十五烷烯酮)存在。

A.neg數(shù)據(jù)庫注釋；B.pos數(shù)據(jù)庫注釋

通過合并neg和pos數(shù)據(jù)庫注釋的合成差異代謝分子，進一步篩選具有完全匹配峰的代謝分子33個，其中有31個代謝分子在誘導(dǎo)組樣品中呈現(xiàn)高表達，2個代謝分子呈現(xiàn)低表達；高表達代謝分子主要為長鏈脂肪酸、固醇、芳香族和甾酮類衍生物，如18碳和20碳長鏈飽和脂肪酸、羥基睪酮、雄烯二酮等，低表達分子為色氨酸分解產(chǎn)物犬尿酸和精氨酸中間體N-乙酰-L-谷氨酸(圖3)。

圖3 麝鼠香腺上皮細胞離體培養(yǎng)TP誘導(dǎo)組與對照組代謝物差異表達

2.3 香腺上皮細胞TP誘導(dǎo)模型差異代謝物的KEGG通路富集分析

對pos數(shù)據(jù)庫高度匹配的差異代謝組分進行KEGG通路富集分析(圖4)，TP誘導(dǎo)離體香腺上皮細胞后，差異代謝組分顯著富集在內(nèi)分泌阻抑(map01522)和類固醇激素生物合成(map00140)通路上，同時包含卵巢類固醇合成和部分癌相關(guān)代謝通路，其中內(nèi)分泌阻抑主要為睪酮和雄烯二酮介導(dǎo)的卵巢雌激素類物質(zhì)合成阻抑，類固醇激素的合成主要包括雄性激素的生物合成及前列腺素、皮質(zhì)醇等，其他代謝通路抽樣統(tǒng)計不顯著。其中色氨酸代謝途徑(map00380)涉及犬尿酸分子，2-氧代羧酸代謝(map01210)、精氨酸生物合成通路(map00220)和氨基酸生物合成通路(map01230)涉及N-乙酰-L-谷氨酸分子，花生四烯酸代謝(map00590)和5-羥色胺突出信號通路(map04726)涉及前列腺素分子，催乳素信號通路(map04917)涉及雄酮激素。

數(shù)字表示代謝物匹配的分子數(shù)目;顏色表示P值大小

2.4 麝鼠肝臟組織與香腺組織差異代謝物分析

代謝組學(xué)檢測繁殖期麝鼠肝臟和香腺組織代謝物含量情況，結(jié)果顯示，香腺組織相較于肝臟組織在neg、pos數(shù)據(jù)庫中分別有24、44個代謝分子合成上調(diào)，有109、145個代謝分子合成下調(diào)(圖5)；峰度完全匹配且在香腺組織中高表達的代謝物有肌苷、麥芽醇、乙酰-L-肉堿、L-蘇氨酸、DL-谷氨酰胺、10-羥基癸酸、4-硝基苯酚和水楊酸，碳鏈分子最多、最少分別有10、4個碳原子(表1)。

表1 高匹配度差異表達代謝物在香腺和肝臟組織中的相對含量

A.neg數(shù)據(jù)庫注釋；B.POS數(shù)據(jù)庫注釋

3 討 論

麝鼠香的主要成分為降麝香酮，屬于環(huán)十五烷烯酮，分子式為C15H26O，較麝香酮(3-甲基環(huán)十五烷烯酮，分子式為C16H28O)缺少1個甲基基團，它們具有相同的環(huán)狀碳鏈結(jié)構(gòu)，而環(huán)狀碳鏈結(jié)構(gòu)的形成是解析麝香生物合成的關(guān)鍵部分[4,9,17]。首先碳鏈的構(gòu)成需要碳源，主要涉及雙碳原子的逐步添加，如丙酮酸(可由氨基酸轉(zhuǎn)換的碳源)，同時涉及乙酰輔酶A、乙酰肉堿、脂肪酸合酶轉(zhuǎn)移亞基等分子參與。為確保樣品分類和測序的準(zhǔn)確性，將各樣品的代謝組學(xué)測序結(jié)果進行降維分析，結(jié)果顯示離體培養(yǎng)香腺上皮細胞、香腺和肝臟組織能夠明顯分開，提示測序結(jié)果有一定的準(zhǔn)確性和可信度。麝香及麝鼠香產(chǎn)物的代謝測序發(fā)現(xiàn)，其中含有大量的脂肪酸類、雄激素和前列腺素類衍生物等[1,11]，這些物質(zhì)與降麝香酮碳鏈的生成具有較大關(guān)聯(lián)性。使用丙酸睪酮(TP)誘導(dǎo)麝鼠香腺上皮細胞后，主要表現(xiàn)出氨基酸、脂肪酸、前列腺素和雄性激素的代謝變化，色氨酸在動物體內(nèi)涉及煙酸和5-羥色胺的形成，影響機體的代謝速度和神經(jīng)系統(tǒng)；犬尿酸是色氨酸分解代謝產(chǎn)物[18]，同時涉及神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，犬尿酸含量減少提示細胞中以犬尿酸途徑的色氨酸分解代謝減弱；N-乙酰-L-谷氨酸是谷氨酸到鳥氨酸和精氨酸合成的重要中間產(chǎn)物[19]，鳥氨酸可進入精氨酸合成循環(huán)系統(tǒng)，促進精氨酸的生物合成，谷氨酸在轉(zhuǎn)變?yōu)轼B氨酸的途徑中形成N-乙酰-L-谷氨酸，N-乙酰-L-谷氨酸含量減少提示TP誘導(dǎo)后細胞精氨酸或鳥氨酸的合成受限；色氨酸和精氨酸代謝的變化，提示了麝鼠降麝香酮生物合成的新途徑，可為解析降麝香酮的生物合成研究提供新的方向和參考，但需要通過對麝鼠注射通路激活劑或抑制劑等試驗來驗證，同時也提示色氨酸和精氨酸在降麝香酮合成過程中可能具有重要作用，如為脂肪酸鏈合成提供碳源。長鏈脂肪酸碳鏈長度多樣，TP誘導(dǎo)細胞后出現(xiàn)多種長鏈脂肪酸的累積，比如C18/20的長鏈脂肪酸累積，進一步證明了長鏈脂肪酸在降麝香酮生物合成過程中的重要作用，而花生四烯酸、雄酮、雄烯二酮、前列腺素合睪酮出現(xiàn)累積，這可能是誘導(dǎo)劑TP培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物或誘導(dǎo)細胞后生物自身代謝分泌的產(chǎn)物[9,20]；前列腺素和雄性激素有很大的可能是激素誘導(dǎo)正常動物性征信號通路，這些通路不排除是屬于麝香或麝鼠香生物合成的共有通路[21]，結(jié)果進一步提示色氨酸和精氨酸的代謝變化可能是為長鏈脂肪酸或性激素的合成提供碳源骨架。

結(jié)合KEGG通路富集分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)麝鼠香腺上皮細胞離體培養(yǎng)使用TP誘導(dǎo)后，其色氨酸和精氨酸的通路代謝發(fā)生顯著變化，同時長鏈脂肪酸的合成增多，提示了其在麝香酮或降麝香酮合成過程中的重要性，色氨酸、精氨酸和長鏈脂肪酸代謝通路可作為挖掘麝香和麝鼠香生物合成機制研究新方向，還需要進一步試驗探索。長鏈脂肪酸類代謝分子與麝香酮或降麝香酮的碳骨架相似，長鏈脂肪酸末尾的羧基和在內(nèi)部的烯鍵對其成環(huán)具有很大的潛能，而肝臟是有機物代謝較為旺盛的臟器[22-23]，通過香腺和肝臟組織之間的差異代謝物分析繁殖期麝鼠香腺和肝臟中脂肪酸代謝的差異，找出香腺的特征代謝產(chǎn)物及脂肪酸代謝差異分子，結(jié)果顯示香腺組織的肌苷含量顯著高于肝臟，且含有大量的乙酰肉堿，高含量的肌苷提示香腺組織有較快的代謝速率[24]，乙酰肉堿是運輸脂肪酸的載體[25]，說明繁殖期麝鼠香腺比肝臟具有更快的脂肪代謝速率，提示脂肪酸運載加強為降麝香酮的生物合成提供物質(zhì)基礎(chǔ)。相較于肝臟組織，香腺表現(xiàn)出明顯的蘇氨酸[26]、麥芽醇等代謝分子含量的升高，蘇氨酸和麥芽醇等具有作為降麝香酮生物合成過程中重要的前體物質(zhì)，為降麝香酮的生物合成研究提供參考數(shù)據(jù)。

4 結(jié) 論

在離體培養(yǎng)的麝鼠香腺細胞中，睪酮誘導(dǎo)能夠影響色氨酸、精氨酸和長鏈脂肪酸代謝通路，揭示其在降麝香酮合成過程中的重要性，因此色氨酸、精氨酸和長鏈脂肪酸代謝通路可作為挖掘麝香和麝鼠香生物合成機制的研究新方向。繁殖期麝鼠香腺組織比肝臟含有更多的肌苷、乙酰肉堿、蘇氨酸等代謝物，本研究結(jié)果為降麝香酮的生物合成機制研究提供參考數(shù)據(jù)。