任燕珍, 李蕊仙, 陳建娥, 杜志超, 婁玉華

(內(nèi)蒙古錫林郭勒盟中心醫(yī)院, 1. 腫瘤科, 2. 藥劑科, 3. 預(yù)防保健科, 內(nèi)蒙古 錫林浩特, 026000)

近年來，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐年增長趨勢，患者患病早期無法及時就診是致死的主要原因[1-3]。線粒體解偶聯(lián)蛋白之一的解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)是一種線粒體內(nèi)膜蛋白，可以發(fā)揮介導(dǎo)離子滲透、影響ATP合成、參與體內(nèi)脂代謝、調(diào)控細胞內(nèi)活性氧(ROS)等多重作用。研究[4-5]已證實, UCP2可在多種腫瘤中均呈異常表達，其主要通過減少細胞凋亡、促進增殖等方式參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程。UCP2在結(jié)直腸癌中的表達與其臨床病理特征和預(yù)后結(jié)局的關(guān)系尚不明確，相關(guān)研究較少。本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)直腸癌及癌旁正常組織UCP2表達水平，探討UCP2表達與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系以及預(yù)后的影響因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標準: ① 符合臨床結(jié)直腸癌的診斷標準者; ② 術(shù)后標本均通過病理診斷確診為結(jié)直腸癌[6]者; ③ 術(shù)前采用放化療治療者; ④ 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑等臨床資料完整。排除標準: ① 有腦血管、心血管病、糖尿病以及肝、腎功能衰退等原發(fā)性疾病臨床癥狀者; ② 患有老年癡呆癥或者精神異常導(dǎo)致臨床信息收集數(shù)據(jù)可信度不高者; ③ 有腫瘤癥狀的患者; ④ 有長期飲酒、吸煙等不良生活習(xí)慣并誘發(fā)肝臟功能衰竭者。根據(jù)隨機抽樣法以及納入、排除標準，選取 2018年1月—2021年1月采用根治性切除術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者160例為研究對象。以世界衛(wèi)生組織有關(guān)結(jié)直腸癌疾病診斷標準對患者進行診斷，參與實驗的患者對本研究知情，研究經(jīng)倫理委員會批準。結(jié)直腸癌患者中，男114例，女46例，年齡23～85歲，平均(60.33±4.55)歲。按腫瘤分化程度將其分為低分化患者50例和高分化患者110例。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國癌癥聯(lián)合會(AJCC) 制定的TNM分期系統(tǒng)(2017年第8版), 160例患者中, Ⅰ期患者14例, Ⅱ期患者46例, Ⅲ期患者100例。84例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)果呈陰性, 76例結(jié)果呈陽性，患者體力未出現(xiàn)明顯下降，生活可自理。剔除標準: ① 研究期間因工作調(diào)動等個人原因到其他省市生活、工作者; ② 自身出現(xiàn)嚴重疾病需轉(zhuǎn)入其他科室進行進一步治療者; ③ 不愿配合研究的患者。出現(xiàn)以上任意1種情況均納入病例剔除范圍，刪除病例的相關(guān)資料，不再補充其他病例。直至研究數(shù)據(jù)收集完成，本研究未出現(xiàn)病例剔除情況。

1.2 方法

取所有研究對象手術(shù)切除的部分結(jié)直腸癌組織及其癌組織5 cm以外的癌旁正常組織送至相關(guān)科室檢驗。所有患者結(jié)直腸癌組織以及癌旁正常組織的標本均采用濃度為10%的福爾馬林溶液進行固定，之后通過石蠟包埋以及制片等措施處理為厚度為4 μm的切片，分別進行蘇木精-伊紅染色(HE)染色以及免疫組織化學(xué)染色。從患者組織標本切片中選取4片進行染色, 1片用于HE染色, 3片用于免疫組織化學(xué)染色，并加入特異性單克隆抗體抗UCP2抗體。

1.2.1 HE染色: 將制成的切片利用二甲苯進行常規(guī)脫蠟，持續(xù)處理10 min, 并重復(fù)1次操作，之后按照100%、100%、95%、90%、85%的濃度分別進行酒精水化，每個濃度持續(xù)1 min, 之后利用自來水進行反復(fù)沖洗。應(yīng)用蘇木精染液對細胞核進行染色，持續(xù)15 min, 之后用自來水沖洗1 min。加入濃度為1%的鹽酸酒精溶液進行細胞分化，持續(xù)反應(yīng)20 s后置于自來水下沖洗1 min; 應(yīng)用濃度為1%的稀氨水進行反藍處理，持續(xù)30 s后置于自來水下沖洗1 min; 使用0.5%的伊紅水溶液對胞質(zhì)進行染色，持續(xù)3 min后脫水處理，按照85%、90%、95%、100%的濃度依序脫水，脫水時間分別為20 s、30 s、1 min、2 min, 每個濃度重復(fù)2次操作。使用二甲苯進行透明處理，持續(xù)2 min, 該操作重復(fù)3次后應(yīng)用中性樹膠進行封片，置于顯微鏡下觀察。

1.2.2 免疫組織化學(xué)實驗: 將制成的石蠟切片利用二甲苯進行常規(guī)脫蠟，持續(xù)處理10 min, 并重復(fù)操作1次，之后按照100%、100%、90%、80%、70%的濃度梯度進行酒精水化，每個濃度持續(xù)2 min; 采用雙蒸水反復(fù)沖洗后使用免疫組化筆在切片上劃取染色范圍; 將濃度為3%的雙氧水加至切片上，并在恒溫環(huán)境中靜置10 min, 以達到抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性的目的，并使用PBS溶液反復(fù)沖洗3次以上，每次持續(xù)2 min; 在pH值為6.0的枸櫞酸鹽緩沖液中放置切片, 95～98 ℃溫度下微波爐加熱，持續(xù)10 min后完成抗原修復(fù)，并在恒溫環(huán)境中冷卻20 min。加入正常山羊血清進行封閉處理，在恒溫環(huán)境中靜置15 min后丟棄山羊血清，注意不可沖洗，之后加入一抗，在37 ℃溫度下進行孵育，持續(xù)15 min后利用PBS溶液反復(fù)沖洗3次以上，每次持續(xù)5 min; 加入辣根酶標記鏈霉卵白素，在37 ℃條件下進行孵育，持續(xù)15 min后利用PBS溶液反復(fù)沖洗3次以上，每次持續(xù)5 min; 各取1滴試劑盒中的A、B、C試劑，加入1 mL雙蒸水，配置成底物染液DAB, 在切片上加上DAB, 直至出現(xiàn)棕色沉淀，使用雙蒸水進行沖洗; 再次用蘇木精溶液進行染色，自來水沖洗后進行脫水，按照70%、80%、90%、100%、100%的濃度梯度依序脫水，各濃度的脫水時間均為2 min, 每個濃度重復(fù)操作2次，之后使用二甲苯進行透明處理，持續(xù)1 min, 該操作重復(fù)2次后應(yīng)用中性樹膠進行封片，置于顯微鏡下觀察。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果判定: 染色結(jié)果統(tǒng)一由2名具備多年免疫組化實驗經(jīng)驗的臨床醫(yī)師進行評估判斷，評判前不得向臨床醫(yī)師透露任何關(guān)于患者的病歷資料, UCP2蛋白以細胞質(zhì)作為主要分布區(qū)域，性狀為棕黃色顆粒。臨床醫(yī)師根據(jù)統(tǒng)一的判定標準對染色結(jié)果進行評判，評判過程需重復(fù)3次以上。隨機從高倍鏡下選取10個視野，分別計數(shù)100個，應(yīng)用精準度較高的半定量法完成該步驟，之后對染色結(jié)果中的陽性強度以及陽性細胞占比情況進行評分，具體評分標準如下。以背景色為參照評判陽性細胞的染色強度，無色記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分; 以陽性細胞占比情況進行評估，若結(jié)果為陰性則記0分，若陽性細胞占比為25%以下記1分，若陽性細胞占比為25%～50%記2分，若陽性細胞占比>50%～75%記3分，若陽性細胞占比超過75%記4分。將陽性細胞占比分值與染色強度分值相加，若總分值為≤1分則為陰性，用(-)表示; 若分值為2～3分同樣記為陰性，用(±)表示，若分值為4～5分記為弱陽性，用(+)表示; 若分值6～7分記為強陽性，用()表示[7]。≤1分和2～3分均記為陰性, 4～7分均記為陽性。

1.2.4 隨訪方法: 對所有患者進行為期1年的隨訪，記錄患者基因突變情況、化療情況以及體力情況。

1.3 觀察指標

① 比較UCP2在結(jié)直腸癌及癌旁正常組織中的表達水平; ② 采用單因素分析探討UCP2在結(jié)直腸癌組織中的表達水平與患者年齡、性別、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等臨床病理特征的關(guān)系; ③ 比較UCP2不同表達的結(jié)直腸癌患者的總生存率和無病生存率的差異; ④ 采用單因素分析探討UCP2蛋白的表達與患者預(yù)后的關(guān)系; ⑤ 采用多因素Logistic回歸分析模型分析結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響因素。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。繪制Kaplan-Meier生存曲線分析患者1年累積生存率; 采用多因素Logistic回歸分析模型對總體1年生存率及預(yù)后危險因素進行評估分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 UCP2在結(jié)直腸癌及癌旁正常組織中的表達

細胞質(zhì)是UCP2蛋白表達的主要區(qū)域(圖1), 免疫組化染色顯示深淺不一，主要呈棕黃色或黃色顆粒，強陽性的細胞質(zhì)中出現(xiàn)多處棕黃色顆粒，陰性細胞質(zhì)中的棕黃色及黃色顆粒較少。UCP2在結(jié)直腸癌組織中的表達水平高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=158.505,P<0.01)。UCP2在癌旁正常組織中表達均為陰性, UCP2在結(jié)直腸癌組織中表達呈陽性106例(66.25%), 陰性54例(33.75%)。

A: UCP2在癌旁正常組織中陰性表達; B: UCP2在結(jié)直腸癌組織中陽性表達; C: UCP2在結(jié)直腸癌組織中陰性表達。圖1 HE染色檢測結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中UCP2的表達情況(放大倍數(shù)400倍)

2.2 UCP2在結(jié)直腸癌組織中表達水平對臨床病理特征的影響

不同年齡、性別、腫瘤直徑患者UCP2陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。低分化結(jié)直腸癌組織中UCP2蛋白表達水平高于高分化結(jié)直腸癌組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01); TNM分期為Ⅲ期的患者癌組織中的UCP2陽性表達水平高于Ⅰ期和Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01); 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織中UCP2的陽性表達率高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 見表1。

表1 UCP2蛋白的表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 UCP2蛋白表達與患者預(yù)后的關(guān)系

UCP2陽性表達的結(jié)直腸癌患者的1年總生存率、1年無病生存率低于UCP2陰性表達的結(jié)直腸癌患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.12,P=0.03;χ2=9.55,P=0.03), 見圖2、圖3。

圖2 不同UCP2表達的結(jié)直腸癌患者的1年總生存率生存曲線

圖3 不同UCP2表達的結(jié)直腸癌患者的1年無病生存率生存曲線

2.4 UCP2蛋白表達與患者預(yù)后關(guān)系的單因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，不同腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移、UCP2表達的結(jié)直腸癌患者1年生存率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.13,P=0.01;χ2=40.80,P<0.01;χ2=7.01,P=0.01;χ2=8.12,P<0.01), 見表2。

表2 影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的單因素分析

2.5 UCP2蛋白表達與患者預(yù)后關(guān)系的多因素分析

將單因素分析中P<0.05的變量作為自變量代入結(jié)直腸癌患者預(yù)后結(jié)局的多因素回歸分析模型中，腫瘤分化(0=高分化, 1=低分化)、TNM分期(0=Ⅰ期、Ⅱ期, 1=Ⅲ期)、UCP2表達(0=陰性, 1=陽性)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(0=未轉(zhuǎn)移, 1=轉(zhuǎn)移)。預(yù)后1年生存率結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者預(yù)后結(jié)局的獨立危險因素包括腫瘤分化(低分化)、TNM分期(Ⅲ期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、UCP2陽性表達, 見表4。

表4 結(jié)直腸癌患者預(yù)后臨床因素的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

UCP2是一種陰離子轉(zhuǎn)運體蛋白，分布于線粒體內(nèi)膜，可以誘發(fā)質(zhì)子滲漏并對膜兩側(cè)的電化學(xué)梯度造成破壞，進而降低線粒體膜電位，氧化磷酸化過程解偶聯(lián)，抑制三磷酸腺苷的合成, UCP2在體內(nèi)多種器官中廣泛分布，其主要參與細胞生理進程[8]。多項研究[9-10]結(jié)果顯示，頭頸部、胰腺、前列腺與結(jié)直腸腫瘤中UCP2表達水平較高，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示, UCP2在結(jié)直腸癌組織、癌旁正常組織中陽性表達率存在顯著差異，其作用機制如下。線粒體以氧化磷酸化方式產(chǎn)生能量，線粒體內(nèi)膜上的ATP合酶是氧化磷酸化的關(guān)鍵，而UCP2作為一種陰離子轉(zhuǎn)運體，可以跨線粒體內(nèi)膜，無需通過ATP合酶途徑回流，可以形成調(diào)控解偶聯(lián)ATP生成與氧化磷酸化過程的質(zhì)子漏，過程中釋放的能量以熱量形式散失，并未用于ATP合成過程，線粒體內(nèi)膜電勢下降、還原狀態(tài)的中間產(chǎn)物時間縮短以及超氧陰離子生成率下降等現(xiàn)象均與UCP2介導(dǎo)質(zhì)子引發(fā)滲漏有關(guān)聯(lián)，進一步導(dǎo)致ROS生成率受調(diào)控呈負性增長，氧化應(yīng)激反應(yīng)減弱，增強腫瘤細胞缺氧、化療藥物耐受性，以此達到保護腫瘤細胞的目的，下調(diào)UCP2的表達可以抑制腫瘤的形成，提示UCP2在腫瘤的形成初級階段可能扮演著極為重要的角色[11]。

本研究結(jié)果顯示，低分化、TNM期為Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中UCP2的蛋白表達水平更高，原因可能是UCP2參與腫瘤細胞的能量代謝，UCP2上調(diào)抑制線粒體氧化磷酸化過程，增強Warburg效應(yīng)與促進糖酵解反應(yīng)能量的產(chǎn)生，進而促進了腫瘤細胞的增殖和遷移，造成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期增加以及分化程度降低等，進一步證實UCP2陽性表達可以發(fā)揮促進腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，同時也說明UCP2蛋白表達在腫瘤發(fā)展進程中具有顯著作用[12-13]。

李秋妍等[14]在對乳腺癌進行臨床研究時同樣發(fā)現(xiàn)，UCP2的高表達與預(yù)后效果不理想有關(guān)。蔣滟蘄等[15]研究顯示, UCP2 rs659366位點基因多態(tài)性可能是影響結(jié)直腸癌術(shù)后患者生存結(jié)局的因素，腫瘤部位(結(jié)腸、直腸)、TNM分期等與患者的生存結(jié)局相關(guān)，其機制可能是原發(fā)腫瘤浸潤深度增加會使根治難度相應(yīng)增大，而UCP2 rs659366位點A等位基因可以通過結(jié)合配對盒基因6(Pax6)增強啟動子活性，促使UCP2轉(zhuǎn)錄過程加快，提高UCP2蛋白的表達水平, UCP2蛋白過表達會抑制結(jié)直腸癌組織產(chǎn)生ROS, 對部分通過ROS途徑起效的藥物的抗癌療效造成影響，最終增大結(jié)直腸癌患者發(fā)生不良預(yù)后的風(fēng)險。本研究還發(fā)現(xiàn), UCP2陽性表達的結(jié)直腸癌患者的1年總生存率和1年無病生存率較低，不同腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移、UCP2表達的結(jié)直腸癌患者的1年生存率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 多因素回歸分析證明，腫瘤分化(低分化)、TNM分期(Ⅲ期)、UCP2陽性表達、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的危險因素，分析原因可能是腫瘤容易侵及鄰近組織并引發(fā)遠處轉(zhuǎn)移，腫瘤組織細胞間的黏附性減弱以及細胞運動、侵襲性能力增強會造成細胞的無限繁殖，增加氧氣能量的消耗形成腫瘤組織低氧環(huán)境，增大腫瘤細胞轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)以及病情惡化風(fēng)險，導(dǎo)致組織低分化、TNM分期增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、UCP2高表達，進而增加死亡等預(yù)后不良風(fēng)險。結(jié)合以上結(jié)果與UCP2的機制分析, UCP2有可能會作為媒介使腫瘤組織對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，因此腫瘤細胞UCP2高表達會降低患者對順鉑的敏感度，產(chǎn)生耐藥性，進而降低化療效果，不利于患者病情的控制，促進腫瘤患者病情快速進展，繼而發(fā)生腫瘤組織低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期增加等，對患者預(yù)后不利，以上均證明UCP2陽性表達可能是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不理想的危險因素, UCP2今后能夠作為預(yù)測結(jié)直腸癌患者生存預(yù)后的重要標識。

綜上所述, UCP2在結(jié)直腸癌患者癌癥組織中呈高表達，與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等存在密切關(guān)系, UCP2的高表達同時證明結(jié)直腸癌患者的預(yù)后效果不佳，可將研發(fā)UCP2的有效抑制劑作為治療結(jié)直腸癌的新方向。