施佳皓，路正楠，盛 揚(yáng)，孫一新，Mark Bradley, 張 嶸

(1. 常州大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院， 江蘇 常州 213100;2. School of Chemistry, University of Edinburgh，Edinburgh EH9 3JJ, UK)

0 引 言

細(xì)菌感染一直是困擾人類(lèi)的難題，特別是近年來(lái)，由于抗生素的濫用，多重耐藥菌的數(shù)量正在以顯著的速度增加，使這個(gè)問(wèn)題變得更加困難。這些多重耐藥細(xì)菌增加了相關(guān)疾病的發(fā)病率和死亡率。因此需要開(kāi)發(fā)更有效的方法來(lái)對(duì)抗多重耐藥細(xì)菌[1]。光動(dòng)力療法是一種新興的癌癥治療方法[2]。光動(dòng)力療法的機(jī)理是利用光敏劑通過(guò)光照射將周?chē)难醴肿蛹ぐl(fā)為單線態(tài)氧(1O2)等高能物質(zhì)。1O2極高的細(xì)胞毒性對(duì)癌細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療癌癥的效果[3]。同樣的方法也可以用于解決多重耐藥菌的問(wèn)題，與抗生素相比，產(chǎn)生耐藥菌株的風(fēng)險(xiǎn)更小。近年來(lái)，利用各種光敏劑及相關(guān)材料進(jìn)行抗菌光動(dòng)力治療的研究越來(lái)越多，包括共軛化合物[4]、金屬化合物[5]和復(fù)合納米材料[6-7]。例如，由仿生多異氰化物 (PIC) 水凝膠和嵌入共軛低聚電解質(zhì) (COE)組成的雙組分水凝膠的光動(dòng)力抗菌膜[8]，由于 COE 的引入，水凝膠表現(xiàn)出更高的1O2生成率和更高的殺菌效率。Wen[9]制備了一種硫化鉍銀量子點(diǎn)，它可以在近紅外光下通過(guò)光動(dòng)力和光熱活動(dòng)滅活細(xì)菌。

光敏劑是光動(dòng)力療法的重要組成部分，其生物毒性是臨床應(yīng)用的重要考慮因素。作為血紅素和葉綠素的前體，原卟啉 (PPIX)是一種天然高效的光敏劑，具有良好的生物相容性和理想的熒光量子產(chǎn)率。因此，PPIX被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[10-11]。例如，化合物5-氨基酮戊酸(5-ALA)已在臨床上廣泛用于皮膚病的光動(dòng)力治療[12]。作為在細(xì)胞中形成 PPIX 的起始化合物，注射的 5-ALA 會(huì)與體內(nèi)的物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生額外的 PPIX，其在暴露于光時(shí)會(huì)產(chǎn)生1O2導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，董[13]制備了以PPIX為共價(jià)鍵核的PEG-co-PCL共聚物水凝膠，實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)熒光成像。

但PPIX具有超疏水的表面結(jié)構(gòu)，帶有兩個(gè)可電離的羧酸基團(tuán)，使其不溶于水，在水溶液中易形成面對(duì)面的聚集體。卟啉環(huán)之間 π-π 相互作用的排列使得聚集的 PPIX 的結(jié)構(gòu)高度穩(wěn)定[14-15]。然而，PPIX的這種π-π積累導(dǎo)致熒光猝滅，大大降低了熒光強(qiáng)度，限制了其應(yīng)用。使用水溶性或水分散性載體攜帶PPIX進(jìn)行體內(nèi)釋放是阻止PPIX分子間相互作用的方法之一。楊[16]以碳量子點(diǎn)為載體結(jié)合PPIX，研究其人體內(nèi)的光動(dòng)力活動(dòng)。用納米顆粒封裝 PPIX 也是一種常用方法[17]。但是，這些方法需要考慮PPIX加載和釋放效率等問(wèn)題。PPIX通過(guò)水溶性基團(tuán)改性以提高其水溶性也是一種有效的方法。已研究合成的水溶性PPIX化合物[18-19]仍保持了PPIX優(yōu)異的熒光特性，在光動(dòng)力治療和熒光成像研究中發(fā)揮了良好的效果。因此，水溶性PPIX衍生物的合成將對(duì)PPIX的臨床應(yīng)用具有重要意義。

卟啉聚合物[20-21]具有較高的共軛度、高比表面積、高孔隙率等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于儲(chǔ)能材料。受此啟發(fā)，我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了一種PPIX聚合物，該聚合物能有效提高親水性并減弱π-π堆積效應(yīng)以阻止團(tuán)聚。本文通過(guò)PPIX與PEG酯化反應(yīng)生成親水性預(yù)聚物二醇，再與二異氰酸酯聚合得到聚氨酯，合成水溶性PPIX聚合物。由于PU等聚合物鏈段阻礙了PPIX單元的π-π積累，提高了PPIX聚氨酯的光動(dòng)力活性。研究了對(duì)細(xì)菌和癌細(xì)胞的1O2生成速率和光動(dòng)力滅活效果。結(jié)果表明水溶性PPIX-PEG多元醇及其PPIX-PEG-PU具有臨床應(yīng)用的可能性。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

原卟啉IX (PPIX)、2-肟氰乙酸乙酯、N,N-二異丙基碳二亞胺(DIC)、六亞甲基二異氰酸酯(HDI)、10-蒽基-雙(亞甲基)二丙二酸(ADMA)，阿拉丁公司；聚乙二醇400，N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，胰蛋白胨、瓊脂，滬試公司。實(shí)驗(yàn)菌種：大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，魯威科技公司。脂肪干細(xì)胞 (hASCs)，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，肝癌細(xì)胞(HepG2)由常州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與健康科學(xué)研究所提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

生化培養(yǎng)箱(SPX-250B型)，天津泰斯特儀器有限公司；激光燈(635 nm，0.5 W/cm2)，珠海邁致激光公司；酶標(biāo)儀(Epcoch)，美國(guó)Bio Tek公司。

1.2 合成PPIX-PEG預(yù)聚物

稱(chēng)取200 mg PEG400加入單頸圓底燒瓶中，在油浴中加熱至110 ℃，抽真空2 h以除去水分后備用。稱(chēng)取PPIX 40 mg放入玻璃小瓶(10 mL)，然后加入2-肟氰基乙酸乙酯21 mg、N,N-二異丙基碳二亞胺(DIC)18 mg和3 mL干燥的 N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)，將玻璃小瓶置于恒溫振蕩器中振蕩1 h(250 r/min，37 ℃)。然后將PPIX溶液加入干燥的PEG中并在40 ℃下攪拌24 h。反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物滴加到過(guò)量的正己烷中，沉淀離心(8 000 r/min，5 min)后得到粗產(chǎn)物(PPIX-PEG)。在去離子水中透析2天(每2 h換水一次)以除去未反應(yīng)的化合物。透析袋的截留分子量分別為1 000 Da。透析后的產(chǎn)物冷凍干燥，儲(chǔ)存在2～8 ℃的冰箱中備用。

1.3 原卟啉聚氨酯(PPIX-PEG-PU)的合成

稱(chēng)取PPIX-PEG(50 mg)并加入50 mL三頸圓底燒瓶中，在真空油浴中加熱至110 ℃×2 h以除去水分。冷卻至70 ℃后，分別加入六亞甲基二異氰酸酯(10 mg)、催化劑辛酸亞錫(0.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)))和3 mL干燥的DMF。將混合物在N2氣氛中磁力攪拌6 h，然后加入 100 μL三亞乙基四胺的DMF溶液并繼續(xù)反應(yīng)6 h。反應(yīng)混合物中的大部分DMF在100 ℃下通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去。然后將濃縮的產(chǎn)物滴加到過(guò)量的正己烷中沉淀，然后離心(8 000 r/min，5 min)。沉淀產(chǎn)物在截留分子量為8 000～12 000 Da的透析袋中以與上述相同的方式通過(guò)透析純化。將透析產(chǎn)物冷凍干燥并在室溫下避光儲(chǔ)存。

1.4 合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與性能表征

1.4.1 紅外分析(FTIR)

美國(guó)Nicolet公司的傅立葉變換紅外光譜儀(Nicolet Avatar 370)用于表征PPIX-PEG與PPIX-PEG-PU的官能團(tuán)，掃描范圍400～4 000 cm-1， 分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)256。

1.4.2 共振氫譜表征(1H-NMR)

德國(guó)Bruker公司的核磁共振儀(AVANCEⅢ-400)，對(duì)PPIX-PEG與PPIX-PEG-PU的化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，以氘代氯仿為溶劑。

1.4.3 凝膠滲透色譜分析(GPC)

美國(guó)Water公司的WATERS 515型凝膠滲透色譜測(cè)試PPIX-PEG以及PPIX-PEG-PU的分子量和分子量分布，標(biāo)準(zhǔn)聚苯乙烯作為參照物，THF為流動(dòng)相溶劑，淋洗速率為1 mL/min。

1.4.4 紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(UV-vis)分析

日本島津公司的UV-1800型分光光度計(jì)用于測(cè)試。PPIX、PPIX-PEG與PPIX-PEG-PU的水溶液的測(cè)試濃度為0.18 mmol/L

1.4.5 單線態(tài)氧的測(cè)定

ADMA用作檢測(cè)1O2生成的指示劑。2 mL PPIX-PEG與PPIX-PEG-PU溶液(0.18 mmol/L)與 1 mL ADMA 溶液 (0.5 mmol/L) 混合，用紅色激光(635 nm，0.5 W/cm2)照射不同時(shí)間(0～20 min)，測(cè)定260 nm左右ADMA的吸收值。

1.4.6 光動(dòng)力抑菌分析

采用瓊脂平板法評(píng)估PPIX-PEG與PPIX-PEG-PU的光動(dòng)力抑菌效果，實(shí)驗(yàn)菌種為革蘭氏陰性菌E.coli、革蘭氏陽(yáng)性菌S.aureus和多重耐藥菌MRSA。取100 μL/孔的菌液(1×105CFU/mL)加至96孔板中，然后加入100 μL/孔不同濃度的PPIX-PEG400 與PPIX-PEG-PU水溶液，空白對(duì)照組中加入PBS溶液，共培養(yǎng)2 h后，用波長(zhǎng)405 nm，功率為0.5 W/cm2的激光照射5 min，然后取50 μL混合菌液涂布于瓊脂培養(yǎng)基表面，在37 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，由培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的細(xì)菌群落數(shù)計(jì)算得到抑菌率，每個(gè)實(shí)驗(yàn)3個(gè)重復(fù)樣。

1.4.7 生物相容性

CCK-8法分析PPIX-PEG與PPIX-PEG-PU對(duì)脂肪干細(xì)胞 (hASC)和肝癌細(xì)胞(HepG2)的細(xì)胞毒性，所有實(shí)驗(yàn)均在黑暗條件下進(jìn)行。取100 μL/孔 的細(xì)胞溶液(1×105cells/mL)接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，每孔加入含有原卟啉衍生物的培養(yǎng)基溶液100 μL(培養(yǎng)基是補(bǔ)加了10%胎牛血清，5%青霉素-鏈霉素的DMEM)，于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后吸出培養(yǎng)基，用PBS溶液洗滌1次，每孔加入100 μL CCK-8溶液(n(VCCK-8)∶n(VL-DMEM)=1∶9)，置于37 ℃含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。孵育結(jié)束后，使用Epcoch酶標(biāo)儀測(cè)量樣品的吸光度(波長(zhǎng)為450和620 nm)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)5個(gè)重復(fù)樣。

1.4.8 細(xì)胞對(duì)PPIX衍生物的吸收

通過(guò)UV/Vis光譜測(cè)量細(xì)胞對(duì)PPIX衍生物的定量攝取。因此，PPIX衍生物的PBS溶液(1 mg/mL)與HepG2細(xì)胞(1×105個(gè)細(xì)胞/mL)在37 ℃、5% CO2下共培養(yǎng)不同時(shí)間。除去并收集培養(yǎng)基。將細(xì)胞用 PBS 洗滌至少 3 次，并將收集的 PBS 和培養(yǎng)基合并用于 UV/Vis 分析以確定留在混合物中的 PPIX 衍生物的量。

共聚焦激光顯微鏡用于觀察細(xì)胞中的 PPIX 衍生物。將細(xì)胞(1×105個(gè)細(xì)胞/mL)接種到共聚焦培養(yǎng)皿上，并在37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。添加含PPIX 衍生物的 PBS (1 mg/mL)溶液于孔中的，并在37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育30 min。然后除去PPIX衍生物溶液并用PBS洗滌細(xì)胞3次。每孔加入800 μL Calcein-AM (10 μg/mL) 并在37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育 30 min以進(jìn)行活細(xì)胞染色。然后去除上清液并將細(xì)胞洗滌3次。每孔加入800 μL DAPI溶液(10 μg/mL)，室溫避光孵育 10 min。孵育后，去除上清液，用PBS洗滌細(xì)胞(3次)，然后加入4%多聚甲醛溶液在室溫下固定細(xì)胞。固定的細(xì)胞用PBS洗滌3次，然后用激光共聚焦顯微鏡成像。

1.4.9 光動(dòng)力治療后細(xì)胞的活力

將每孔100 μL HepG2細(xì)胞(1×105個(gè)細(xì)胞/mL)加入96 孔板中，在37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后以各種濃度添加每孔100 μL PPIX-PEG 或聚氨酯的 PBS溶液。將細(xì)胞在37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育 20 min。用正常補(bǔ)充的 DMEM 刷新后，將細(xì)胞暴露于激光(405 nm，0.5 W/cm2或635 nm，0.5 W/cm2)下 5 min。然后每孔加入 100 μL CCK-8溶液，將細(xì)胞在37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育3 h。Epcoch酶標(biāo)儀用于測(cè)量每個(gè)樣品的吸光度，波長(zhǎng)為 450和620 nm (n=5)。

1.4.10 細(xì)胞染色

用5 mL PBS稀釋5 μL Calcein-AM溶液和15 μL碘化丙啶溶液，用于活細(xì)胞和死細(xì)胞染色。將每孔100 μL HepG2 細(xì)胞(1×105細(xì)胞/mL)接種到96孔板上，并在37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。每孔加入100 μL PPIX衍生物溶液，培養(yǎng)20 min。除去培養(yǎng)基后，細(xì)胞用 PBS 洗滌 3 次，然后用補(bǔ)充的 DMEM 更新。本實(shí)驗(yàn)分為幾組，包括在正常補(bǔ)充 DMEM 中培養(yǎng)細(xì)胞的孔、在黑暗中用含有 PPIX 的補(bǔ)充 DMEM 培養(yǎng)的細(xì)胞、在黑暗中用 PPIX 衍生物培養(yǎng)的細(xì)胞、用含有 PPIX衍生物的補(bǔ)充DMEM培養(yǎng)然后暴露于405和635 nm 激光分別照射5 min。激光照射后去除培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞3次，然后向每個(gè)孔中加入100 μL染料溶液，并在37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育30 min。在室溫下將細(xì)胞固定在100 μL多聚甲醛溶液(4%)中20 min，然后用PBS洗滌3次，然后進(jìn)行熒光成像。

1.4.11 掃描電鏡

采用掃描電鏡觀察細(xì)菌與細(xì)胞形態(tài)，評(píng)價(jià)光動(dòng)力殺菌效果。200 μL耐甲氧西林金黃色葡萄球菌溶液(1×109CFU/mL)，分別與200 μL PPIX、PEG-PPIX-PEG400、聚氨酯溶液混合，置于暗處或用405 nm激光和635 nm激光照射5 min。離心收集處理過(guò)的細(xì)菌，用PBS洗滌3次，用戊二醛(2.5%)固定(4 h，5 ℃)過(guò)夜。固定菌分別用30%、50%、70%、80%、90%乙醇脫水，100%乙醇脫水兩次，60 ℃烘箱干燥，得到菌粉。將細(xì)菌粉末固定在導(dǎo)電膠上，噴金后用SEM觀察其形貌。同樣的方法制備肝癌細(xì)胞的樣品用于掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 水溶性原卟啉聚合物的表征

圖1為合成水溶性原卟啉聚合物的反應(yīng)示意圖。首先將原卟啉(PPIX)兩端的羧基引入聚乙二醇(PEG)形成共聚物二醇(PPIX-PEG)，再通過(guò)與六亞甲基二異氰酸酯(HDI)聚合形成聚氨酯，PEG鏈段的引入改善PPIX的水溶性，聚氨酯鏈段可以有效阻止PPIX之間發(fā)生π-π堆積作用，通過(guò)紅外光譜、核磁共振氫譜、GPC和紫外可見(jiàn)光譜對(duì)聚合物進(jìn)行表征。由圖2的紅外譜圖可知，曲線(a)PPIX-PEG在1 722和1 103 cm-1處出現(xiàn)的2個(gè)吸收峰，主要?dú)w因于酯鍵CO和醚鍵C—O—C的振動(dòng)伸縮峰，相較于PPIX(c)明顯出現(xiàn)了來(lái)自于聚乙二醇中的C—O—C的醚鍵。曲線(b)PPIX-PEG-PU在1 731和1 106 cm-1處出現(xiàn)的2個(gè)吸收峰，同樣歸因于酯鍵CO和醚鍵C—O—C的振動(dòng)伸縮峰，相較于曲線(a)PPIX-PEG，PPIX-PEG-PU明顯出現(xiàn)了3 434 cm-1處的吸收峰，主要?dú)w因于二異氰酸酯中的N-H的振動(dòng)收縮峰。通過(guò)以上結(jié)果表明成功合成了PPIX-PEG及其PPIX-PEG-PU聚合物。

圖1 水溶性原卟啉聚合物的合成示意圖Fig.1 The synthesis ofthe water-soluble PPIX polymers

圖2 (a) PPIX-PEG, (b) PPIX-PEG-PU和(c) PPIX的紅外譜圖Fig.2 FT-IR spectra of (a) PPIX-PEG, (b) PPIX-PEG-PU and (c) PPIX

核磁共振氫譜用來(lái)表征 PPIX-PEG 以及PPIX-PEG-PU的結(jié)構(gòu)(圖3)。對(duì)于PPIX-PEG，σ3.6 處的化學(xué)位移來(lái)自于 PEG 鏈段的—CH2CH2—上的質(zhì)子吸收峰。此外，還有其他來(lái)自PPIX結(jié)構(gòu)的吸收峰，包括σ4.3(卟啉環(huán)旁邊的丙酸酯基團(tuán)上的—CH2—)、σ6.3和σ8.1(—CH=CH2，PPIX上的側(cè)基團(tuán))、σ10. 5(卟啉環(huán)上的—CH=C<)。對(duì)于PPIX-PEG-PU，σ1.6處的化學(xué)位移來(lái)自于HDI鏈段—NHCH2CH2—上的質(zhì)子吸收峰，σ1.3 來(lái)自于 HDI 亞甲基 (—NHCH2CH2CH2—) 的質(zhì)子吸收峰。其他質(zhì)子吸收峰可以歸于聚氨酯的PPIX-PEG鏈段上的質(zhì)子(圖3(b))，其化學(xué)位移與圖3(a)觀測(cè)到的核磁共振氫譜相似。通過(guò)表1的分子量及其分布也說(shuō)明成功合成了原卟啉聚氨酯聚合物。

圖3 (a) PPIX-PEG和(b)PPIX-PEG-PU的核磁共振氫譜圖Fig.3 1H-NMR spectra of (a)PPIX-PEG and (b)PPIX-PEG-PU

表1 PPIX-PEG和PPIX-PEG-PU的分子量及其分布

PPIX、PPIX-PEG和PPIX-PEG-PU的水溶液的紫外光譜如圖4所示。圖中600 nm附近的峰是 PPIX 的特征吸收峰，從三者的紫外圖中我們都可觀察到這個(gè)峰，另外在PPIX-PEG400和PPIX-PEG-PU水溶液的紫外光譜中我們可以觀察到在400 nm左右有一個(gè)明顯的吸收峰，這個(gè)峰主要來(lái)自于卟啉的 π-π* 電子躍遷。由于PPIX的高疏水性且在水溶液中PPIX形成π-π堆積，所以并未出現(xiàn)π-π*電子躍遷產(chǎn)生的吸收峰。然而PPIX-PEG400以及PPIX-PEG-PU是水溶性的，在400 nm處出現(xiàn)一個(gè)峰值，具有高吸光度，表明π-π*電子躍遷比PPIX溶液強(qiáng)得多。此外，PPIX-PEG400與二異氰酸酯的聚合導(dǎo)致單位面積PPIX密度增加，這有利于卟啉環(huán)之間的電子躍遷，因此在PPIX-PEG-PU 400 nm處的峰會(huì)出現(xiàn)紅移。

圖4 PPIX, PPIX-PEG和PPIX-PEG-PU水溶液的紫外光譜圖Fig.4 UV spectra of PPIX, PPIX-PEG and PPIX-PEG-PU water solutions

2.2 PPIX及其衍生物的光致單線態(tài)氧(1O2)分析

使用 ADMA 作為單線態(tài)氧指示劑分析了PPIX及其衍生物的1O2生成效率(圖 5)。結(jié)果表明，PPIX與ADMA的混合溶液隨著光照時(shí)間的增加，ADMA 在 250 nm 處的吸收峰幾乎沒(méi)有變化(圖5a)，這可能是因?yàn)镻PIX的疏水性以及在水中的 π-π 積累導(dǎo)致1O2生成效率極低。而可溶性PPIX-PEG和PPIX-PEG-PU與ADMA的混合溶液的吸收峰值會(huì)隨著光照時(shí)間的增加而降低(圖5(b)、(c))，PPIX-PEG-PU比PPIX-PEG產(chǎn)生的1O2更多，這是由于聚合物鏈段阻礙PPIX單元之間發(fā)生π-π堆積，從而提升了單線態(tài)氧產(chǎn)率。

圖5 (a) PPIX， (b) PPIX-PEG和(c) PPIX-PEG-PU的光致單線態(tài)氧生成(635nm激光，0.5 W/cm2)Fig.5 Photo-induced singlet oxygen generation of (a) PPIX, (b) PPIX-PEG and (c) PPIX-PEG-PU (635 nm laser,0.5 W/cm2)

2.3 PPIX及其衍生物的光動(dòng)力滅菌分析

采用瓊脂平板計(jì)數(shù)法評(píng)估PPIX及其衍生物的光動(dòng)力抗菌性能。將PPIX、PPIX-PEG 和PPIX-PEG-PU(使用相同濃度的 PPIX 單元)與細(xì)菌共培養(yǎng)并進(jìn)行光照以研究滅菌效果。結(jié)果表明，PPIX-PEG和PPIX-PEG-PU的光動(dòng)力抗菌效果顯著高于PPIX(圖6)，對(duì)于大腸桿菌，PPIX-PEG和PPIX-PEG-PU均表現(xiàn)出非常高的抗菌率，在濃度為40 μmol/L時(shí)達(dá)到100%(圖6(a))。兩者對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出差異，PPIX-PEG-PU的抗菌率明顯優(yōu)于PPIX-PEG，但當(dāng)濃度>100 μmol/L時(shí)，PPIX-PEG的抗菌率也可以達(dá)到100% (圖6(b))，但即使?jié)舛仍黾拥?80 μmol/L，PPIX-PEG 對(duì) MRSA 的抗菌率也僅達(dá)到60%左右(圖6(c))，而PPIX-PEG-PU在40 μmol/L時(shí)，激光照射5 min后幾乎達(dá)到100%。延長(zhǎng)光照時(shí)間可以增加對(duì) MRSA 的光動(dòng)力抗菌作用(圖6(d))，通過(guò)SEM對(duì)受損細(xì)菌進(jìn)行成像來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證其光動(dòng)力抗菌效果(圖7)，結(jié)果表明當(dāng)與PPIX-PEG和PPIX-PEG-PU溶液孵育的MRSA在405 nm照射下有明顯的損傷，在黑暗條件下沒(méi)有明顯影響。

圖6 不同濃度的PPIX，PPIX-PEG和PPIX-PEG-PU與(a) 大腸桿菌; (b) 金黃色葡萄球菌和 (c)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌混合后在405 nm激光照射5 min后的抗菌效果(*:p<0.05)Fig.6 Antibacterial effects of PPIX, PPIX-PEG and PPIX-PEG-PU at various concentrations after mixing with (a)E. coli; (b) S. aureus and (c) MRSA and irradiating at 405 nm for 5 min (*:p<0.05)

圖7 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌經(jīng)過(guò)不同處理后的SEM圖：(a)與 PPIX-PEG400孵育的細(xì)菌，未照射；(b)與 PPIX-PEG-PU孵育的細(xì)菌，未照射；(c)與PPIX-PEG400 孵育的細(xì)菌，然后用 405nm激光照射；(d)與 PPIX-PEG-PU孵育的細(xì)菌，然后用 405 nm 激光照射，圖中標(biāo)尺為5 μmFig.7 SEM images of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus with various treatments: (a) bacteria incubated with PPIX-PEG400, not irradiated; (b) bacteria incubated with PPIX-PEG-PU, not irradiated; (c) bacteria incubated with PPIX-PEG400 and then irradiated with 405 nm laser; (d) bacteria incubated with PPIX-PEG-PU Bacteria incubated with PEG-PU and then irradiated with 405 nm laser. Scale bars: 5 μm

2.4 PPIX-PEG與PPIX-PEG-PU的生物相容性

除了 PPIX 衍生物的抗菌作用外，還研究了它們對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在黑暗中，當(dāng)濃度高達(dá) 1 mg/mL時(shí)PPIX 衍生物對(duì)細(xì)胞是無(wú)毒的，表明具有良好的生物相容性(圖8(a)，(b))。

2.5 PPIX-PEG與PPIX-PEG-PU的細(xì)胞吸收

由于細(xì)胞會(huì)進(jìn)行胞吞作用將物質(zhì)吞入細(xì)胞內(nèi)部，因此我們研究了肝癌細(xì)胞對(duì)各個(gè)原卟啉衍生物的吸收作用，圖9(a)顯示了原卟啉衍生物與肝癌細(xì)胞孵育不同時(shí)間后細(xì)胞的吸附量圖。實(shí)驗(yàn)中的原卟啉衍生物的濃度都為1 mg/mL，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在孵育5 min后細(xì)胞對(duì)PPIX-PEG的吸附量已經(jīng)達(dá)到最大值，并且隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的吸附量不會(huì)有明顯的增加；而對(duì)于PPIX-PEG-PU，可以發(fā)現(xiàn)在孵育15 min內(nèi)，細(xì)胞的吸附量會(huì)隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，15 min后吸附量基本不會(huì)發(fā)生變化。

圖8 不同濃度的PPIX-PEG和PPIX-PEG-PU對(duì)(a)脂肪干細(xì)胞和(b)肝癌細(xì)胞的生物毒性Fig.8 Cytotoxicity of PPIX-PEG and PPIX-PEG-PU with various concentrations to (a) hASCs and (b) HepG2 cells

圖9 (a) PPIX-PEG和PPIX-PEG-PU與肝癌細(xì)胞孵育后細(xì)胞的吸附量(b)肝癌細(xì)胞與PPIX-PEG和PPIX-PEG-PU(1 mg/mL)孵育20 min后的熒光照片(c)肝癌細(xì)胞與PPIX-PEG孵育后并經(jīng)過(guò)Calcein AM和DAPI染色后的激光共聚焦層掃描圖片F(xiàn)ig.9 (a) The amount of PPIX-PEG and PPIX-PEG-PU uptaking after incubating with HepG2; (b) fluorescence images of HepG2 cells after incubation with PPIX-PEG and PPIX-PEG-HDI (1 mg/mL) for 20 min; (c) confocal fluorescence microscopy images of a layer of HepG2 cells scanned with 2 μm steps after incubation in PBS with PPIX-PEG (1 mg/mL) for 30 min and subsequently stained with Calcein AM and DAPI

為進(jìn)一步了解細(xì)胞對(duì)于原卟啉衍生物的吸收作用，將細(xì)胞與PPIX-PEG和PPIX-PEG-PU的PBS溶液孵育20 min后通過(guò)熒光顯微鏡來(lái)觀察原卟啉產(chǎn)生的紅色熒光，從圖9(b)的熒光照片來(lái)看，孵育20 min后PPIX-PEG很明顯已經(jīng)進(jìn)入了細(xì)胞，在照片中可以清楚的看到細(xì)胞顯示強(qiáng)烈的紅色熒光，且主要分散在細(xì)胞質(zhì)中，且通過(guò)圖9(c)的激光共聚焦的層掃照片可以發(fā)現(xiàn)PPIX-PEG的紅色熒光與染料Calcein-AM的綠色熒光以及染料DAPI的藍(lán)色熒光出現(xiàn)在細(xì)胞的同一層面，因此進(jìn)一步證實(shí)了PPIX-PEG可以進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)部；然而對(duì)于與PPIX-PEG-PU孵育20 min后的細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡只觀察到了微弱的紅色熒光，我們通過(guò)激光共聚焦顯微鏡也并未發(fā)現(xiàn)有紅色熒光與染料分子的熒光出現(xiàn)在同一層面，因此我們猜測(cè)由于PPIX-PEG-PU的分子量大不易于通過(guò)細(xì)胞的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，可能會(huì)隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)其自身會(huì)沉淀且吸附于細(xì)胞表面，所以才會(huì)出現(xiàn)圖9(a)的曲線，但是在染色過(guò)程中由于PBS的多次清洗導(dǎo)致其被PBS溶液清洗掉，因此在熒光顯微鏡中只能觀察到極微弱的熒光。

圖10 HepG2細(xì)胞與不同濃度的PPIX-PEG和PPIX-PEG-PU孵育20 min后(a)在405 nm激光(b)635nm激光照射5 min后的細(xì)胞存活率(*:p<0.05)；(c)肝癌細(xì)胞與PPIX-PEG和PPIX-PEG-PU (1 mg/mL) 孵育20 min后在405 nm激光下照射不同時(shí)間后的存活率(*:p<0.05)；(d) 肝癌細(xì)胞與PPIX-PEG和PPIX-PEG-PU (1 mg/mL) 孵育20 min后在不同激光照射后與Calcein AM (綠)和PI (紅)染色后的熒光照片，圖中標(biāo)尺為50 μmFig.10 (a) Viability of HepG2 cells cultured with PPIX-PEG and PPIX-PEG-PU at various concentrations for 20 min and irradiated at 405 nm and (b) 635 nm for 5 min (*:p<0.05); (c) viability of HepG2 cells cultured with PPIX-PEG and PPIX-PEG-PU (1 mg/mL) for 20 min and irradiated at 405 nm for various periods of time (*:p<0.05); (d) fluorescent images of HepG2 cells incubated with PPIX-PEG and polyurethane (1 mg/mL) for 20 min and irradiated under different conditions and stained with Calcein AM (green) and PI (red). Scale bars: 50 μm

2.6 PPIX-PEG和PPIX-PEG-PU對(duì)肝癌細(xì)胞的光動(dòng)力滅活分析

在HepG2細(xì)胞與PPIX衍生物一起培養(yǎng)后，研究了光照后的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，在相同條件下，405 nm激光照射對(duì)細(xì)胞滅活效率高于 635 nm激光照射。在只有高濃度時(shí)PPIX-PEG-PU顯示出比PPIX-PEG更高的細(xì)胞滅活效率(圖10(a)，(b))，這些結(jié)果與之前的1O2生成效率實(shí)驗(yàn)結(jié)果不太一致，原因可能是PPIX-PEG-PU與PPIX-PEG比不能進(jìn)入細(xì)胞，由于PPIX-PEG會(huì)通過(guò)細(xì)胞的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，PPIX-PEG-PU只是吸附在細(xì)胞表面，在后續(xù)的PBS清洗中導(dǎo)致PPIX-PEG-PU的流失，從而降低了PPIX-PEG-PU的有效利用，減弱了其光動(dòng)力的殺傷效果，而在濃度較高時(shí)吸附在細(xì)胞表面的PPIX-PEG-PU的量會(huì)更多，由于其更強(qiáng)的光動(dòng)力效果致使對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷效果會(huì)強(qiáng)于PPIX-PEG。從圖10(c)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在高濃度且405 nm激光照射時(shí)，PPIX-PEG-PU僅僅照射2 min就滅活了80%的肝癌細(xì)胞，而PPIX-PEG400需要照射4 min，說(shuō)明PPIX-PEG-PU具有更強(qiáng)的光動(dòng)力效果。

圖11 經(jīng)各種處理的HePG2細(xì)胞的SEM圖像：(a)正常細(xì)胞；(b)與PPIX-PEG400孵育的細(xì)胞，未照射；(c)與PPIX-PEG400孵育的細(xì)胞，然后用635 nm激光照射；(d)與PPIX-PEG400孵育的細(xì)胞，然后用405 nm激光照射)。圖中標(biāo)尺為10 μmFig.11 SEM images of HePG2 cells with various treatments: (a) normal cells; (b) cells incubated with PPIX-PEG400 without irradiation; (c) cells incubated with PPIX-PEG400 then irradiate with 635nm laser; (d) cells incubated with PPIX-PEG400 then irradiate with 405 nm laser. Scale bars: 10 μm

通過(guò)細(xì)胞染色來(lái)對(duì)PPIX衍生物對(duì)肝癌細(xì)胞的的光動(dòng)力滅活效果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。幾乎所有與PPIX衍生物孵育并被405 nm激光照射的細(xì)胞都被PI染成紅色，沒(méi)有細(xì)胞質(zhì)，表明大多數(shù)細(xì)胞在照射后破裂/死亡。如果使用635 nm照射，則有一些細(xì)胞被Calcein AM染成綠色，但大部分細(xì)胞已被破壞，證實(shí)了405 nm激光照射對(duì)細(xì)胞滅活效率高于635 nm激光照射。通過(guò)圖11細(xì)胞的SEM圖像顯示，在405 nm激光照射下幾乎沒(méi)有完整的細(xì)胞，而當(dāng)在635 nm下照射時(shí)，一些細(xì)胞仍然保持它們的細(xì)胞膜。

3 結(jié) 論

合成了水溶性的PPIX-PEG衍生物以及PPIX-PEG-PU聚合物，研究了PPIX-PEG與PPIX-PEG-PU光致生成單線態(tài)氧的情況；探討了應(yīng)用于光動(dòng)力滅活細(xì)菌以及癌細(xì)胞的效果。結(jié)果表明：(1)PPIX-PEG-PU中由于聚合物鏈段可以阻礙PPIX單元的π-π堆積，光照下生成最多的單線態(tài)氧；(2)PPIX-PEG-PU對(duì)E.coli、S.aureus和MRSA表現(xiàn)出優(yōu)于PPIX-PEG與PPIX的光動(dòng)力抗菌效率；(3)細(xì)胞可以通過(guò)內(nèi)吞作用攝入PPIX-PEG，而難以攝入PPIX-PEG-PU；(4)癌細(xì)胞的光動(dòng)力滅活效率與細(xì)胞對(duì)光敏劑的攝取有密切聯(lián)系，但PPIX-PEG-PU仍具有優(yōu)于PPIX-PEG的光動(dòng)力滅活效率；(5)在黑暗條件下PPIX-PEG與PPIX-PEG-PU具有良好的生物相容性。