宋曉婉,鐘亞安,宋旭鳳,代真真,梁先龍
(安徽中青檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司,安徽合肥 230088)
蘇丹紅染料是一種人工合成的以苯基偶氮萘酚為主要基團(tuán)的親脂性偶氮化合物,蘇丹紅 I 化學(xué)名稱為1-苯基偶氮-2-萘酚,蘇丹紅 Ⅱ 化學(xué)名稱為 1-[(2,4-二甲基苯)偶氮]-2-萘酚,蘇丹紅 Ⅲ 化學(xué)名稱為 1-[4-(苯基偶氮)苯基]偶氮-2-萘酚,蘇丹紅 IV 化學(xué)名稱為1-2-甲基-4-[(2-甲基苯)偶氮]苯基偶氮-2-萘酚,因蘇丹紅類物質(zhì)含有氮氮雙鍵(偶氮基),即結(jié)構(gòu)式中的—N==N—,與連接在其兩端的苯環(huán)一起構(gòu)成發(fā)色基團(tuán),偶氮基與芳香結(jié)構(gòu)構(gòu)成的偶氮苯大共軛體系能夠吸收一定波長的可見光,故含有偶氮苯體系的物質(zhì)能顯現(xiàn)出一定的顏色使其外觀為暗紅色或深黃色片狀體,主要用于石油、機(jī)油和其他的一些工業(yè)溶劑中,目的是使其增色,也用于鞋、地板等的增光。經(jīng)研究表明,蘇丹紅具有致突變和致癌性[1-2],我國和歐盟都禁止用于食品中,但仍有一些不法分子在利益驅(qū)使下,在飼料中加入蘇丹紅染料,家禽食入體內(nèi)后得到好看的“紅黃蛋”。
目前,食品中蘇丹紅的檢測(cè)方法主要有氣相色譜質(zhì)譜法[3-6]、液相色譜質(zhì)譜法[7-11]、液相色譜法[12-13]、薄層色譜法[14-15]等,而國內(nèi)已熟知蘇丹紅的檢測(cè)方法為 GB/T 19681—2005《食品中蘇丹紅染料的檢測(cè)方法 高效液相色譜法》[16],國標(biāo)法中用氧化鋁小柱凈化樣品,采用液相色譜法檢測(cè)食品中的蘇丹紅,該方法操作煩瑣、結(jié)果重現(xiàn)性差,且針對(duì)基質(zhì)復(fù)雜樣品不能較好地去除樣品中的雜質(zhì)。張?chǎng)蔚萚17]解決了國標(biāo)中的中性氧化鋁固相萃取柱手工填裝且不容易把握填裝量的困難,通過對(duì)不同填料量的市售中性氧化鋁固相萃取柱進(jìn)行比較,選擇了其中一款500 mg/6 mL 的中性氧化鋁固相萃取柱,但是對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的樣品,凈化效果不好,基質(zhì)干擾較多,回收率較低,且依然存在氧化鋁活度難以掌控的問題。程曉宏等[12]利用分子印跡固相萃取小柱能選擇性地識(shí)別和富集蘇丹紅染料,正己烷淋洗樣品中油性雜質(zhì),二氯甲烷洗脫蘇丹紅染料的原理提取樣品中的蘇丹紅,但是對(duì)于油脂較多的辣椒醬來說,仍然存在富集液體顏色深、基質(zhì)干擾大的困擾。根據(jù)蘇丹紅具有親脂性的化學(xué)性質(zhì),筆者嘗試采用以聚苯乙烯-二乙烯基苯(PSD)和N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯(HLB)這2種聚合物基質(zhì)為串聯(lián)固相萃取柱填料代替氧化鋁作為固相萃取材料來凈化樣品,選擇合適的淋洗液和洗脫液,同時(shí)優(yōu)化樣品前處理?xiàng)l件,達(dá)到快速、高效、準(zhǔn)確地測(cè)定樣品中蘇丹紅含量 。
1.1 儀器液相色譜儀,美國 Thermo fisher公司;JK-500型超聲波清洗器,TGL-16M 離心機(jī),上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;G560E 渦旋混勻器,上海佳能電子科技有限公司;十萬分之一、萬分之一電子天平,德國賽多利斯公司。HSC-24B氮?dú)獯蹈蓛x,天津恒奧科技發(fā)展有限公司;蘇丹紅專用柱、PSD固相萃取柱、HLB固相萃取柱,上海安譜科學(xué)儀器有限公司。
1.2 試劑蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品來源為 Dr.Ehrenstorfer.,以上標(biāo)準(zhǔn)品純度均為99.0%;乙醚、乙腈、甲酸、正己烷、丙酮、乙酸乙酯均為色譜純,德國Merck公司;一級(jí)水,由超純水系統(tǒng)制備。
1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制準(zhǔn)確稱取蘇丹紅Ⅰ ~ Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品,用乙醚溶解后,用色譜級(jí)丙酮配制成 0.1 mg/mL 的儲(chǔ)備液,臨用時(shí)再用丙酮稀釋成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,4 ℃下避光保存。
1.4 液相色譜條件色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18柱(4.6 mm × 150 mm,3.5 μm);流動(dòng)相為乙腈(A)∶水(B)(90∶10,v/v),等度洗脫;流速1.0 mL/min;柱溫40 ℃;檢測(cè)波長分別為蘇丹紅Ⅰ 478 nm、蘇丹紅Ⅱ 520 nm、蘇丹紅Ⅲ 520 nm、蘇丹紅Ⅳ 520 nm;進(jìn)樣量10 μL。
1.5 樣品前處理準(zhǔn)確稱取 2.000 g(精確至 0.001 g)試樣于離心管中,加入 10 mL 正己烷,渦旋混勻 1 min,超聲提取 5 min,以5 000 r /min 的速度離心 3 min,移出上清液,下層固體再用 5 mL 正己烷提取 2次,合并提取液。將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5 mL左右后加入用正己烷活化過的PSD柱和HLB柱的串聯(lián)柱中,以 3 mL 正己烷淋洗2次,棄去淋洗液,去掉上面的PSD柱,并抽干下面的HLB柱,最后用 5 mL 乙酸乙酯洗脫,收集洗脫液,用氮吹儀 于45 ℃下氮吹至近干。用 1 mL 乙腈溶解定容,渦旋 10 s 后過 0.22 μm 有機(jī)濾膜,供液相色譜測(cè)定。
2.1 樣品前處理方法國標(biāo)方法中采用正己烷-丙酮提取,中性氧化鋁為吸附劑進(jìn)行凈化,過程煩瑣,試劑消耗量大,且對(duì)中性氧化鋁活度難以控制。目前市面上出現(xiàn)多種蘇丹紅專用小柱,在進(jìn)行多家比對(duì)試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)在處理辣椒醬、辣椒油等基質(zhì)比較復(fù)雜的樣品時(shí),仍然出現(xiàn)洗脫液顏色較深、雜峰較多、基質(zhì)效應(yīng)依然存在等問題。該試驗(yàn)中對(duì)于高含量油脂的辣椒醬首先采用正己烷進(jìn)行提取,渦旋超聲增加提取效率,然后將提取液加入去油脂和蘇丹紅富集的串聯(lián)柱中,樣品通過去除油脂后被富集至下層小柱,再用洗脫液進(jìn)行收集。
2.2 色譜條件及標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋液的優(yōu)化國標(biāo)方法中用0.1%甲酸水、乙腈、丙酮作為流動(dòng)相,4 種蘇丹紅在色譜柱中均可以達(dá)到分離效果,但是比較煩瑣,該試驗(yàn)采取乙腈和水作為流動(dòng)相,在試驗(yàn)中嘗試調(diào)整流動(dòng)相乙腈和水的比例為100∶0、95∶5和90∶10時(shí),發(fā)現(xiàn)4種蘇丹紅在90∶10時(shí)均能達(dá)到很好的分離效果。因?yàn)橐合嗌V方法是反向色譜法,流動(dòng)相中含有水,在用國標(biāo)方法正己烷作為標(biāo)準(zhǔn)溶液定容液體時(shí),正己烷與水不互溶導(dǎo)致色譜峰形不理想,該試驗(yàn)嘗試采用丙酮定容,峰形改善效果明顯。
2.3 洗脫液的選擇購買基質(zhì)比較復(fù)雜的辣椒醬陽性樣品,采用串聯(lián)柱凈化的方法,研究丙酮-正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯3種不同洗脫溶劑對(duì)4種蘇丹紅的洗脫能力。由圖1可見,不同洗脫溶劑對(duì)蘇丹紅Ⅲ的效果無明顯變化,但蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅳ通過丙酮-正己烷的洗脫效果均為最差,而乙酸乙酯對(duì)4 種蘇丹紅的洗脫效果均是最好的,且乙酸乙酯的毒性相對(duì)較小。
圖1 不同溶劑洗脫效率的比較Fig.1 Comparison of elution efficiency of different solvents
2.4 凈化方式的選擇因?yàn)檎和榈臉O性很低,對(duì)油脂類物質(zhì)也有很好的溶解性,在使用正己烷作為提取劑提取樣品中蘇丹紅時(shí),不可避免地也會(huì)把樣品中的一些油脂成分提取出來,因此在凈化過程中提前除去樣品中的油脂成分就顯得非常必要。現(xiàn)行國標(biāo)GB/T 19681—2005中規(guī)定的方法是使用中性氧化鋁柱來凈化樣品中的油脂,該方法的缺點(diǎn)是操作比較煩瑣,針對(duì)基質(zhì)復(fù)雜樣品不能較好地去除樣品中的雜質(zhì),且中性氧化鋁柱的活度難以控制導(dǎo)致4種蘇丹紅染料的保留差異較大,回收率不穩(wěn)定。因此該試驗(yàn)針對(duì)上述問題進(jìn)行了研究,將蘇丹紅專用柱和PSD串聯(lián)HLB柱的效果進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,蘇丹紅專用柱不能有效去除油脂帶來的干擾,大部分油脂依然會(huì)伴隨蘇丹紅一起洗脫下來,如圖2a所示基質(zhì)干擾峰較多,基質(zhì)干擾強(qiáng)度較大,且與目標(biāo)化合物保留時(shí)間接近,因此不能準(zhǔn)確定量。而使用PSD串聯(lián)HLB柱的基質(zhì)干擾現(xiàn)象(圖2b)明顯低于使用蘇丹紅專用柱。這是因?yàn)镻SD柱和HLB柱填料均可以有效地去除樣品中的油脂成分,并且正己烷淋洗液可以將目標(biāo)化合物富集至HLB柱中,再用乙酸乙酯對(duì)HLB柱進(jìn)行洗脫,即可有效達(dá)到凈化效果,此過程操作更為簡單、溶劑消耗量更少、回收率較穩(wěn)定且能達(dá)到國標(biāo)要求。
注:1.蘇丹紅Ⅰ;2.蘇丹紅Ⅱ;3.蘇丹紅Ⅲ;4.蘇丹紅ⅣNote:1.Sudan dye I;2.Sudan dye Ⅱ;3.Sudan dye Ⅲ;4.Sudan dye Ⅳ圖2 蘇丹紅專用柱(a)和串聯(lián)柱(b)凈化效果色譜圖Fig.2 Chromatogram of purification effect of Sudan dye special column(a)and tandem column(b)
2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限以丙酮為溶劑,配制蘇丹紅Ⅰ~ Ⅳ混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列濃度為 0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 μg/mL,進(jìn)樣10 μL,HPLC分析測(cè)定,以峰面積(Y)對(duì)濃度 (X,μg /mL)進(jìn)行回歸分析。 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 回歸方程分別為Y=0.502 8X-0.007 9(蘇丹紅Ⅰ)、Y= 0.582 5X-0.012 1(蘇丹紅Ⅱ)、Y=0.781 6X-0.008 2(蘇丹紅Ⅲ)、Y=0.824 7X-0.017 4(蘇丹紅Ⅳ),決定系數(shù)(R2)均大于 0.999,表明蘇丹紅Ⅰ~Ⅳ在0.01~0.20 μg/mL呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,該方法適用于辣椒醬中蘇丹紅染料的定量分析。 取陰性辣椒醬樣品,加入逐級(jí)稀釋不同濃度的蘇丹紅Ⅰ~ Ⅳ混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)行樣品處理并上機(jī),測(cè)得信噪比為 3時(shí)對(duì)應(yīng)的蘇丹紅的檢出限均為5.0 μg/kg。
2.6 回收率與精密度該試驗(yàn)選用市場(chǎng)上3種含油量和含水量不同的3種陰性辣椒醬樣品,采用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法,添加濃度分別為15.0、30.0 和 75.0 μg/kg,對(duì) 4種蘇丹紅染料進(jìn)行了添加回收率試驗(yàn),取6次操作的平均值。從表1可以看出,4種蘇丹紅在 3 種不同加標(biāo)濃度下的回收率為 84%~95%,RSD為1.5%~6.1%。
表1 辣椒醬中蘇丹紅Ⅰ~Ⅳ的加標(biāo)回收率及RSD(n=6)
該研究討論了對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的辣椒醬,采用正己烷提取,以聚苯乙烯-二乙烯基苯(PSD)和N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯(HLB)這2種聚合物基質(zhì)的串聯(lián)固相萃取柱填料進(jìn)行有效凈化,并結(jié)合高效液相色譜儀測(cè)定其中4種蘇丹紅染料的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在添加濃度分別為15.0、30.0、75.0 μg/kg 時(shí),4種蘇丹紅回收率在84%~95%,RSD在1.5%~6.1%;蘇丹紅Ⅰ~Ⅳ在0.01~0.20 μg/mL呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2>0.999),檢出限為5.0 μg/kg。該方法操作簡便、準(zhǔn)確度和靈敏度較國標(biāo)高,適用于辣椒醬中痕量蘇丹紅染料的殘留檢測(cè)。