王曉蓉，方清茂，王洪蘇，羅 冰，吳 萍，王曉宇*

(1.康定恩威高原藥材野生撫育基地有限責任公司，四川康定 626002；2.四川省中醫(yī)藥科學院，四川成都 610041)

貝母始載《神農本草經》，其中川貝母是最具地域代表性，且是以“潤肺”著稱的貝母類藥材之一[1-4]。歷代本草及醫(yī)家認為“川貝母，味甘，潤，能潤肺止咳”[2]，表明“甘味”是川貝母味覺特征之一。有學者發(fā)現貝母化學成分復雜，不同貝母及不同基原的川貝母均無共同結構的生物堿類成分[1-2]。據報道，貝母清熱止咳的功效可能與苦味化學物質基礎有關；而川貝母的潤肺作用可能與甘味的化學物質基礎相關[5-6]。感官智能分析技術利用現代信息技術模仿人的感覺行為，自動獲取檢測對象的感官信息，具有操作簡單、快速、高效等特點。因多數中藥具有特定的形、色、氣、味，且性狀特征與內在化學成分、基原、產地及采收期等相關[7-9]。因此，該研究將電子舌分析技術引入貝母的品質評價中，采用紫外-可見分光光度法對貝母中的總多糖、總生物堿含量進行測定，通過比較川貝母與其他貝母的味覺信息值和主要化學成分的差異，為川貝母藥材的道地性及味覺特征性提供一定的研究基礎和科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器SA402B 系列智能味覺分析系統(tǒng)(日本INSENT公司)；CM-5分光測色計(柯尼卡美能達中國投資有限公司)；UV-1800 型紫外可見分光光度計(日本島津科學儀器有限公司)；電子分析天平(十萬分之一，XS205型，瑞士Mettler Toledo股份有限公司)；KQ2200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DHG-9240型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；電子分析天平(萬分之一，BSA224S型，德國Sartouris股份有限公司)；離心機(LXJ-Ⅱ B型，上海安亭科學儀器廠)。

1.2 試藥與試劑西貝母堿對照品(98.00%，批號MUST-18071404)、無水葡萄糖對照品(99.85%，批號MUST-17012905)、貝母素乙對照品(99.88%，批號MUST-18052501)，均購自成都曼斯特生物制品有限公司。色譜純乙腈、色譜純甲醇，TEDIA公司產品；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 樣品信息川貝母藥材收集自四川省川貝母道地產區(qū)紅原、松潘、康定等地，浙貝母、伊貝母、平貝母藥材購自成都荷花池藥材市場，經四川省中醫(yī)藥科學院方清茂研究員鑒定分別為川貝母FritillariacirrhosaD.Don、暗紫貝母FritillariaunibracteataHsiao et K.C.Hsia、瓦布貝母FritillariaunibracteataHsiao et K.C.Hsia var.wabuensis(S.Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu，S.Wang et S.C.chen、浙貝母FritillariathunbergiiMiq.、伊貝母FritillariapallidifloraSchrenk、平貝母FritillariaussuriensisMaxim.，具體信息見表1。

表1 不同來源貝母樣品信息

2 方法與結果

2.1 生物堿含量測定方法的建立

2.1.1對照品溶液的制備。取西貝母堿對照品適量，精密稱定，加三氯甲烷制成0.2 mg/mL的溶液，即得。

2.1.2標準曲線的繪制。精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、1.0 mL，置25 mL具塞試管中，分別補加三氯甲烷至10.0 mL，精密加水5 mL，再精密加0.05%溴甲酚綠緩沖液(取溴甲酚綠0.05 g，用0.2 mol/L氫氧化鈉溶液6 mL使溶解，加磷酸二氫鉀1 g，加水使溶解并稀釋至100 mL，即得)2 mL，密塞，劇烈振搖1 min，轉移至分液漏斗中，放置30 min。取三氯甲烷液，用干燥濾紙濾過，取續(xù)濾液，以相應的試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法，在415 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線。

2.1.3供試品溶液的制備。取本品粉末(過3號篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加濃氨試液3 mL，浸潤1 h，加三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液40 mL，置80 ℃水浴加熱回流2 h，放冷，濾過濾液置50 mL容量瓶中，用適量三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液洗滌藥渣2～3次，洗液并入同一容量瓶中，加三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液至刻度，搖勻備用。

2.1.4測定方法。精密量取5.0 mL，置25 mL具塞試管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL 使溶解，按照“2.1.2”方法，自“精密加水5 mL”起，依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中西貝母堿的重量(mg)計算，即得。本品按干燥品計算，含總生物堿以西貝母堿(C27H43NO3)計，不得少于0.050%。

2.1.5精密度試驗。取同一對照品溶液，按“2.1.2”方法，自“精密加水5 mL”起，依法測定吸光度，連續(xù)測定5次，記錄吸光度，RSD分別為0.96%、0.91%、0.97%、1.20%、1.31%，表明儀器精密度良好。

2.1.6重復性試驗。取同一川貝母樣品2 g，平行取5份，精密稱定，按照“2.1.3”方法制備供試品溶液，按“2.1.2”方法，自“精密加水5 mL”起，依法測定吸光度，RSD分別為1.07%、1.11%、1.01%、0.92%、0.89%，表明該方法重復性良好。

2.1.7穩(wěn)定性試驗。取同一批川貝母供試品溶液，按“2.1.2”方法，自“精密加水5 mL”起，依法測定吸光度，分別于0、2、4、6、12 h測定，記錄各時間段的吸光度，RSD分別為0.89%、1.24%、1.13%、0.97%、1.08%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.8加樣回收率試驗。精密稱取已知總生物堿含量的川貝母供試品粉末約1.0 g，精密稱定6份，加入對照品儲備液適量，按“2.1.3”方法制備供試品溶液，按“2.1.2”方法，自“精密加水5 mL”起，依法測定吸光度，計算得到西貝母堿的平均加樣回收率分別為99.31%、100.77%、99.81%、101.34%、100.57%、99.92%，RSD分別為0.98%、1.56%、1.98%、0.88%、2.32%、0.91%，表明該方法加樣回收率良好。

2.1.9樣品測定及結果。取貝母樣品粉末，平行2份，按“2.1.3”方法制備供試品溶液，按“2.1.2”方法，自“精密加水5 mL”起，依法測定吸光度，計算樣品含量。測定結果見表2。由表1～2可知，不同基原的川貝母均含有生物堿，且均能達到藥典規(guī)定[3]；其中栽培5年的瓦布貝母(編號3)含量最高，與文獻報道一致[10-11]。暗紫貝母(編號1、2、5、6、7、13)的生物堿含量較低，同時暗紫貝母栽培品(編號5～7)的生物堿含量均大于野生品(編號1、2、13)，分析可能與生長年限、施用肥料等有關。隨著生長年限的增加，生物堿含量有逐步遞增的趨勢。

表2 不同來源貝母樣品總生物堿和總多糖的含量測定結果(n=2)

2.2 多糖含量測定方法的建立

2.2.1對照品溶液的制備。取無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加超純水制成0.4 mg/mL的溶液，即得。

2.2.2標準曲線的繪制。精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL置25 mL具塞試管中，分別補加超純水至2.0 mL，再精密加入6%苯酚水溶液1.0 mL，再迅速加入濃硫酸5.0 mL，混勻后迅速在冰水浴中冷卻，以相應的試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法，在490 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線。

2.2.3供試品溶液的制備。取本品粉末(過3號篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加石油醚(60～90 ℃)30 mL，回流提取3次，每次1 h，保留濾渣，揮干溶劑；加入80%乙醇溶液30 mL，回流提取2 h，保留濾渣，揮干溶劑；再加入超純水100 mL，回流提取2 h，趁熱濾過，取濾液5 mL，置50 mL容量瓶中，加超純水至刻度，搖勻備用。

2.2.4測定方法。精密量取供試品溶液1.0 mL，置25 mL具塞試管中，分別補加超純水至2.0 mL，以相應的試劑為空白，按照“2.2.2”方法，依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中葡萄糖的重量(mg)計算，即得。

2.2.5精密度試驗。取同一對照品溶液，按“2.2.2”方法，依法測定吸光度，連續(xù)測定5次，記錄吸光度，RSD分別為0.89%、0.94%、0.99%、1.21%、1.35%，表明儀器精密度良好。

2.2.6重復性試驗。取同一川貝母樣品2 g，平行取5份，精密稱定，按照“2.2.3”方法制備供試品溶液，按“2.2.2”方法，依法測定吸光度，RSD分別為0.99%、1.03%、0.95%、1.12%、0.98%，表明該方法重復性良好。

2.2.7穩(wěn)定性試驗。取同一批川貝母供試品溶液，按“2.2.2”方法，依法測定吸光度，分別于0、2、4、6、12 h測定，記錄各時間段的吸光度，RSD分別為0.89%、1.29%、1.40%、0.96%、0.94%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.8加樣回收率試驗。精密稱取已知總多糖含量的川貝母供試品粉末約1.0 g，精密稱定6份，加入對照品儲備液適量，按“2.2.3”方法制備供試品溶液，按“2.2.2”方法，依法測定吸光度，計算得到葡萄糖的平均加樣回收率分別為99.45%、100.32%、99.89%、101.22%、100.57%、100.80%，RSD分別為0.97%、1.37%、1.93%、0.91%、2.50%、0.92%，表明該方法加樣回收率良好。

2.2.9樣品測定及結果。取貝母樣品粉末，平行2份，按“2.2.3”方法制備供試品溶液，按“2.2.2”方法，依法測定吸光度，計算樣品含量。測定結果見表2。由表2可知，除浙貝母(編號9)外，不同來源的貝母多糖含量均較高，與文獻一致[12-13]；且川貝母的多糖含量整體大于浙貝母。

2.3 不同來源貝母中多糖與生物堿比值分析由表2可知，貝母多糖與生物堿含量比值的差異明顯，野生川貝母(編號1、2、11、12、13)的多糖與生物堿含量比值均較高，在30左右，而栽培品的比值均較??；浙貝母(編號9)的多糖與生物堿含量比值最低，為5.32。表明多糖與生物堿含量比值能夠有效區(qū)分不同產地、不同基原的貝母藥材。

2.4 貝母粉末水提液的味覺信息值測定方法

2.4.1電子舌參比液的制備。精密稱定2.236 5 g氯化鉀和0.045 0 g酒石酸用500 mL蒸餾水溶解，然后轉移到1 000 mL容量瓶，定容。

2.4.2供試品溶液的制備。取貝母樣品粉末(過4號篩)約2.0 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入蒸餾水100 mL，稱定重量，加熱回流提取1 h，放冷，補足減失重量，搖勻，4 000 r/min離心10 min，取上清液作為供試品溶液。

2.4.3電子舌測試方法。在清洗液中清洗90 s，接著用參比液清洗2次，傳感器在平衡位置歸零30 s，達到平衡條件后，開始測試，測試時間30 s；在2組參比液中分別短暫清洗3 s，傳感器插入新的參比液中測試回味30 s，循環(huán)測試4次，去掉第一循環(huán)，取后3次平均數據作為測試結果。

2.4.4不同來源貝母藥材味覺信息值測定結果。采用電子舌技術對不同來源的貝母藥材味道進行數字定量化測定，收集3次平行測試數據，求得平均值，結果見表3。

表3 不同來源貝母味覺信息值測定結果(n=3)

由圖1可知，不同來源貝母的整體味覺信息值存在差異，但差異不顯著。樣品間差異主要體現在酸味、鮮味和咸味上；最顯著的是酸味，其中浙貝母(編號9)的酸味值最高(-20.63)，川貝母(瓦布貝母，即編號3)的酸味值最低(-35.08)；其次是鮮味，浙貝母的鮮味值最低(5.27)，而川貝母(瓦布貝母)較高(10.91)，其中川貝母栽培品(編號3～7)的鮮味值大于野生品(編號11～13)。浙貝母的味覺信息值與其他來源貝母的差異較大，其酸味值(-20.63)、澀味回味值(-0.04)均最高，苦味值(9.70)、鮮味值(5.27)和甜味值均最低(13.54)。

圖1 13種不同來源貝母的味覺信息值雷達圖Fig.1 Radar chart of taste information values of Fritillaria ussuriensis from different sources

由圖2可知，川貝母藥材(暗紫貝母)的味覺信息野生品與栽培品存在一定差異。野生品酸味較強，咸味較弱；而栽培品呈與之相反的趨勢。

圖2 川貝母(暗紫貝母)野生品與栽培品的味覺信息值比較Fig.2 Comparison of taste information values between wild and cultivated Fritillaria cirrhosa(Fritillaria unibracteata)

由圖3～4可知，不同產地貝母的味覺信息值在酸味值上差異明顯，其中川貝母與浙貝母的味覺差異較顯著，尤其體現在酸味、咸味及鮮味上；川貝母不同基原間的味覺信息值差異最顯著的是酸味，其次是咸味。

圖3 不同產地貝母的味-覺信息值比較Fig.3 Comparison of taste information values of Fritillaria ussuriensis from different habitats

圖4 川貝母不同基原的味覺信息值比較Fig.4 Comparison of taste information values of different primitives of Fritillaria ussuriensis

3 小結

歷來貝母藥材的基原眾多，產地復雜，且價格高，尤以川貝母混偽品較多[8-9]。傳統(tǒng)各類貝母均以粒小、均勻、完整、質堅實、色純白、具有光澤者為佳，三大類川貝母優(yōu)劣順序為松貝、青貝、爐貝[14]。因此，有效鑒別川貝母與其他貝母的研究急需進一步深入。

通過研究表明，電子舌測得的味覺信息值可用于區(qū)分不同產地的貝母藥材以及不同基原的川貝母藥材；在主要化學成分上，可通過總多糖含量、多糖/生物堿含量的比值區(qū)分浙貝母與其他產地貝母藥材。

人工栽培對川貝母藥材的品質有一定影響。暗紫貝母野生品的生物堿含量較低，栽培品的含量有所升高；且野生品與栽培品的味覺信息值在酸味、咸味上差異較大，推測可能與生長年限、施用農家肥等有關。