孔德一，解佑銀，黃君霞，曲有樂，張雷芳

(浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)院，浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022)

長期飲酒會導(dǎo)致多種疾病。酒精性肝病(AFLD)最初表現(xiàn)為酒精性肝病，可惡化為嚴(yán)重酒精性肝炎(ASH)、酒精性肝硬化(AC)，甚至晚期惡化為肝癌[1]。酒精性肝損傷是由于體內(nèi)酒精引起的氧化應(yīng)激引起的氧化產(chǎn)物增加，導(dǎo)致肝臟內(nèi)脂肪積累、脂質(zhì)過氧化和炎癥反應(yīng)，隨后肝細(xì)胞進(jìn)一步的炎癥、壞死、纖維化和硬化[2]。酒精性肝損傷的原因是由于酒精在體內(nèi)的惡性代謝。飲酒后，酒精的代謝途徑是通過胃腸道擴(kuò)散進(jìn)入血液，大部分酒精被乙醇脫氫酶和微粒體乙醇氧化系統(tǒng)氧化和代謝，產(chǎn)生大量活性氧、超氧陰離子(O2-)等。正常肝臟中存在氧化還原酶和抗氧化劑，可通過消除上述產(chǎn)物來有效地平衡人體的氧化系統(tǒng)。人體長期大量飲酒會導(dǎo)致體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)紊亂，難以維持氧化還原平衡，導(dǎo)致失衡、氧化應(yīng)激反應(yīng)、脂代謝紊亂和肝臟炎癥，進(jìn)而發(fā)展成酒精性肝損傷[3]。

赤瓟(TDB)是葫蘆科多年蔓生草本，主要分布在我國東北、華北、內(nèi)蒙古自治區(qū)以及朝鮮半島[4]。研究表明，根、果實(shí)、莖和葉的不同部位不僅具有重疊的藥理作用，而且具有相似的成分。赤瓟具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗?jié)儭⒖寡趸瘧?yīng)激、抗過敏等藥理活性，可促進(jìn)肝糖原合成和肝細(xì)胞再生[5-6]。有學(xué)者研究了赤瓟提取物對小鼠和大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的抗炎和鎮(zhèn)痛作用[7]，赤瓟根提取物通過降低雌激素和孕酮對雌性大鼠乳腺增生的抗乳腺增殖作用[8]。趙波等[9]研究發(fā)現(xiàn)，赤瓟多糖可提高免疫抑制小鼠的免疫力。也有研究表明，赤瓟皂苷(ThladianthadubiaBunge saponins，TD)具有抗氧化、抗炎、提高免疫力等作用，學(xué)者們已經(jīng)從赤瓟根中分離出一些皂苷，如dubioside A、B、C、D、E、F和thladiosude-H1，這些成分主要是齊墩果酸化合物[10-13]。目前，關(guān)于赤瓟提取物治療肝損傷的研究較少，赤瓟皂苷對肝損傷的干預(yù)作用鮮見報道。該研究以赤瓟提取物為研究對象，測定其乙醇提取物中皂苷的含量，評價其在酒精性肝損傷小鼠模型中的保肝作用，觀察肝臟的病理變化，測定氧化應(yīng)激的相關(guān)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 試劑紅星二鍋頭(56%，w/v)，購自中國北京紅星股份有限公司；赤瓟?shù)母?、果、葉來自吉林通化野外；無水乙醇、石油醚、正丁醇、甲醛、高氯酸，均來自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；天強(qiáng)牌護(hù)肝寧片，購自吉林天晴制藥股份有限公司；香草醛和齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；冰醋酸，購自遼寧嘉誠精細(xì)化學(xué)品有限公司；肝素鈉，購自上海阿拉丁生化科技有限公司；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢測試劑盒，購自上海聯(lián)碩寶為生物科技公司；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)檢測試劑盒，購自上海聯(lián)邁生物工程公司；活性氧(ROS)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(WST-8法)、過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒、谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒，均購自碧云天公司；髓過氧化物酶(MPO)檢測試劑盒，購自上海聯(lián)碩寶為生物科技有限公司。

1.2 赤瓟皂苷的制備取赤瓟根、果、葉干粉100 g，加800 mL 70%乙醇浸泡12 h，60 ℃回流提取2次，每次1.5 h，將所得藥液合并，抽濾，減壓濃縮濾液，60 ℃烘箱加熱得到干膏；取適量的赤瓟干膏溶于純水中，然后用石油醚和正丁醇依次提?。蛔詈?，減壓濃縮提取液，在60 ℃下加熱，得到干燥的正丁醇提取物。所得赤瓟果、根、莖葉正丁醇提取物溶于水，再過AB-8大孔吸附樹脂柱(50 cm × 2 cm)，先用純水洗去雜質(zhì)，然后用70%乙醇洗脫，所得洗脫液減壓濃縮后置于烘箱烘干即得純化品。

1.3 總皂苷含量的測定采用香草醛-冰醋酸法測定皂苷含量。將制備的香草醛-冰醋酸溶液(5 mg/mL)和齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.2 mg/mL)、赤瓟根、果、葉正丁醇提取物溶解于甲醇中，制備約5 mg/mL的樣品溶液。加入高氯酸后，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和香草醛-冰醋酸溶液在70 ℃下水浴15 min，冷卻5 min，再加入冰醋酸搖勻靜置10 min后測定A540 nm，繪制齊墩果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。將樣品溶液反應(yīng)后得到的A540 nm代入線性回歸方程，并計算出其總皂苷含量。

1.4 動物的分組與模型的建立ICR雄性小鼠42只，重25～30 g(中國杭州浙江實(shí)驗(yàn)動物中心)，飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境條件下(溫度24 ℃±2 ℃，75%濕度和12 h光-暗循環(huán))，自由進(jìn)食和飲水。適應(yīng)環(huán)境7 d后，將小鼠隨機(jī)分為7組，分別為正常對照組、純藥組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性組。灌胃劑量見表1。

表1 小鼠灌胃劑量

除正常對照組和純藥組小鼠外，其余各組均每天灌胃一次酒精，30 min后灌胃不同濃度赤瓟皂苷溶液或保肝片。試驗(yàn)周期為28 d，記錄小鼠死亡率和身體狀況(體重、活動、飲食狀況)。

1.5 樣本收集最后一次灌胃給藥后禁食24 h，所有小鼠解剖前稱重并記錄體重，采血入肝素管，3 000 r/min離心10 min，分離血清，-80 ℃保存用于進(jìn)一步分析?？焖偾谐暾母谓M織，然后拍照，稱肝臟，計算肝體重比。部分肝組織固定在4%磷酸鹽緩沖多聚甲醛中進(jìn)行組織學(xué)分析，4 ℃保存。其他部分肝組織儲存在-80 ℃下，以供后續(xù)分析，冷凍前用生理鹽水洗滌。

1.6 組織學(xué)分析采用HE染色法觀察肝組織學(xué)變化。為了評估其病理變化，在400×的放大倍數(shù)下檢查染色切片。

1.7 血清生化標(biāo)志物的測定分析與肝損傷相關(guān)的血清生化指標(biāo)(ALT、AST)，以評估肝損傷程度。 采用試劑盒檢測血清ALT和AST活性，觀察赤瓟提取物對酒精性肝損傷的影響。

1.8 肝組織和血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定稱取適量-80 ℃保存的肝組織樣品，在4 ℃下用磷酸鹽緩沖液勻漿，制備10%肝臟勻漿。 隨后4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，收集上清液，測定ROS水平、MDA水平、SOD、MPO和CAT活性、GSH含量。

1.9 統(tǒng)計分析使用Graph-Pad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，然后采用紐曼-科伊爾斯檢驗(yàn)。 以P<0.05表示組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 根、果、葉中赤瓟皂苷的含量根據(jù)齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程(圖1)，赤瓟不同部位皂苷含量分別為果實(shí)(14.95±1.52)%、莖葉(9.76±0.68)%、根(6.77±1.21)%，赤瓟果實(shí)皂苷含量最高。

圖1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of oleanolic acid

2.2 赤瓟皂苷對酒精性肝損傷小鼠死亡率的影響在赤瓟皂苷對酒精性肝損傷的試驗(yàn)中，記錄了小鼠連續(xù)28 d的存活率，由圖2可知，正常對照組均存活，模型組均在28 d內(nèi)全部死亡。與模型組死亡率100%相比，赤瓟給藥組(0.15、0.30、0.60 g/kg)的28 d死亡率分別為50.0%、66.7%和33.3%。正常對照組和純藥組的所有小鼠均存活，說明中劑量(0.30 g/kg)赤瓟提取物無明顯的毒副作用。這些結(jié)果表明3組不同濃度的赤瓟皂苷顯著降低小鼠的死亡率，且不同濃度赤瓟組(低、中、高劑量組)的表現(xiàn)均優(yōu)于陽性組，其中中劑量(0.30 g/kg)赤瓟皂苷提高小鼠生存率效果最佳。

圖2 赤瓟皂苷對酒精性肝損傷小鼠生存量的影響Fig.2 Effect of TD on survival quality of mice with alcoholic liver injury

2.3 赤瓟皂苷對酒精性肝損傷小鼠體重的影響在試驗(yàn)期間，每4 d記錄一次小鼠的體重。在最后1 d，測量肝臟重量和體重，并計算肝臟體重比。由圖3可知，正常對照組的體重隨試驗(yàn)天數(shù)的增加而略有增加。模型組小鼠體重在短時間增加(前4 d)后逐漸下降，原因可能是前期酒精對于小鼠肝臟的損傷未體現(xiàn)時，小鼠正常進(jìn)食，體重增加，酒精開始損傷肝臟，小鼠病理表現(xiàn)為食欲匱乏，致使小鼠消瘦。對比發(fā)現(xiàn)純藥組的體重變化與正常對照組相近，說明純赤瓟皂苷對小鼠體重?zé)o明顯影響。由圖3可知，排除急性死亡小鼠的影響，不同濃度赤瓟皂苷組小鼠體重隨試驗(yàn)天數(shù)的增加有一定波動，但都較陽性組平穩(wěn)，表明赤瓟皂苷能較好地控制酒精肝損傷小鼠體重，其中赤瓟皂苷中劑量組在控制小鼠體重效果最佳。

圖3 赤瓟皂苷對酒精性肝損傷小鼠體重的影響Fig.3 Effects of TD on body weight of mice with alcoholic liver injury

2.4 赤瓟皂苷對酒精性肝損傷小鼠肝體比的影響該研究通過肝體比分析肝臟水腫情況，小鼠肝體比分別為正常對照組4.35±0.33、純藥組4.32±0.41、模型組5.16±0.27、低劑量組4.70±0.18、中劑量組4.29±0.35、高劑量組4.34±0.26、陽性組4.92±0.22，由此可知，模型組小鼠的肝體比高于正常對照組，且增幅大于其他組，推測模型組小鼠肝臟損傷情況最嚴(yán)重，肝腫大明顯。其中，中劑量組和高劑量組小鼠的肝體比與正常對照組相近，說明中劑量和高劑量能降低酒精性肝損傷引起水腫，從而起到保護(hù)肝臟的效果。

2.5 赤瓟皂苷對酒精性肝損傷小鼠肝臟組織病理學(xué)特征的影響該研究通過HE染色，進(jìn)一步了解肝組織損傷情況，觀察圖4可得，模型組小鼠的肝細(xì)胞明顯增大、分布散亂，胞漿稀疏，出現(xiàn)脂肪變性和肝細(xì)胞大面積壞死情況；肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞損傷嚴(yán)重。與模型組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽性組肝細(xì)胞病理損傷有所改善，肝細(xì)胞分布更均勻，肝細(xì)胞腫脹程度減少；脂滴空泡數(shù)量和肝細(xì)胞壞死數(shù)量減少；其中，中劑量組的治療效果最好。模型組中肝細(xì)胞病變較多，肝組織損傷最為嚴(yán)重。低劑量組和高劑量組視野內(nèi)病變肝細(xì)胞較少，中劑量組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞損傷狀況明顯改善，壞死細(xì)胞減少顯著，結(jié)構(gòu)完整，接近正常組。這表明赤瓟皂苷可以顯著改善肝組織的病理學(xué)損傷，保護(hù)肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。

圖4 赤瓟皂苷對酒精性肝損傷試驗(yàn)HE染色后的肝組織(20×)Fig.4 Liver tissue stained by HE staining with TD in alcoholic liver injury test

2.6 赤瓟皂苷可降低血清和肝組織中的ALT和AST的水平AST和ALT是肝臟中的特異性轉(zhuǎn)氨酶，常用于判斷是否肝損傷。臨床診斷通常使用血清AST/ALT的指標(biāo)來判斷肝損傷的程度，當(dāng)AST/ALT值有大幅度變化，則說明肝細(xì)胞受到的損傷程度嚴(yán)重。為研究赤瓟皂苷對酒精性肝損傷的影響，檢測了血清和肝臟中ALT和AST活性，觀察圖5可知，與正常對照組相比，模型組小鼠中血清AST、ALT和AST/ALT水平顯著升高，而與模型組相比，赤瓟治療組中這些指標(biāo)降低。在肝組織中，與正常對照組相比，模型組的ALT、AST水平明顯降低；與模型組相比，各赤瓟給藥組均顯著升高；其中，中劑量組的治療效果與陽性組升高最為明顯。這表明赤瓟皂苷可改善酒精誘導(dǎo)的小鼠肝損傷癥狀，并具有明顯的肝保護(hù)作用。

注：與正常對照組比較，*P< 0.05；與模型組比較，#P< 0.05Note：Compared with normal control group，* P < 0.05；Compared with model group，# P< 0.05圖5 赤瓟皂苷對酒精性肝損傷小鼠血清和肝臟中ALT、AST和AST/ALT的影響Fig.5 Effects of TD on ALT，AST and AST/ALT in serum and liver of mice with alcoholic liver injury

2.7 赤瓟皂苷對血清和肝臟中氧化應(yīng)激標(biāo)志物的影響該研究測定了血清中MDA和GSH的濃度以及肝臟組織中MDA、GSH、SOD、CAT、MPO和ROS的活性，并評價了赤瓟皂苷的抗氧化效果。由圖6結(jié)果表明，與模型組相比，赤瓟皂苷通過提高血清及肝臟中GSH，降低MDA的水平，從而清除體內(nèi)過多的自由基，提高抗氧化能力，其中，中劑量赤瓟給藥組效果最佳。

注：與正常對照組比較，*P< 0.05；與模型組比較，#P< 0.05Note：Compared with normal control group，* P < 0.05；Compared with model group，# P< 0.05圖6 赤瓟皂苷對酒精性肝損傷小鼠血清及肝臟中MDA和GSH水平的影響Fig.6 Effects of TD on MDA and GSH in serum and liver of mice with alcoholic liver injury

該研究又對MPO、ROS、SOD和CAT進(jìn)行了活性評估，MPO被認(rèn)為是氧化應(yīng)激和炎癥的標(biāo)志物。由圖7可知，與模型組相比，赤瓟皂苷能夠降低小鼠肝組織中ROS和MPO的含量，顯著升高 SOD和CAT水平，減輕機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而起到保護(hù)肝臟的作用，其中中劑量赤瓟給藥組效果最佳。

注：與正常對照組比較，*P< 0.05；與模型組比較，#P< 0.05Note：Compared with normal control group，* P < 0.05；Compared with model group，# P< 0.05圖7 赤瓟皂苷對酒精性肝損傷小鼠肝臟中MPO、ROS、SOD和CAT水平的影響Fig.7 Effects of TD on the levels of MPO，ROS，SOD and CAT in liver of mice with alcoholic liver injury

3 討論與結(jié)論

赤瓟作為一種廣泛分布的中藥，用藥歷史悠久。該試驗(yàn)通過乙醇提取法，然后萃取純化得到赤瓟皂苷。通過建立酒精性肝損傷動物模型來評價赤瓟皂苷對酒精性肝損傷動物模型的保護(hù)作用。該研究證明了赤瓟皂苷對酒精性肝損傷有一定的治療作用。赤瓟皂苷可減少肝細(xì)胞的病理損傷，降低肝指數(shù)，維持小鼠體重的穩(wěn)定，降低酒精性肝小鼠的死亡率。赤瓟皂苷抑制酒精性肝損傷引起的血清AST和ALT水平的升高，降低AST/ALT的水平，提高肝組織中AST和ALT的水平，從而達(dá)到保護(hù)肝臟的目的。在氧化應(yīng)激指數(shù)的測定中，赤瓟皂苷可以抑制肝組織中ROS、MDA和MPO的產(chǎn)生，減少SOD、CAT、GSH等抗氧化酶的消耗，這表明赤瓟皂苷可降低酒精誘導(dǎo)肝損傷后肝臟氧化應(yīng)激損傷的程度。赤瓟皂苷具有良好的抗氧化能力，具有明顯的護(hù)肝降酶的作用，其保護(hù)機(jī)制可能與其抗氧化應(yīng)激有關(guān)。

李亞洲等[14]研究發(fā)現(xiàn)赤瓟皂苷可以明顯提高子宮內(nèi)膜炎繼發(fā)痛經(jīng)模型大鼠子宮組織中 SOD 和 GSH-Px 酶活性，減少自由基及其降解產(chǎn)物 MDA 的含量，消除機(jī)體內(nèi)的過氧化氫及脂質(zhì)過氧化物。Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn)赤瓟通過抗氧化機(jī)制減輕大鼠類風(fēng)濕炎癥程度，減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎反應(yīng)中ROS和MDA的過量產(chǎn)生。中藥的皂苷成分大多都具有明顯的抗氧化作用，吳春福等[15]研究發(fā)現(xiàn)人參莖葉皂苷連續(xù)給藥 15 d，可增加小鼠紅細(xì)胞中 SOD 含量，激活紅細(xì)胞中 CAT活性，表明人參皂苷具有較強(qiáng)的抗氧化作用。朱紹興等[16]研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷對于家兔腎缺血再灌注損傷模型，可減低血清 MDA 含量，增強(qiáng) SOD 活性，并降低腎組織 Ca2+含量，表明三七總皂苷可通過抗氧化，抑制 Ca2+內(nèi)流保護(hù)腎缺血再灌注損傷 。王銀萍等[17]研究發(fā)現(xiàn)大豆皂苷可以提高糖尿病小鼠中SOD含量，表明其有脂質(zhì)抗氧化作用。該研究中發(fā)現(xiàn)赤瓟皂苷也有類似的抗氧化作用。

于曉敏等[18]研究發(fā)現(xiàn)赤瓟根總皂苷對多種急、慢性炎癥均能抑制。陳建雙等[19-20]研究發(fā)現(xiàn)赤瓟根總皂苷的抗炎能力與抑炎介質(zhì)PGE2和 NO的合成與釋放有關(guān)，并且赤瓟根總皂苷對佐劑性關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)鼠的療效與脾臟T細(xì)胞的增殖和腹組織細(xì)胞 IL-1β、TNF-α的合成有關(guān)。馬帥等[21-22]研究表明赤瓟根總皂苷對AA大鼠具有治療效果，其機(jī)制與TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-6mRNA的表達(dá)有關(guān)，并且中高劑量組的抑制作用會更強(qiáng)。岳斌等[23]研究發(fā)現(xiàn)酒精性肝損傷能夠顯著提高炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)。所以，后期試驗(yàn)可以考慮探究赤瓟皂苷治療酒精性肝損傷的抗炎機(jī)理。

赤瓟還具有抗癌、抗菌、解熱、改善血液流變學(xué)、降糖、提高免疫功能等作用。Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)赤雹根乙醇提取物對大鼠乳腺增生引起的雌孕激素降低有抑制作用，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和免疫功能來平衡體內(nèi)激素水平，從而抑制乳腺的病理性增生。徐博等[24]研究發(fā)現(xiàn)過量的酒精攝入會導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生凋亡，所以，后期試驗(yàn)也可考慮探究赤瓟皂苷治療酒精性肝損傷的抗凋亡及提高機(jī)體免疫機(jī)制。

另外該研究提取的皂苷含量與其他文獻(xiàn)的皂苷含量相比較低，分析其原因可能與粉碎度、提取溫度、濃度差、提取時間等因素有關(guān)，有待后期進(jìn)一步改良。研究中發(fā)現(xiàn)高濃度組的死亡率較高，其原因可能是濃度過高增加毒性反應(yīng)或者萃取時殘留些許石油醚或正丁醇。

綜上，該研究利用乙醇提取法成功提取出赤瓟皂苷，主要針對赤瓟皂苷對酒精性肝損傷的作用進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)其可通過抗氧化治療酒精性肝損傷，但并未對其作用機(jī)制進(jìn)行深入探討，后續(xù)可進(jìn)一步研究赤瓟皂苷對酒精性肝損傷的作用機(jī)制，并對其具體的劑量進(jìn)行探討。該研究為中藥治療酒精肝損傷提供了試驗(yàn)依據(jù)，赤瓟未來有可能成為治療酒精性肝損傷的潛在藥物。