劉楊，張春玲，肖旭，由春香，王小非

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家蘋果工程技術(shù)研究中心，山東泰安 271018)

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)系統(tǒng)，因其高效、精確和便捷性，被廣泛應(yīng)用于植物基因組基因編輯。CRISPR/Cas9(CRISPR-associated 9)系統(tǒng)已在多種園藝植物中開展研究，例如柑桔[1]、番茄[2]、黃瓜[3]、蘋果[4, 5]、葡萄[5, 6]、獼猴桃[7]和山藥[8]等。CRISPR/Cpf1(CRISPR fromPrevotellaandFrancisella1)是CRISPR/Cas9系統(tǒng)的一類衍生體，AsCpf1(Acidaminococcussp. BV3L6)、FnCpf1(Francisellatularensissubsp.novicidainU112)以及LbCpf1((Lachnospiraceae bacterium ND2006)是常用的三種Cpf1蛋白[9-11]。相對于Cas9對5’-NGG-3’ PAM(Protospacer adjacent motif)序列的偏好性，CRISPR/Cpf1傾向于富含T堿基的PAM序列并在PAM序列遠(yuǎn)端造成雙鏈斷裂，形成粘性末端缺口，具有突變效率高、多基因編輯元件構(gòu)建更簡易且脫靶率更低等優(yōu)勢，極大拓展了CRISPR/Cas系統(tǒng)應(yīng)用范圍[12, 13]。CRISPR/Cpf1已在水稻[14]、煙草[15]、柑桔[16]以及楊樹[17]等植物中實(shí)現(xiàn)基因編輯，但蘋果(Malus×domestic)中的成功應(yīng)用報(bào)道較少。

相對于蘋果組培苗，轉(zhuǎn)基因愈傷組織更容易獲得，是驗(yàn)證基因編輯工具效率以及基因功能的有效工具。實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子MdMYB1(MDP0000259614)基因正調(diào)控花青苷合成途徑，其突變體使王林愈傷組織花青苷積累受阻[18, 19]。因此，筆者以MdMYB1基因作為靶點(diǎn)，構(gòu)建雙靶點(diǎn)的CRISPR/LbCpf1載體并轉(zhuǎn)入王林愈傷組織，分析基因編輯效率，以期在蘋果愈傷組織中建立高效的基因編輯體系，進(jìn)而為蘋果分子育種研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

王林蘋果(Orin)愈傷由實(shí)驗(yàn)室保存，于1.5 mg/L 2,4-D和0.4 mg/L 6-BA的MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。25 ℃溫室中黑暗條件放置，每15 d繼代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因愈傷在含有30 mg/L潮霉素的繼代培養(yǎng)基上每15 d繼代培養(yǎng)。

1.2 靶點(diǎn)選擇

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期MDP0000259614的序列在CRISPR-P 2.0網(wǎng)站(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)進(jìn)行查詢，選擇評分低，即預(yù)測脫靶率低，GC含量在40%～60%，長度為22～24 bp，PAM序列為5’-NTTT-3’，位置位于編碼序列區(qū)的靶點(diǎn)1(Target1)(5’-CCTCTCCATGAATCTCAACGCACT-3’)與靶點(diǎn)2(Target2)(5’-GGGCTGAGGTCTTATCACATTGGT-3’)，序列在基因組位置見圖1。

圖1 MdMYB1基因的靶點(diǎn)位置示意圖

1.3 載體構(gòu)建

CRISPR/LbCpf1多基因編輯載體由朱健康團(tuán)隊(duì)贈送[20]。根據(jù)載體圖譜，利用SnapGene軟件進(jìn)行載體設(shè)計(jì)，將包含BsaI酶切位點(diǎn)、靶點(diǎn)序列以及crRNA的基因片段通過設(shè)計(jì)長片段引物L(fēng)bTarget1-F/LbTarget2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將目的大小的單一明亮條帶進(jìn)行膠回收，膠回收具體方法參見DNA膠回收試劑盒(諾唯贊，南京)。將載體與片段進(jìn)行BsaI(New England Biolabs)雙酶切，反應(yīng)體系為50 μL，包含5 μL的10× NEB Buffer、1 μg DNA以及1 μL的BsaI酶，反應(yīng)時間為1 h，進(jìn)行凝膠電泳后回收。最后通過T4連接酶(Takara，大連)將載體與插入片段連接，流程見圖2。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans 5α(全式金，北京)，利用相應(yīng)引物U6-F/Cpf1-R的PCR反應(yīng)鑒定出陽性菌落，獲得MdMYB1雙靶點(diǎn)CRISPR/Cpf1基因編輯載體——MYB1-LbCpf1。

圖2 載體構(gòu)建流程圖

表1 所用引物

1.4 王林愈傷侵染

載體轉(zhuǎn)化EHA105農(nóng)桿菌(全式金，北京)，陽性菌落于50 mg/L卡那霉素與10 mg/L利福平LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=1.0。5 000 rpm收集菌體并用滅菌ddH2O重懸至OD600=0.8。將15 d長勢良好的王林愈傷組織壓碎浸泡于上述重懸液中，室溫下避光振蕩15 min，撈出并于濾紙上吸干懸浮液，鋪至無抗生素的愈傷培養(yǎng)基。將24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2 d的愈傷組織取出，均勻平鋪于含有30 mg/L潮霉素和250 mg/L頭孢霉素的愈傷組織培養(yǎng)基中，恒溫箱中暗培養(yǎng)30～45 d，將新生的陽性愈傷組織繼代在含抗生素培養(yǎng)基中，待3～4輪后取樣提取DNA，利用引物進(jìn)行鑒定。轉(zhuǎn)基因率(%)=轉(zhuǎn)基因愈傷株系/陽性愈傷株系×100。

1.5 基因編輯事件檢測

對Target1與Target2 DNA區(qū)域分別設(shè)計(jì)引物MdMYB1-F/R與MdMYB1-F1/R1。試劑盒(康為世紀(jì)，北京)法提取陽性愈傷組織DNA，利用Phanta EVO高保真DNA聚合酶(諾唯贊，南京)對包含相應(yīng)靶點(diǎn)的DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL，包含5× EVO Buffer 10 μL、dNTP Mix 1 μL、10 μM引物各1 μL、愈傷組織DNA 100 ng以及1 μL酶，通過95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，32個循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃保溫。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳觀察，回收純化，連接至克隆載體pEASY?-Blunt Simple Cloning Kit(全式金，北京)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans 5α。每個株系挑選8個陽性菌落，送至青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，利用SnapGene軟件進(jìn)行序列比對并統(tǒng)計(jì)?；蚓庉嬓?%)= 基因編輯事件發(fā)生愈傷株系/總轉(zhuǎn)基因株系×100。

1.6 花青苷積累試驗(yàn)

將15 d生長狀態(tài)一致的野生型與轉(zhuǎn)基因愈傷組織鋪在不含氮的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)10 d，移至強(qiáng)光低溫培養(yǎng)箱(光子通量密度約為100 μmol/s·m2，溫度為19 ℃)中培養(yǎng)，觀察著色情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因愈傷的獲得與鑒定

將圖2中載體轉(zhuǎn)入王林蘋果愈傷組織中，35 d后篩選培養(yǎng)基中有明顯新生的愈傷組織，抗性培養(yǎng)基中繼代3次獲得陽性株系，其中MYB1-LbCpf1載體共獲得10個株系，命名為LbCpf1-T1-T2#1至#10。將繼代3次的愈傷組織提取DNA，利用潮霉素標(biāo)簽引物進(jìn)行PCR檢測T-DNA插入情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型愈傷(WL)中出現(xiàn)假陽性條帶。于是利用U6-F/Cpf1-R引物檢測，結(jié)果如圖3所示，雖然WL中有雜帶產(chǎn)生，但與陽性對照可顯著區(qū)分，10個MYB1-LbCpf1陽性愈傷組織中有9個含有T-DNA插入?yún)^(qū)段，表明MYB1-LbCpf1載體的T-DNA片段成功插入轉(zhuǎn)基因愈傷基因組中。

2.2 基因編輯事件檢測

提取轉(zhuǎn)基因愈傷組織DNA，利用Target1和Target2區(qū)域?qū)?yīng)引物進(jìn)行擴(kuò)增，將目的片段連接克隆載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，每個株系的每個靶點(diǎn)挑取陽性單克隆8個送至測序。測序結(jié)果表明，9個轉(zhuǎn)基因植株中共有2個株系發(fā)生Target1位置的突變，突變效率為22.2%，共有3個株系發(fā)生Target2位置的突變，突變效率為33.3%，由于#3在兩靶點(diǎn)均發(fā)生突變，因此CRISPR/Cpf1雙靶點(diǎn)載體造成的總突變率為44.4%(表2)。在發(fā)生基因編輯事件的株系送測的所有克隆中，Target1有4個克隆序列發(fā)生突變，占16個克隆的25%；Target2有16個克隆發(fā)生突變，占25個克隆的64%。Target1的4個突變類型中，3/4為小片段缺失型突變，缺失堿基數(shù)為1 bp、5 bp和7 bp，發(fā)生突變株系為#1與#3，1/4為7 bp的替換型突變，發(fā)生株系為#3，其中#3發(fā)生突變頻率最高。而Target2的16個突變類型中，13/16為2～10 bp的小片段缺失型突變，發(fā)生株系為#2、#3與#5；1/8為20 bp與94 bp的大片段缺失型突變，發(fā)生株系為#3與#5；1/16為2 bp的替換型突變，發(fā)生株系為#2。上述Target2所有突變類型中，#2發(fā)生頻次最高，而#3次之(圖4)。以上結(jié)果表明，本研究中CRISPR/Cpf1引導(dǎo)的雙靶點(diǎn)基因編輯在Target2位置有更高的效率。

圖3 陽性愈傷組織獲得以及T-DNA插入片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

表2 CRISPR/LbCpf1在王林愈傷中的靶點(diǎn)突變率

2.3 CRISPR/Cpf1引導(dǎo)的基因編輯特征分析

統(tǒng)計(jì)Target2發(fā)生的所有基因編輯事件，分析所有的突變類型發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cpf1在蘋果基因組中引導(dǎo)的堿基刪除事件中，7 bp的小片段刪除為發(fā)生頻率最高的事件(25%)，8 bp的刪除次之(18.8%)，而9 bp與2 bp的刪除發(fā)生頻率相仿(12.5%)，以上高頻率的堿基刪除事件占比68.8%。較大片段(>20 bp)刪除的事件發(fā)生頻率較低，為6.3%。分析發(fā)生突變事件的堿基位置發(fā)現(xiàn)，距PAM序列14～22 bp的堿基發(fā)生突變頻率(6.38%～10.64%)高，發(fā)生突變頻率(10.64%)最高的位置距離PAM序列17 bp。而PAM序列附近發(fā)生突變頻率(0.71%)最低(圖5)。以上結(jié)果說明，本研究中CRISPR/Cpf1系統(tǒng)在蘋果基因組中傾向于引導(dǎo)小片段堿基刪除，堿基突變位置多于PAM序列遠(yuǎn)端14～22 bp位置。

圖4 CRISPR/LbCpf1在蘋果愈傷組織基因組不同靶點(diǎn)位置的編輯事件統(tǒng)計(jì)

圖5 CRISPR/LbCpf1在蘋果愈傷組織中的基因編輯特征分析

2.4 MdMYB1基因編輯愈傷的表型驗(yàn)證

為證實(shí)利用CRISPR/Cpf1基因編輯愈傷進(jìn)行功能研究的可行性，選定生長狀態(tài)一致的野生型與發(fā)生基因編輯事件頻率較高(#2、#3和#5)的愈傷組織進(jìn)行花青苷積累試驗(yàn)。結(jié)果表明，經(jīng)過12 d的不含氮誘導(dǎo)以及低溫培養(yǎng)，野生型王林愈傷組織已經(jīng)有少量著色，但3個基因編輯愈傷都沒有著色(圖6)。限于王林愈傷組織的遺傳型特征，經(jīng)過12 d加7 d的花青苷誘導(dǎo)處理后沒有更多花青苷形成，而基因編輯愈傷花青苷積累量始終沒有積累花青苷(圖中未展示)。以上結(jié)果說明，MdMYB1的CRISPR/Cpf1基因編輯愈傷抑制花青苷積累。

圖6 基因編輯愈傷花青苷積累試驗(yàn)

3 小結(jié)與討論

為實(shí)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的多基因編輯，多轉(zhuǎn)錄單元提供了解決思路，但多個啟動子與sgRNA的組合使得載體長度過大且構(gòu)建過程繁瑣[7, 21, 22]。而由于CRISPR/Cpf1所需sgRNA長度較短，且Cpf1蛋白的RNA酶活性可將單個sgRNA從串聯(lián)的CRISPR RNA中釋放，因此CRISPR/Cpf1的多基因編輯體系相對于CRISPR/Cas9系統(tǒng)更高效，組裝更簡便[15]。本研究所用多基因編輯CRISPR/Cpf1載體構(gòu)建簡易，sgRNA支架僅19 bp，通過串聯(lián)sgRNA支架與sgRNA即可構(gòu)建出單轉(zhuǎn)錄單元的多基因編輯表達(dá)盒，可極大降低蘋果中多基因編輯的成本。蘋果愈傷組織轉(zhuǎn)化效率較高，獲得轉(zhuǎn)基因愈傷周期短，適于對基因編輯載體效率以及基因功能的驗(yàn)證。本研究在較短時間內(nèi)獲得轉(zhuǎn)基因愈傷，轉(zhuǎn)化率約90%，較高的轉(zhuǎn)化率使CRISPR/Cpf1的基因編輯效率(44%)也較高，說明蘋果愈傷是驗(yàn)證基因編輯效率的高效工具。基因編輯愈傷表現(xiàn)出MdMYB1突變體的性狀，說明利用CRISPR/Cpf1體系對基因進(jìn)行功能研究是可行的。

在MdMYB1基因的編碼區(qū)分別設(shè)計(jì)了兩個靶點(diǎn)，兩靶點(diǎn)距離較遠(yuǎn)，設(shè)計(jì)一對引物無法有效地?cái)U(kuò)增以檢測突變情況。因此不能排除Cpf1蛋白在兩靶點(diǎn)上共同發(fā)揮功能的情況，測序結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)自靶點(diǎn)1后信號混亂，以及無法讀出的情況，或許能說明兩靶點(diǎn)間發(fā)生大片段刪除事件。靶點(diǎn)2相對靶點(diǎn)1有著更高的突變率(33.3% >22.2%)，說明靶點(diǎn)2的sgRNA對于靶標(biāo)基因有著更高的結(jié)合效率，而靶點(diǎn)2中出現(xiàn)較高頻率的小片段刪除也說明sgRNA的高結(jié)合率使Cpf1蛋白在靶點(diǎn)2位置有著更高的切割效率。sgRNA選擇影響CRISPR/Cas系統(tǒng)效率[23]。而靶點(diǎn)1 sgRNA 3’端較高的GC含量可能是其相對較低的突變率的原因之一[24]。因此，對于蘋果中基因編輯高效的靶點(diǎn)的選擇應(yīng)同時結(jié)合軟件篩選以及轉(zhuǎn)化愈傷組織驗(yàn)證。統(tǒng)計(jì)所有株系的突變類型發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cpf1傾向于7～9 bp的小片段刪除，且突變位置集中在PAM序列遠(yuǎn)端的14～22 bp，符合典型的CRISPR/LbCpf1體系的基因編輯特征[9, 25]。發(fā)生突變的幾個株系中出現(xiàn)了較多類型的突變情況，說明在繼代過程中，Cpf1可能持續(xù)發(fā)揮功能對靶點(diǎn)進(jìn)行切割。鑒于愈傷組織可能為單細(xì)胞或多細(xì)胞起源，所以基因編輯愈傷可能為雜合體或純合體，因此呈現(xiàn)了多種的突變類型。如何獲得單細(xì)胞起源的純合體基因編輯愈傷是亟待解決的問題。

基因編輯效率受多種因素影響，包括Cas蛋白、載體遞送效率以及基因編輯元件的表達(dá)效率[26, 27]。通過優(yōu)化載體中基因編輯元件的啟動子可以提高基因編輯效率[28]，蘋果中通過應(yīng)用MdU3啟動子顯著提高M(jìn)dPDS基因的編輯效率[29]。因此，為提高CRISPR/Cpf1載體的效率，可將sgRNA啟動子替換為蘋果MdU6/MdU3啟動子。sgRNAs的GC含量高于50%有相對較高的編輯效率[21]，葡萄中發(fā)現(xiàn)GC含量高于60%時顯著提高基因編輯效率。通過挑選較高GC含量的sgRNAs也是提高CRISPR/Cpf1載體的舉措之一。