戴家木，聶 渡，李素英，張 瑜，張 偉，劉 蓉

(南通大學(xué) 紡織服裝學(xué)院，江蘇 南通 226019)

周圍神經(jīng)損傷(PNI)是一類難以治療的常見疾病，可引起感覺和運(yùn)動障礙，發(fā)達(dá)國家每年發(fā)病率每10萬人中約有13～23人[1]。盡管范圍較小的損傷(<5 mm)能夠依靠自身恢復(fù)能力實現(xiàn)再生，但依然會出現(xiàn)一定程度的功能缺陷和障礙。此外，較嚴(yán)重的PNI損傷無法自我再生，特別是粗神經(jīng)的遠(yuǎn)距離缺損，需要通過移植體進(jìn)行修復(fù)[2]。

自體神經(jīng)移植一直是神經(jīng)修復(fù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其避免了自體免疫的問題，但在取材來源和數(shù)量上存在較大的弊端，且達(dá)到功能完全修復(fù)的概率很低，僅約50%的患者在自體神經(jīng)移植后能夠恢復(fù)4級肌力和感覺功能[3]。同種異體移植解決了取材方面的難點，但需要進(jìn)行一定的免疫處理后才可使用，因此，需要結(jié)合不同的策略來促進(jìn)神經(jīng)愈合[4]，而人工神經(jīng)支架(NGC)有望作為人工植入材料替代神經(jīng)自體移植物，在周圍神經(jīng)損傷后進(jìn)行組織修復(fù)。

目前，人工神經(jīng)導(dǎo)管材料的種類較為豐富，包括海綿[5]、水凝膠、微球及纖維。其中，纖維基神經(jīng)導(dǎo)管具有力學(xué)性能強(qiáng)、柔韌性好、定制性高等優(yōu)勢，在該領(lǐng)域一直是熱門的研究對象。本文主要從基材種類、制備方法、結(jié)構(gòu)設(shè)計、功能化改性和細(xì)胞培養(yǎng)等方面對NGC進(jìn)行介紹，并展望了纖維基人工神經(jīng)導(dǎo)管的發(fā)展前景。

1 基材種類

組織工程支架在制備和應(yīng)用方面需要考慮到較多重要因素，從基材選擇角度來說，需要其具有合適的生物相容性、生物降解性和力學(xué)性能等。根據(jù)材料來源，可分為天然聚合物和合成聚合物，前者包括殼聚糖(CS)[6-7]、纖維素[8-9]、蛋白[10-13]、多肽[14]等，后者包括聚乳酸(PLA)[15]、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(PLGA)[16]、ε-聚己內(nèi)脂(PCL)[17-18]、聚乳酸-聚己內(nèi)脂共聚物(PLCL)[19]等可降解材料，以及聚對苯二甲酸乙二醇酯(PEOT)[20]等不可降解材料。一般來說，天然聚合物相較于合成聚合物具有較好的細(xì)胞親和力，但力學(xué)性能在濕潤環(huán)境中相對較差，因此，在三維支架中以合成聚合物為主要原料的研究較多。

不同的材料具有不同的特性，當(dāng)以合成聚合物為主要原材料制備組織工程支架時，需要其具有適當(dāng)?shù)牧W(xué)性能和降解速率等。PCL較為柔軟，韌性較好，但降解速率很低；而PLA具有較高的力學(xué)強(qiáng)度，雖然降解速率相對于PCL較快，但在體內(nèi)完全降解仍需要較長時間；聚羥基乙酸(PGA)則因為降解速率過快而導(dǎo)致其在應(yīng)用方面嚴(yán)重受限。PLGA是PLA與PGA的共聚物，通過調(diào)控二者的比例能夠獲得較為適中的降解速率；類似地，PLCL是PLA與PCL的共聚物，通過調(diào)控共聚比例能夠得到更加合適的力學(xué)強(qiáng)度與柔韌性。除共聚物之外，不同合成材料之間的混合也能起到性能互補(bǔ)的作用，如PCL/PLA體系，提高PLA的比例能夠增強(qiáng)細(xì)胞黏附率和支架的力學(xué)強(qiáng)度[21]。除此之外，天然材料與合成材料的復(fù)合可改善支架對細(xì)胞黏附和增殖方面的能力，得到綜合性能優(yōu)異的支架材料，如CS-PLA接枝材料[22]、PLCL/絲素蛋白(SF)混合物[11,23]。

2 制備方法

神經(jīng)導(dǎo)管是一種柔軟的管狀物，采用聚合物纖維材料及其織物制備的人工神經(jīng)導(dǎo)管可滿足柔韌性方面的要求。通常情況下，纖維材料制備方法不同，所得到的纖維直徑也有區(qū)別，如使用靜電紡絲法制備納米級纖維[24-25]，熔融紡絲法等制備微米級纖維[8,22,26-27]，而對聚合物樣條進(jìn)行熱牽伸能夠得到毫米級纖維[28]。

微米級及毫米級纖維在力學(xué)性能上具有較高的優(yōu)勢，可提供足夠的拉伸和抗壓強(qiáng)度，作為植入體能較好地維持原有形態(tài)；但織物形式的導(dǎo)管具有較大的孔徑，可導(dǎo)致導(dǎo)管內(nèi)部物質(zhì)泄露，盡管可通過提高織物密度來降低孔徑，但難以制備小尺寸的導(dǎo)管，且柔軟性也會隨之降低。納米級纖維具有更高的比表面積、孔隙率和更小的孔徑，且其外形可較好地模擬細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，利于細(xì)胞黏附和增殖[10]。另外，取向的納米纖維能夠順利誘導(dǎo)細(xì)胞沿著取向方向增殖和遷移，十分有利于神經(jīng)再生[19]。需要注意的是，除利用靜電紡絲法制備納米纖維外，也可通過帶有異種電荷的2種物質(zhì)進(jìn)行自組裝得到，但該方法較難獲得取向納米纖維[14]。同時，使用接觸紡的方法也能夠得到納米纖維，相較于高壓電場下制得的納米纖維，接觸紡納米纖維的結(jié)晶度和彈性模量明顯較高[29]。根據(jù)纖維直徑的不同，在人工神經(jīng)導(dǎo)管制備和結(jié)構(gòu)設(shè)計方面存在不同的思路，在材料功能化改性方面也具有不同的策略。

3 結(jié)構(gòu)設(shè)計

為適應(yīng)自體神經(jīng)導(dǎo)管的外形，人工神經(jīng)導(dǎo)管通常會被設(shè)計成具有相應(yīng)直徑的圓柱狀。同時，由于自體神經(jīng)纖維束由鞘層保護(hù)，因此，會進(jìn)一步將人工神經(jīng)導(dǎo)管設(shè)計成中空管道或?qū)嵭暮藲そY(jié)構(gòu)。其中，前者只有最外側(cè)的管狀外殼，后者是在前者的基礎(chǔ)上向管狀內(nèi)部填充水凝膠等材料。纖維基的外殼能夠提供較好的孔隙率，提高營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子的滲透能力；水凝膠可產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)微環(huán)境，改善軸突再生，并增強(qiáng)髓鞘再生和運(yùn)動功能恢復(fù)[6]。

除水凝膠外，實心導(dǎo)管的內(nèi)填充物還存在其他結(jié)構(gòu)物質(zhì)。Sun等[23]向中空導(dǎo)管中填充PLCL/SF三維納米纖維海綿(見圖1(a))，施萬細(xì)胞(SCs)可從兩端不斷向納米纖維海綿內(nèi)部增殖和滲透，從而成功橋接坐骨神經(jīng)缺損，其對周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)效果優(yōu)于中空導(dǎo)管。Huang等[12]首先使用模板法制備具有取向有序空腔的膠原蛋白(COL)/CS支架(見圖1(b))，之后在其外側(cè)沉積PCL納米纖維外殼用以防止成纖維細(xì)胞浸潤，填充支架可提供足夠的力學(xué)性能，保護(hù)再生軸突免受壓縮應(yīng)力，同時為再生神經(jīng)提供足夠的空間；體外和體內(nèi)研究表明，該復(fù)合支架可促進(jìn)軸突再生和SCs遷移，其功能恢復(fù)能力與自體移植相當(dāng)。Hou等[5]也使用了相似的策略制備了以PLGA為外殼，以氧化細(xì)菌纖維素(OBC)/COL多孔海綿為填充物的神經(jīng)導(dǎo)管，得到了相似的結(jié)論，其能夠模擬神經(jīng)內(nèi)部結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出比空心支架更好的修復(fù)效果。Singh等[30]通過二步法合成了具有良好彈性和韌性的抗氧化聚氨酯(PUAO)，并將其制備成取向納米纖維中空管道，在其中填充殼聚糖/明膠(CG)凍膠，并通過逐級冷凍的方法進(jìn)行制備，可誘導(dǎo)冰晶沿著一個方向進(jìn)行生長，最終獲得較為一致的孔道方向，更好地引導(dǎo)SCs沿軸向生長。

在中空導(dǎo)管的基礎(chǔ)上，其內(nèi)壁的結(jié)構(gòu)設(shè)計能夠?qū)?xì)胞生長規(guī)律和神經(jīng)再生效果產(chǎn)生一定的影響。Koppes等[31]采用纖維熱拉伸技術(shù)，設(shè)計出具有不同幾何形狀和芯層尺寸的中空管狀神經(jīng)支架(見圖1(c))，以孤立的整個背根神經(jīng)節(jié)作為體外模型系統(tǒng)和神經(jīng)再生研究對象，證明矩形凹槽通道能夠強(qiáng)烈影響SCs遷移，促使軸突取向，加速軸突的生長。

圖1 不同結(jié)構(gòu)的神經(jīng)導(dǎo)管支架材料的制備過程

纖維材料也能夠作為水凝膠增強(qiáng)材料來增強(qiáng)支架的神經(jīng)修復(fù)能力。Anarkoli等[16]將磁性PLGA納米纖維短纖添加到水凝膠前驅(qū)體中，短纖在磁場作用下取向排列，凝膠化后除去磁場得到的固定排列的纖維有助于形成水凝膠的各向異性結(jié)構(gòu)(見圖1(d))，與沒有纖維或具有隨機(jī)取向纖維的水凝膠相比，在該水凝膠中的成纖維細(xì)胞可單向生長，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)延伸生長。

4 功能化改性

為加速神經(jīng)組織的再生，對聚合物支架進(jìn)行功能化改性是十分有效的方法，目前研究較多的功能化方向主要包括導(dǎo)電處理、磁性處理、生長因子負(fù)載、信使核糖核酸(mRNA)負(fù)載以及其他活性物質(zhì)的復(fù)合等。

4.1 導(dǎo)電處理

電刺激能夠在一定程度上調(diào)控細(xì)胞行為并進(jìn)行功能化連接，因此，向支架中引入導(dǎo)電性良好的添加劑可加速神經(jīng)修復(fù)。Wang等[11]在柞蠶絲納米纖維表面包裹氧化石墨烯(GO)，并經(jīng)透明質(zhì)酸還原后得到表面導(dǎo)電性良好的支架(見圖2(a))，通過對其施加微電流可增強(qiáng)SCs增殖和遷移，提高PC12細(xì)胞的分化能力，且黏著斑激酶(FAK)的表達(dá)能力得到上調(diào)。Meng等[32]利用SF、還原氧化石墨烯(rGO)和聚苯胺(PANI)之間的氫鍵和靜電吸附，制備了高導(dǎo)電性絲編織復(fù)合支架，其在不同的物理應(yīng)力下具有良好的導(dǎo)電穩(wěn)定性。Taheri等[8]通過將導(dǎo)電二硫化鉬(MoS2)納米薄片摻入到普通棉紗線中，經(jīng)過鋰離子插層處理后，制備具有導(dǎo)電性能增強(qiáng)的神經(jīng)導(dǎo)管支架，其高滲透性使得液體能夠充分浸潤支架，神經(jīng)修復(fù)性能優(yōu)良。Jing等[33]將聚吡咯(PPy)聚合生長在單軸取向的PLGA納米纖維表面，獲得導(dǎo)電能力，并將其填充在NGC導(dǎo)管中，能夠在細(xì)胞之間傳遞自發(fā)的電刺激。除表面導(dǎo)電修飾之外，也可將導(dǎo)電試劑加入到紡絲溶液中來制備導(dǎo)電纖維，Zhang等[34]將碳納米管(CNT)加入到PCL紡絲溶液中制備具有導(dǎo)電能力的取向納米纖維，表現(xiàn)出穩(wěn)健的細(xì)胞誘導(dǎo)行為，可增強(qiáng)軸突再生能力。

圖2 不同功能化纖維基神經(jīng)導(dǎo)管的制備方法

4.2 磁性處理

具有磁性的納米材料可在外部磁場下誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞軸突的延伸，通過激活有絲分裂原激活蛋白激酶信號傳導(dǎo)的途徑來增強(qiáng)神經(jīng)軸突生長，并提高支架的力學(xué)性能。Chen等[35]將褪黑素和Fe3O4磁性納米顆粒引入到PCL納米纖維中，構(gòu)成穩(wěn)定的緩釋體系(見圖2(b))，同時提供適當(dāng)?shù)牧W(xué)性能，以及一定的抗氧化、抗炎性，促進(jìn)體內(nèi)再生坐骨神經(jīng)的形態(tài)、功能和電生理恢復(fù)。

4.3 生長因子負(fù)載

組織工程中會使用各類生長因子促進(jìn)組織再生，主要包括神經(jīng)生長因子(NGF)[22,36-37]、神經(jīng)營養(yǎng)素-3(NT-3)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)[6]、血小板衍生生長因子(PDGF)[38]中的一種或者多種[4,39]。Hong等[17]利用順序靜電紡絲制備了3層納米纖維支架，第1層為PCL取向纖維，用于細(xì)胞黏附并向坐骨神經(jīng)分化，第2、3層分別為降解速率不同的2種PLGA納米纖維，用作NT-3、BDNF、PDGF多重生長因子的緩釋載體(見圖2(c))。在對小鼠進(jìn)行坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)術(shù)后5周，其坐骨神經(jīng)指數(shù)和機(jī)械性異常性疼痛分析顯示，從第2層中快速釋放的NT-3和BDNF，以及從第3層中慢速釋放的PDGF可明顯加速神經(jīng)修復(fù)，且取向的PCL能夠提供細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的刺激，生成平行的坐骨神經(jīng)。

4.4 mRNA負(fù)載

mRNA能夠有效地調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)和細(xì)胞反應(yīng)，但由于其無法自行通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，因此，需要有效的非病毒傳遞平臺以及可直接從體外轉(zhuǎn)化為體內(nèi)的藥物篩選平臺[40]。Zhang等[18]使用PCL納米纖維作為底物來實現(xiàn)非病毒mRNA遞送，并將難以轉(zhuǎn)染的原代神經(jīng)元作為研究對象，結(jié)果表明，與常規(guī)推注遞送相比，無論神經(jīng)元的年齡和起源如何，該體系都可增強(qiáng)神經(jīng)元的基因沉默，且術(shù)后2周可觀察到良好的神經(jīng)再生現(xiàn)象，證明了纖維載體的潛力。一般情況下，生長因子的引入能夠提高細(xì)胞的mRNA的表達(dá)能力，而mRNA的引入則可直接產(chǎn)生作用，表達(dá)出對應(yīng)的蛋白類生長因子，因此，能夠起到相輔相成的協(xié)同作用。

4.5 其他活性成分復(fù)合

除上述生長因子及mRNA等添加成分之外，一些藥物在某些方面也具有促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的功能。如Jahromi等[15]以左旋聚乳酸(PLLA)/多壁碳納米管(MWCNT)納米纖維為外殼制備NGC，其管道中添加了SCs和姜黃素載藥微球，結(jié)果表明姜黃素的緩慢釋放可降低SCs的凋亡，同時MWCNT的加入能夠降低NGC的膨脹率，并提高其力學(xué)性能，修復(fù)效果與自體移植修復(fù)相似。Wu等[41]使用層粘連蛋白作為改性劑接枝在PLGA紗線/納米纖維支架上，可明顯提高SCs的增殖能力并誘導(dǎo)SCs的軸向遷移能力(見圖2(d))。Almansoori等[42]通過直流磁控濺射法將金屬鉭(Ta)鍍層在PLA納米纖維表面，可明顯提高SCs的活力和增殖能力，愈后無疤痕。

5 細(xì)胞培養(yǎng)

在組織再生速率方面，細(xì)胞在支架上的增殖方式起到了十分重要的作用。體外測試時多數(shù)情況下為靜態(tài)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)一定時間后，培養(yǎng)基中各種成分會出現(xiàn)分布不均等現(xiàn)象，這在一定程度上會降低細(xì)胞增殖速率。另外，不同種類的細(xì)胞具有不同的活性和功能，神經(jīng)再生方面最常用的為PC12細(xì)胞系和SCs。然而，由于SCs的可及性差，NGC上種子細(xì)胞的覆蓋不足，可能會導(dǎo)致神經(jīng)在長間隙中無法再生并無法完全恢復(fù)功能，因此，Zhou等[36]提出了骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)和旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS)，其保留生長因子的生物活性，并在體外實現(xiàn)持續(xù)釋放，在NGF和RCCS的幫助下，帶有種子BMSCs的NGC可以增強(qiáng)長神經(jīng)損傷間隙的周圍神經(jīng)再生。

由于細(xì)胞在支架上的增殖方式是逐步向外擴(kuò)張的，從導(dǎo)管兩端向內(nèi)的擴(kuò)張速率較慢，因此，通過改變細(xì)胞的接種位置也會對細(xì)胞的增殖和遷移模式產(chǎn)生影響。Sun等[43]利用空間受限的細(xì)胞分泌組法，將干細(xì)胞封裝在中央1/3內(nèi)的導(dǎo)管，可在術(shù)后6周內(nèi)表現(xiàn)出對SCs遷移的促進(jìn)作用，并在第16周時，大鼠表現(xiàn)出明顯運(yùn)動功能增強(qiáng)和軸突髓鞘形成。

6 結(jié)束語

人工神經(jīng)導(dǎo)管仍然是神經(jīng)再生治療的熱點研究領(lǐng)域，本文綜述了以纖維為基體的人工神經(jīng)導(dǎo)管發(fā)展現(xiàn)狀，主要包括基材種類、制備方法、結(jié)構(gòu)設(shè)計、功能化改性及細(xì)胞培養(yǎng)等，由于其高度可定制化的特性，能夠制備具有功能優(yōu)良且豐富的支架材料，提供神經(jīng)愈合速率，因此，在該領(lǐng)域具有十分重要的研究意義。

1)微米級及納米級纖維材料在人工神經(jīng)導(dǎo)管方面研究較為廣泛，通過不同的制備方法可獲得在一定性能方面有所提升的纖維材料，如：對纖維進(jìn)行改性后可賦予其一定的導(dǎo)電性，在電場下誘導(dǎo)細(xì)胞加速分化；通過生長因子的負(fù)載，加速細(xì)胞的增殖和分化能力。

2)從纖維種類方面來說，納米纖維基神經(jīng)導(dǎo)管的研究比微米級材料要多，其原因在于神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)的主要關(guān)注點在于細(xì)胞的增殖與分化，對于材料的強(qiáng)度無過多要求，因此，雖然微米級纖維表現(xiàn)出更強(qiáng)的力學(xué)性能，但納米纖維能夠提供更好的細(xì)胞黏附和增殖的場所。

3)目前研究較多的是ε-聚己內(nèi)脂(PCL)基人工神經(jīng)導(dǎo)管，其具有優(yōu)良的柔韌性和生物相容性，但生物降解速率較慢，現(xiàn)有的文獻(xiàn)中鮮有關(guān)于PCL降解速率與神經(jīng)導(dǎo)管再生速度的研究。

4)現(xiàn)有報道中，神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)部的填充物有水凝膠、海綿等，可加速神經(jīng)導(dǎo)管的修復(fù)，其效果優(yōu)于中空導(dǎo)管，但修復(fù)機(jī)制仍然需要進(jìn)一步的探討和闡釋。

基于目前相關(guān)報道，人工神經(jīng)導(dǎo)管在原材料選取、制備方法、功能化改性、結(jié)構(gòu)設(shè)計、生物學(xué)評價等方面還需要進(jìn)一步的改進(jìn)，作為交叉學(xué)科，因人工神經(jīng)導(dǎo)管具有高度的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和用于疾病治療的重要性，需要多各學(xué)科領(lǐng)域的專業(yè)人士相互合作才能在現(xiàn)有水平上取得突破。