◆作者：程皇座 胡友軍,2* 陸信芳 趙曉南 劉堅(jiān)

◆單位：1.廣東酸動(dòng)力生物科技有限公司創(chuàng)新中心；2.廣東酸能生物科技有限公司創(chuàng)新中心

酸制劑具有無(wú)毒、無(wú)污染、無(wú)殘留的特性，最初是作為一種風(fēng)味添加劑使用，用于改善動(dòng)物飼料的適口性。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)酸制劑還具有降低飲水和飼料中的pH 值、降低飼料系酸力、提高消化酶活性、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化、防霉保鮮和抑菌抗病毒作用。特別是在飼料禁抗后，酸制劑良好的抑菌性能受到大家關(guān)注。大量研究表明，在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中，酸制劑能夠抑制多種病原，起到顯著抗菌作用，例如甲酸對(duì)沙門(mén)氏菌、致病弧菌，苯甲酸對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌，丙酸對(duì)真菌、霉菌等均有良好的抑制作用（李成良，2006）。而在動(dòng)物養(yǎng)殖上應(yīng)用，Lan 等（2018）在給母豬飼喂0.2%的富馬酸、檸檬酸、癸酸組成的酸制劑，發(fā)現(xiàn)分娩期腸道乳酸桿菌提高1.2%，哺乳期乳酸桿菌提高2.2%，大腸桿菌降低2.0%。但也有研究表明，有機(jī)酸對(duì)腸道微生物沒(méi)有影響，Risley 等（1992）研究表明，有機(jī)酸對(duì)仔豬胃、空腸、盲腸和結(jié)腸中乳酸菌、梭狀芽孢桿菌和大腸桿菌數(shù)量沒(méi)有顯著影響?？梢?jiàn)有機(jī)酸抑菌效果并不統(tǒng)一，這可能與有機(jī)酸種類(lèi)、用量、動(dòng)物健康狀態(tài)等因素有關(guān)。本試驗(yàn)篩選2 種有害菌（大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌）和3種有益菌（凝結(jié)芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、丁酸梭菌），研究有機(jī)酸單獨(dú)和協(xié)同牛至香酚對(duì)其抑制作用，為商品化有機(jī)酸在動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

液體有機(jī)酸：商品名為富酸寶，主要成分為甲酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、丙酸等，由廣東酸動(dòng)力生物科技有限公司提供。

微生物菌：凝結(jié)芽孢桿菌粉、嗜酸乳桿菌粉、丁酸梭菌粉，由江西水微新飼料有限公司提供。大腸埃希氏菌液、金黃色葡萄球菌液，購(gòu)自清遠(yuǎn)景駿化工貿(mào)易有限公司。

牛至香酚：由江西水微新飼料有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 試驗(yàn)處理分組

試驗(yàn)分為2 大組，每個(gè)大組又分為5 個(gè)小組，第1 大組為液體有機(jī)酸單獨(dú)添加，其中分為不同稀釋度液體有機(jī)酸，分別為0倍、750 倍、1500 倍、2250 倍、3000 倍稀釋添加；第2 大組為液體有機(jī)酸協(xié)同牛至香酚添加，分別為0 倍、750 倍、1500 倍、2250倍、3000 倍稀釋添加。

1.2.2 有機(jī)酸單獨(dú)作用菌液制備

先將液體有機(jī)酸稀釋成0倍（無(wú)菌水代替）、750 倍、1500倍、2250 倍、3000 倍。分別吸取20mL 不同稀釋度液體有機(jī)酸于錐形瓶中，并在裝有不同稀釋度液體有機(jī)酸中添加0.1g 凝結(jié)芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、丁酸梭菌和0.2mL 大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌，制成一定含菌濃度（凝結(jié)芽孢桿菌含量為5×108CFU/mL，嗜酸乳桿菌含量為5×108CFU/mL，丁酸梭菌含量為5×106CFU/mL，大腸埃希氏菌含量為5×107CFU/mL，金黃色葡萄球菌含量為 5 ×107CFU/mL）樣品，用恒溫振蕩器200 rpm/min，振蕩3min，置室溫1h。每個(gè)稀釋度做3 個(gè)重復(fù)。

1.2.3 有機(jī)酸協(xié)同牛至香酚作用菌液制備

先將液體有機(jī)酸稀釋成0倍（無(wú)菌水代替）、750 倍、1500倍、2250 倍、3000 倍。量取10mL不同稀釋度液體有機(jī)酸于錐形瓶中，再分別加入10mL 牛至香酚，混勻后，再在裝有不同稀釋度液體有機(jī)酸中添加0.1g 凝結(jié)芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、丁酸梭菌菌粉和0.2mL 大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌，制成一定含菌濃度（凝結(jié)芽孢桿菌含量為5×108CFU/mL，嗜酸乳桿菌含量為5×108CFU/mL，丁酸梭菌含量為5×106CFU/mL，大腸埃希氏菌含量為5×107CFU/mL，金黃色葡萄球菌含量為 5 ×107CFU/mL）樣品，用恒溫振蕩器200 rpm/min，振蕩3min，置室溫1h。每個(gè)稀釋度做3 個(gè)重復(fù)。

1.2.4 微生物接種培養(yǎng)

將1.2.3 中各稀釋度樣品在室溫存放作用1h 后，以無(wú)菌操作方法吸取1mL 充分混勻的樣品，注入盛有9mL 滅菌生理鹽水試管中，混勻成10-1稀釋液。吸取10-1的稀釋液1mL 注入盛有9mL 滅菌生理鹽水的試管中，混勻成10-2稀釋液，按同法依次稀釋至10-8稀釋液備用，然后將稀釋液以無(wú)菌操作方法用滅菌吸管吸取1mL 充分混勻的樣品，注入滅菌平皿中，傾注約15mL 已融化并冷卻到45℃左右的瓊脂固體培養(yǎng)基，并立即旋搖平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混勻。待冷卻凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，使底面向上，凝結(jié)芽孢桿菌于48℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，嗜酸乳桿菌于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)厭氧培養(yǎng)72h，丁酸梭菌于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)厭氧培養(yǎng)48h，大腸埃希氏菌于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，金黃色葡萄球菌于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，菌落個(gè)數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即為1mL 樣品中的活菌菌落總數(shù)。

1.2.5 菌落計(jì)算

菌種存活率為各處理樣品中活菌數(shù)占無(wú)菌水樣品中活菌數(shù)（凝結(jié)芽孢桿菌含量為5×108CFU/mL，嗜酸乳桿菌含量為5×108CFU/mL，丁酸梭菌含量為50×106CFU/mL，大腸埃希氏菌含量為5×107CFU/mL，金黃色葡萄球菌含量為 5 ×107CFU/mL）的百分比。

2 結(jié)果與分析

由表1 可知，液體有機(jī)酸作用1h 對(duì)嗜酸乳桿菌活菌率具有中等程度抑制作用，活菌率與對(duì)照相比均在30%～49%之間，稀釋倍數(shù)越高活菌率越高；聯(lián)合添加牛至香酚將極大程度抑制活菌率低至10%。

表1 不同濃度液體有機(jī)酸協(xié)同牛至香酚對(duì)嗜酸乳桿菌抑活作用

由表2 可知，液體有機(jī)酸作用1h 對(duì)大腸埃希氏菌活菌率具有很強(qiáng)抑制作用，稀釋至750 倍未檢出大腸埃希氏菌，稀釋至1500 倍時(shí)，活菌率低至6.47%。即聯(lián)合添加牛至香酚將極大抑制大腸埃希氏菌生長(zhǎng)。

表2 不同濃度液體有機(jī)酸協(xié)同牛至香酚對(duì)大腸埃希氏菌抑活作用

由表3 可知，液體有機(jī)酸作用1h 對(duì)丁酸梭菌活菌率具有輕微抑制作用，活菌率與對(duì)照相比均在75%～86%，稀釋至3000 倍活菌率與750 倍活菌率接近。液體有機(jī)酸作用1h 對(duì)金黃色葡萄球菌活菌率具有極強(qiáng)抑制作用，稀釋至2250 倍均未有檢出活菌；稀釋至3000 倍活菌率也僅為1.57%；

表3 不同濃度液體有機(jī)酸對(duì)丁酸梭菌和金黃色葡萄球菌抑活作用

由表4 可知，與對(duì)照組相比，液體有機(jī)酸作用1h 凝結(jié)芽孢桿菌活菌率均高于對(duì)照組，具有一定促進(jìn)凝結(jié)芽孢桿菌增殖效果，活菌率與對(duì)照相比均在1.57～1.85 倍，稀釋至3000 倍活菌率與750 倍活菌率接近。液體有機(jī)酸對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌作用2h，所有加酸組凝結(jié)芽孢桿菌活菌率均高于對(duì)照組，活菌率與對(duì)照相比均在1.37～2.06 倍。

表4 不同濃度液體有機(jī)酸對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌抑活作用

3 討論

本試驗(yàn)中，在水中添加液體有機(jī)酸作用1～2h 時(shí)，能促進(jìn)凝結(jié)芽孢桿菌增殖，這是因?yàn)槟Y(jié)芽孢桿菌具有顯著的抗逆性，具有耐胃酸、耐膽鹽、耐高溫高壓、復(fù)活率高等特性，研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌經(jīng)口服進(jìn)入胃后，在胃液酸性條件下會(huì)被活化，芽孢衣膨脹，水分增加，代謝加快（牛自康，2019；柯軻，2021），因此，一定的酸性環(huán)境能夠促進(jìn)其生長(zhǎng)增殖。而本試驗(yàn)選擇的液體有機(jī)酸對(duì)大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌抑制作用很大，在不添加牛至香酚情況下液體有機(jī)酸稀釋750 倍時(shí)對(duì)大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌抑制率達(dá)95%以上，說(shuō)明這兩種畜禽常見(jiàn)病菌對(duì)酸的敏感性很高。

本試驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)，液體有機(jī)酸作用1h 對(duì)丁酸梭菌活菌率具有輕微抑制作用，對(duì)嗜酸乳桿菌活菌率具有中等程度抑制作用，而協(xié)同牛至香酚強(qiáng)烈抑制嗜酸乳桿菌和大腸埃希氏菌增殖，說(shuō)明不同的微生物對(duì)酸具有不同的耐受作用，而協(xié)同牛至香酚具有更好的抑菌效果，這可能是因?yàn)榕Ｖ料惴幽軌蚱茐募?xì)菌細(xì)胞膜的完整性，增加膜通透性，使細(xì)菌對(duì)酸性環(huán)境更為敏感（Basmacioglu-Malayoglu，2016）。

綜合看來(lái)，單獨(dú)添加液體有機(jī)酸（750 ～1500 倍稀釋?zhuān)┯欣谀Y(jié)芽孢桿菌增殖，對(duì)丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌影響較小，可強(qiáng)烈抑制金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌，因而更有利于酸制劑維持體內(nèi)有益菌和有害菌之間的微生態(tài)平衡；聯(lián)合添加牛至香酚，盡管進(jìn)一步抑制了濃度本就極低的大腸埃希氏菌數(shù)，但嚴(yán)重抑制了嗜酸乳桿菌活菌數(shù)，因此可根據(jù)實(shí)際情況謹(jǐn)慎使用，其作用機(jī)理和對(duì)其他微生物的聯(lián)合添加效應(yīng)的影響關(guān)系還應(yīng)進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

液體有機(jī)酸對(duì)畜禽常見(jiàn)病原菌具有抑制作用，對(duì)常見(jiàn)有益菌生長(zhǎng)繁殖具有促進(jìn)作用，并且在協(xié)同牛至香酚作用下更明顯，但其抑菌效果跟多種因素有關(guān)，在實(shí)際畜禽生產(chǎn)中應(yīng)用需結(jié)合實(shí)際情況進(jìn)行選擇和考慮。

參考文獻(xiàn)：（略）