周易 趙玉鳴

北京大學口腔醫(yī)院兒童口腔科 北京100081

牙髓再生這一概念已經(jīng)存在了幾十年。1971年，Nygaard-?stby和Hjortdal[1]提出了再生牙髓組織的概念。牙髓再生治療的定義為：利用組織工程學原理，以健康的新生牙髓取代已感染或壞死的牙髓組織，從而恢復正常的牙髓-牙本質復合體的結構和功能的治療手段。作為治療年輕恒牙牙髓壞死的新技術，牙髓再生治療可使未發(fā)育完全的根尖孔閉合，根管壁增厚，牙根增長，較好地保存牙齒的生理功能。

再生技術的3個關鍵要素是干細胞、支架和信號分子[2]。牙髓再生的支架材料應具備以下能力：為干細胞提供生物學和機械支持，創(chuàng)造允許細胞黏附、遷移、增殖和分化的環(huán)境，可降解且降解速率與組織形成速率一致，無毒害和易制取等[3]。

目前牙髓再生的支架可以大致分為生物提取和人工合成兩大類。生物提取的支架包括血凝塊（blood clot，BC）、富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）、富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrin，PRF）、透明質酸、藻酸鹽、殼聚糖（chitosan，CS）、膠原、絲、脫細胞細胞外基質（extracellular matrix，ECM）等；人工合成的支架包括聚合物、生物陶瓷等；此外，還有將兩種或兩種以上材料結合在一起的復合支架。本文就這些支架材料的性能和應用前景的研究進展作一綜述。

1 生物提取的支架

從生物資源里提取的基質一般具有較好的生物相容性和生物活性，但其降解速率和微觀結構不易調控，還有免疫原性和毒性方面的顧慮。

1.1 BC

BC是目前牙髓再生治療中最傳統(tǒng)最普及的一種支架材料。BC不僅是支架，還是引入干細胞的主要手段。通過刺破根尖周組織使血液進入根管，可簡便直接地獲得BC。

牙髓再生治療應用單純BC支架后，人牙根發(fā)育的成功率為53.3%～100%[4-7]。BC具有高成功率、簡便易行、經(jīng)濟性和天然無害的特點，但其效果存在爭議。Altaii等[8]通過動物實驗比較了BC支架、PRP、膠原支架進行牙髓血運重建治療的效果，發(fā)現(xiàn)BC支架較其他支架形成硬組織的概率低。BC仍有很多不足，首先BC不能誘導真正的牙髓牙本質復合體再生，其次BC的結構脆弱，治療時可能不能獲得足量的BC以充盈根管，從而導致上方封閉塌陷。學者們目前仍在研究其他新型材料作為支架，以期獲得真正的牙髓再生。

1.2 PRP和PRF

PRP是一種具有豐富生長因子的自體第1代血小板濃縮物，可以說是不同生長因子的濃縮懸浮液。PRP可通過自體血液加工后獲得，無免疫原性和傳播疾病的風險。

Jadhav等[9]對20例患者的年輕恒前牙進行牙髓血運重建治療，隨訪12個月，結果發(fā)現(xiàn)：與不應用PRP相比較，應用PRP的患牙在根尖周愈合、根尖孔閉合和根管壁增厚的程度方面均有明顯增加，而牙根長度增加方面則無明顯差異。分析可能的機制為：在局部應用PRP時，血小板數(shù)量增加高達338%[10]，血小板數(shù)量增加會導致由它們分泌的生長因子數(shù)量增加；PRP中的血小板被激活后，其α脫顆?？僧a(chǎn)生高濃度生長因子，各種生長因子之間會相互影響和作用，通過自分泌或旁分泌模式刺激周圍細胞再聚集，并調節(jié)細胞的趨化、遷移、增殖和分化，從而引發(fā)及時有效的組織修復過程[11]。然而，Alagl等[4]使用PRP和BC進行牙髓血運重建的臨床對照研究則表明除了根長顯著增加之外，PRP處理的結果與BC沒有明顯差異。Bezgin等[5]的研究也表明：使用PRP與BC在牙根發(fā)育和炎癥反應等方面的效果均沒有明顯差異。

上述研究提示PRP支架的功能具有不確定性，目前仍不能認為PRP可取代BC獲得更好的牙根發(fā)育效果。除此之外，使用PRP支架的缺點有：需要患者抽血，需要特殊設備和試劑來制備，以及增加治療成本等。

PRF是具有高濃度的纖維蛋白凝塊的第2代血小板濃縮物。與PRP相比，PRF在制備過程中不需要補充凝血酶，含有更高濃度的細胞因子，且釋放生長因子速度更為緩慢，更有利于堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）表達和礦化誘導[12]。目前PRF應用于臨床牙髓再生治療成功的案例報道僅有數(shù)例。Ulusoy等[13]認為：PRF可以獲得與PRP、BC類似的臨床和放射學結果。李文靜等[14]認為：PRF有優(yōu)秀的生物誘導性，能較好地保存牙髓活力，誘導年輕恒牙牙根形成，提高治療成功率。目前尚需更多的研究來驗證其作為牙髓再生支架的效果[15-17]。

1.3 多糖

多糖類支架也常用于牙髓再生。多糖類材料包括透明質酸、藻酸鹽、CS和VitroGel 3D多糖水凝膠等。透明質酸是存在于ECM中的糖胺聚糖之一，通過保留細胞外間隙在維持組織形態(tài)中起重要作用[18]。藻酸鹽是從褐藻中分離出的一類多糖[19]。CS是甲殼素脫乙?；a(chǎn)生的，甲殼素是甲殼類（如螃蟹和蝦）的外骨骼和真菌細胞壁的結構元素[3]。CS具有多種生物學特性，如抗菌性、生物相容性、生物降解性、止血能力、與蛋白質顯著的親和力和促進細胞黏附、增殖和分化的能力，易被加工成各種結構，具有作為牙髓再生支架的潛力[20-21]。這些材料都具有生物相容性和無毒性，但機械強度低，體內(nèi)降解速度不受控制。

2014年，Lambricht等[22]和Martin等[23]通過體外和體內(nèi)實驗評估了各種類型和組成的透明質酸和藻酸鹽天然水凝膠，發(fā)現(xiàn)它們能夠促進根尖牙乳頭干細胞（stem cells from apical papilla，SCAPs）增殖、礦化和分化為成牙本質細胞表型。這提示多糖類支架具有可用于牙髓再生的潛力。

透明質酸可制成可注射凝膠或透明質酸海綿[18,24]。Ferroni等[25]將牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）接種到透明質酸支架上，發(fā)現(xiàn)透明質酸可誘導成骨或成牙髓樣組織。

藻酸鹽可通過增加鈣含量和交聯(lián)密度改善機械強度[26]。攜帶轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的藻酸鹽水凝膠可在體外誘導人成牙本質細胞樣細胞分化并產(chǎn)生規(guī)則的管狀牙本質基質[27]。Verma等[28]對20只雪貂尖牙使用DPSCs+藻酸鹽水凝膠或者BC支架進行牙髓再生治療，發(fā)現(xiàn)兩者對牙根發(fā)育效果并無明顯差異。

Palma等[20]使用BC和2種不同配方的CS水凝膠作為支架進行犬的牙髓再生治療，發(fā)現(xiàn)CS支架不能改善根管內(nèi)礦化組織的形成，也不能促進牙髓牙本質復合體再生，與單獨使用BC支架相比更易導致炎癥反應，降解時間過長。而曹春玲等[29]研究了人牙髓細胞在可注射羥乙基殼聚糖基水凝膠內(nèi)的增殖和分化狀況，發(fā)現(xiàn)在成牙本質向誘導培養(yǎng)14 d后，牙本質涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）、牙本質基質蛋白（dentin matrix protein，DMP）-1、ALP表達水平較高，展現(xiàn)了良好的成牙本質向分化潛力和礦化潛力。

Xiao等[30]認為：已經(jīng)商品化的非動物源的VitroGel 3D合成多糖水凝膠有作為牙髓再生支架的潛力。該研究在VitroGel 3D合成多糖水凝膠中培養(yǎng)SCAPs，發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的2D單層細胞培養(yǎng)相比，3D水凝膠系統(tǒng)中SCAPs生長的形態(tài)和行為與自然生長狀態(tài)非常相似，并且混入的基質細胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α）能夠協(xié)同骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2，促進DMP-1和DSPP表達明顯增加，增加血管化水平和成骨水平。

1.4 膠原

膠原是一種天然蛋白質，是ECM的主要成分，可從動物的皮膚、骨骼、韌帶等組織中提取，來源廣泛且種類繁多。目前已鑒定的膠原就有19種，而支架材料主要由Ⅰ型膠原制備[19]。膠原可加工成各種形式，包括多孔海綿、凝膠和膜，并可與化學物質交聯(lián)以改變其降解速率和收縮率[31]。

1.4.1 膠原膜 在臨床上牙髓再生治療時，如果不能獲得足夠的血液作為支架，密封材料易塌陷，使用可吸收膠原膜能防止密封材料塌陷，在血液不足的情況下作為支架允許新的組織生長進入髓腔。Bio-Gide是一種可吸收的純膠原膜，廣泛用作牙周組織再生的支架材料[32-33]。Jiang等[6]和Fahmy等[34]通過臨床研究發(fā)現(xiàn)：是否使用膠原膜在治療成功率和其他臨床指標方面沒有明顯差異，牙根繼續(xù)發(fā)育參數(shù)，如根長、根尖1/3牙本質壁厚度、根尖孔寬度并沒有明顯差異，但能夠促進牙根中1/3牙本質形成，這有利于避免根折。膠原膜還增加了操作的便利性，并可確保密封材料的定位，特別適用于根管粗大的牙齒。

1.4.2 明膠海綿 有學者[35]對犬的根尖周炎年輕恒牙進行牙髓血運重建，結果與僅使用BC相比，明膠海綿和BC作為組合支架使用時能夠形成更多的新生組織。Yamauchi等[36]進行了類似的研究，同樣發(fā)現(xiàn)使用交聯(lián)的膠原蛋白支架增加了管腔中的礦化組織形成。

1.4.3 膠原水凝膠 膠原水凝膠可攜帶BMP-4或堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），與牙髓細胞混合并移植到大鼠體內(nèi)后能夠檢測到DSPP的產(chǎn)生[37]。膠原水凝膠還可攜帶血管原性生長因子（angiogenic growth factors，AGF）與牙髓細胞，促進根管中結締組織的形成[38]。交聯(lián)肉桂醛后的膠原水凝膠可以促進人DPSCs的增殖和牙源性分化，抗壓強度和表面粗糙度增加，凝結時間明顯縮短[39]。

由上述研究可知，膠原類支架材料可誘導根管內(nèi)產(chǎn)生更多的新生組織，且其組分和結構多樣，在牙髓再生治療中具有非常有益的特征；但也有研究[40]表明使用膠原支架會比不使用導致更明顯的炎癥反應、更多的牙根和骨吸收。

1.5 絲

絲作為支架可用于軟硬組織工程。絲的成分為絲素蛋白（silk fibroin，SF），而SF是一種酶促可降解材料，可以加工成不溶于水的植入物，如可注射水凝膠和多孔海綿。SF還具有良好的抗凝血活性和促進再生作用的能力，良好的機械強度、彈性、透氣性、滲水性以及緩慢的降解速率[41]。

Meinel等[42]通過大鼠進行移植實驗，結果表明：絲與聚乳酸（polylactic acid，PLA）或膠原相比，炎癥反應和免疫原性更低，生物相容性更高。Yang等[43]發(fā)現(xiàn)：使用復合bFGF的SF支架，通過體外誘導DPSCs，生成具有良好的血管分布、新的基質沉積和牙質樣組織形成的類牙髓樣組織。

目前SF應用于牙髓再生方面的研究仍比較缺乏，還需要更多的實驗來驗證SF是否具有較其他支架更好的性能。

1.6 脫細胞ECM

除血細胞之外，人體組織中的大部分正常細胞是錨定的，位于稱為ECM的固體基質中。組織工程的最佳支架應該是天然狀態(tài)下的ECM，微環(huán)境是非常重要的[44-45]。脫細胞ECM基本保存了微環(huán)境和纖維蛋白，提供了細胞定位并有利于調節(jié)未來的細胞活性，可能是組織再生的理想支架[46]。已有研究[47-48]成功實現(xiàn)了人牙髓的脫細胞處理，所產(chǎn)生的支架支持干細胞增殖和分化成礦化組織。脫細胞ECM可以說是一種自/異體移植物，可從拔除的健康第三磨牙中提取，來源廣泛、容易獲取是其優(yōu)勢。

2 人工合成的支架

人工合成的支架常具有更可控的降解率和物理機械性能，但生物相容性較差。

2.1 聚合物

許多人工合成的聚合物，如PLA、聚-L-乳酸（poly-L-lactic acid，PLLA）、聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物（polylactic-co-glycolic，PLGA）、聚ε-己 內(nèi) 酯（polyepsiloncaprolactone，PCL）、聚二氧環(huán)己酮（polydioxanone scaffold，PDS）和聚乙二醇聚乳酸（polyethylene glycol polylactic，PEG）等可用作牙髓再生的支架。這些聚合物無毒害，可達到生物降解，并能對物理化學性質，如機械強度、降解速率、孔隙率和微觀結構進行精確控制[49]。

Gotlieb等[50]將人脫落乳牙干細胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs）接種在合成的PLLA等支架上，植入人前磨牙根管中，通過掃描電子顯微鏡觀察添加或不添加BMP-2、TGF-β2的PLLA支架或膠原支架的超微結構，結果發(fā)現(xiàn)：不同支架類型和支架是否添加生長因子對細胞附著的影響幾乎沒有差異。El-Backly等[51]將兔DPSCs接種于PLGA上，并植入家兔皮下，12 d后觀察到牙骨質及管狀牙本質形成。Cordeiro等[52]將人脫落乳牙牙髓干細胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs）接種到PLLA上，置于牙本質薄片上并移植入裸鼠皮下，14～28 d后觀察到血管化的牙髓樣組織和成牙本質細胞形成。

聚合物支架的生物相容性較天然支架可能差一些。Leong等[53]將釋放甲硝唑和克林霉素的彈性凍干膠原支架與PLGA進行比較，接種人DPSCs 7 d后，釋放甲硝唑和克林霉素的彈性凍干膠原支架接觸的細胞更健康，而與PLGA接觸的細胞顯示出退化和凋亡跡象。

抗生素聯(lián)合聚合物支架，如二聯(lián)抗生素糊劑（doubleantibiotic paste，DAP）-PDS支架、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）-PDS支架、三聯(lián)抗生素糊劑（tripleantibiotic paste，TAP）-模擬PDS聚合物納米纖維支架等，均具有明顯的抗菌效果。將來如果抗生素聯(lián)合聚合物支架能取代根管內(nèi)化學消毒的步驟，將大大縮短牙髓再生治療的就診頻次和療程，但同時要考慮到抗生素對干細胞增殖的抑制作用[54-60]。

2.2 生物陶瓷

生物陶瓷支架是指鈣-磷酸鹽類材料（calcium phosphate-based，Ca-P）、生物活性玻璃和玻璃陶瓷等[61]。最常用的是Ca-P生物陶瓷[3]。Ca-P支架包括β磷酸三鈣（tricalcium phosphate，TCP）和羥磷灰石（hydroxyapatite，HA），目前已經(jīng)廣泛用于骨再生。TCP和HA的鈣磷比例不同。HA具有骨誘導性和骨傳導性，是骨組織的優(yōu)良替代材料，但在體內(nèi)幾乎不降解；與HA相比，TCP可降解并且能通過釋放鈣、磷離子促進組織礦化。

Miura等[62]將SHEDs與HA-TCP混合后移植到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)有牙本質、骨和牙髓樣組織的形成。Goudouri等[63]發(fā)現(xiàn)鎂基玻璃陶瓷具有較高的機械性能和生物活性。Kushwaha等[64]成功地在添加鈮的氟磷灰石玻璃陶瓷表面上培養(yǎng)出人類間充質干細胞。Lim等[65]在摻入地塞米松和生物活性玻璃納米顆粒的納米纖維基質上培養(yǎng)出人牙髓細胞（human dental pulp cells，hDPCs），并發(fā)現(xiàn)該基質可促進細胞的增殖。

生物陶瓷類材料的缺點是成形困難，機械強度差，脆性大，降解速率緩慢以及密度高。這些特性可以通過改變其成分和結構而加以修改。比如向純TCP支架中添加SiO2和ZnO，可增加其機械強度以及細胞增殖活性；改變支架的孔徑和體積，也會影響其機械強度。

總之，生物陶瓷支架在單獨使用時缺點十分明顯，因此目前常與其他材料復合應用。

2.3 復合支架

為了克服單一支架材料的缺點，將兩種或多種材料進行復合是支架材料研制中的新方向。

Agrawal等[66]發(fā)現(xiàn)：將生物陶瓷結合聚合物（如羥磷酸鈣結合PLA），不僅有助于防止因聚合物降解引起的pH值下降及無菌性炎癥，同時復合后的材料在強度、脆性、孔隙率和降解性等方面兼具兩種材料的優(yōu)點。

Fu等[67]將BMP-2與PLGA/HA復合纖維支架以不同的方式結合，移植到裸鼠體內(nèi)，觀察6周后發(fā)現(xiàn)：從PLGA/HA復合纖維支架釋放的BMP-2的生物活性保持良好，進一步改善了新骨形成和愈合。

自組裝含肽水凝膠是新型生物材料支架[68]。因其中心肽段分別由親水性和疏水性的氨基酸殘基交替組成，從而具有很強的自組裝性。成膠前，可以先和細胞或生物活性分子（如生長因子）預混，在鹽溶液中，肽段會自組裝形成透明的三維凝膠結構。這種自組裝性使其擁有廣泛的應用前景。Galler等[69]將SHEDs和DPSCs分別接種在自組裝多肽水凝膠中，觀察4周后發(fā)現(xiàn)：干細胞都能進行增殖和分化，凝膠也都發(fā)生了降解；SHEDs表現(xiàn)出較高的增殖率和膠原形成量，產(chǎn)生更多軟組織，而DPSCs的增殖率雖較低，但可觀察到礦化現(xiàn)象、成骨樣細胞表型和相關基因表達。

除上述支架外，還有各種復合支架，如生物活性分子-生長因子-干細胞模擬ECM支架[70]、膠原-藻酸鹽牙膠尖支架[71]、膠原-HA支架[72]、氟磷灰石（fluorapatite，F(xiàn)A）-PCL支架[73]、PDS-埃洛石納米管（halloysite nanotubes，HNTs）支架[74]等等，它們可以在一定程度上取長補短，具有廣闊的研究前景。

3 小結

目前尚未有理想的牙髓再生支架材料問世，期望未來有更多關于復合支架的研究能夠打破單一支架的局限性。牙髓再生治療的方法和步驟仍在不斷改進和探索中，將來通過更先進的支架材料和大量的病例研究可以規(guī)范牙髓再生治療，提高其治療的成功率，獲得真正的牙髓再生。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。