梁屹 裴錫波 萬乾炳

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)院修復科 成都610041

水凝膠是1種親水聚合物合成材料，具有高含水量和質(zhì)地柔軟的特性，可用于調(diào)節(jié)細胞功能和組織形態(tài)[1-2]。傳統(tǒng)水凝膠大多具有靜態(tài)和各向同性的特性，無法適應動態(tài)和非均勻的體內(nèi)環(huán)境。

光響應水凝膠由聚合物網(wǎng)絡和光響應基團組成，通過光響應基團將光信號轉(zhuǎn)化為物理或化學信號，繼而控制水凝膠的物理或化學性質(zhì)，影響其微結(jié)構(gòu)，調(diào)控細胞的行為如黏附、遷移和分化[3]。并且由于光的高度時空控制和各種光敏基團的可用性，光響應水凝膠在需要精確的時空生物配基的生物醫(yī)學應用中得到廣泛采用，例如材料整合和血管化，靶向微米/納米顆粒到癌癥和炎癥的病變部位，以及作為細胞培養(yǎng)平臺[4]。

1 光響應水凝膠的分子機制

光響應水凝膠可利用不同波長的光信號通過光敏基團產(chǎn)生光響應，將光信號轉(zhuǎn)化為各種物理或化學信號，改變光響應水凝膠的物理或化學性質(zhì)，實現(xiàn)對細胞的動態(tài)調(diào)節(jié)。為了實現(xiàn)光響應水凝膠在生物醫(yī)學領域的廣泛應用，許多光敏基團已被用于制造光響應水凝膠。常見光敏基團的光反應類型主要有二聚化反應、裂解反應、異構(gòu)反應。以硫醇-烯、香豆素為代表的光響應基團在光照條件下光致二聚化，為水凝膠提供了豐富的交聯(lián)點。硫醇-烯點擊反應產(chǎn)率高而且副產(chǎn)物少，目前廣泛應用于光響應水凝膠的合成。Xin等[5]在365 nm的紫外光下引發(fā)二巰基聚乙二醇上的巰基和四臂聚乙二醇-降冰片烯中的烯鍵發(fā)生點擊反應制造了穩(wěn)定的微凝膠。而香豆素基團可在365 nm波長的照射下通過[2+2]-環(huán)加成反應生成環(huán)丁烷二聚體，同時環(huán)丁烷二聚體在280 nm以下的光照下可發(fā)生裂解[6]。因此某些二聚體基團可在光照條件下進行交聯(lián)-脫交聯(lián)，實現(xiàn)光響應水凝膠的凝膠-溶膠轉(zhuǎn)變，利用其特性可作為一種按需給藥的優(yōu)良載體。

此外，可通過將光致裂解基團如鄰硝基芐酯與水凝膠骨架整合，光照后使水凝膠網(wǎng)絡發(fā)生不可逆的破壞，導致水凝膠網(wǎng)絡的物理或化學性質(zhì)發(fā)生改變。Lunzer等[7]利用硫醇修飾的透明質(zhì)酸結(jié)合含有鄰硝基芐酯基的聚乙二醇連接劑在320～500 nm光照下發(fā)生水凝膠的光降解，降低水凝膠交聯(lián)程度增加了其溶脹能力。

常見的光異構(gòu)化基團包括偶氮苯和螺吡喃。這些光響應基團在紫外或可見光照射下能夠發(fā)生可逆異構(gòu)化，從而導致水凝膠網(wǎng)絡的親水-疏水轉(zhuǎn)變[8]。Homma等[9]利用偶氮苯的異構(gòu)化導致其極性改變使水凝膠在365 nm和436 nm兩種不同波長的光照下發(fā)生可逆的溶膠-凝膠的轉(zhuǎn)化。此外，Li等[10]還將螺吡喃摻入水凝膠中，在紫外線的照射下實現(xiàn)螺吡喃從疏水閉環(huán)到親水開環(huán)的轉(zhuǎn)變，通過光引發(fā)水凝膠的膨脹。

2 光響應水凝膠在生物支架中的應用

光響應水凝膠在空間和時間上具有高度可調(diào)的物理和化學特性，可以在光刺激無接觸下改變支架形狀，模擬組織生物力學的動態(tài)特性，遠程和無接觸地調(diào)控細胞生長，促進細胞的增殖與分化[11]。將細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分的肽基類似物引入光響應基團，并將其作為光響應生物墨水，與三維光刻打印技術(shù)和光纖技術(shù)結(jié)合，可制造具有精確復雜結(jié)構(gòu)和多種生物活性因子定位的的光響應水凝膠支架，對細胞進行三維化引導，促進多種組織缺損的修復。

2.1 具有精確復雜結(jié)構(gòu)的光響應水凝膠支架

近年來，明膠由于具有良好的生物相容性以及低免疫原性等方面的優(yōu)勢被廣泛應用[12]。通過將明膠甲基丙烯酰化可使其具有光交聯(lián)特性。Cidonio等[13]利用3D打印技術(shù)將甲基丙烯酰明膠（methylacryloyl gelatin，GelMA）生物墨水光交聯(lián)，加入納米硅酸鹽增加強度和黏性，制造嵌合缺損部位的水凝膠支架，并將血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）加入到水凝膠支架中以模擬間充質(zhì)干細胞（mesenchyml stem cells，MSCs）的三維細胞微環(huán)境，觀察到良好的成血管和成骨現(xiàn)象。Zhu等[14]將光響應基團丙烯酸酯基引入聚乙二醇，結(jié)合軟骨外基質(zhì)，光交聯(lián)制備了1種類軟骨的聚乙二醇二丙烯酸酯（polyethylene glycol diacrylate，PEGDA）光響應水凝膠支架用于軟骨缺損修復。植入物采用立體光刻技術(shù)結(jié)合3D打印擁有精確的結(jié)構(gòu)，同時天然軟骨外基質(zhì)保留軟骨誘導特性，模擬原生微環(huán)境，促進間充質(zhì)干細胞的軟骨分化。光響應水凝膠支架還可通過改變自身剛度擁有與體內(nèi)細胞外基質(zhì)相似的彈性模量對細胞進行三維化的引導。有學者[15]利用光交聯(lián)生物油墨呋喃基—明膠，開發(fā)出1種彈性模量為9.76 kPa，與天然心肌組織力學特性相似的支架。在此支架上以1∶1比例培養(yǎng)心肌細胞和心肌成纖維細胞后分別用肌鈣蛋白Ⅰ和成纖維細胞特異性蛋白Ⅰ染色，顯示這2種細胞發(fā)生均勻耦合并表現(xiàn)出良好的活力。此外光響應水凝膠支架可通過改變生物墨水的組成使其擁有更好的力學性能。Xu等[16]便通過改變聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯光響應水凝膠的組分，利用其光交聯(lián)特性，制造出彈性和柔韌性可變的水凝膠支架。利用光響應水凝膠制造高精度和復雜的三維支架依賴于先進的制造技術(shù)和具有良好生物學特性的生物墨水。因此如何在光響應水凝膠基礎上設計理想的3D打印油墨將繼續(xù)成為一個重要的話題。

2.2 定位多種生物活性因子的光響應水凝膠支架

雖然許多支架均可以為細胞提供三維培養(yǎng)環(huán)境，但支架上缺少生物活性因子使其缺少與細胞之間的動態(tài)互動。利用光響應水凝膠支架對光響應的特性可以將多肽和生長因子等生物活性分子固定或釋放，動態(tài)調(diào)控細胞的黏附，增殖和分化。Cai等[17]利用聚甲基丙烯酸酯羥乙基與苯基疊氮化合物構(gòu)建帶有導管的大孔光響應水凝膠支架，利用光導纖維在270 nm波長的光照下使疊氮苯光敏基團光交聯(lián)實現(xiàn)膠原蛋白固定在水凝膠導管內(nèi)表面。神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）優(yōu)先黏附于蛋白固定的區(qū)域，促進神經(jīng)干細胞的分化，神經(jīng)元定向伸長和神經(jīng)再生。Li等[18]將光響應基團硝基芐基加入膠原模擬多肽（collagen mimetic peptides，CMP）主鏈中，利用空間位阻抑制CMP與明膠聚合物鏈之間三重螺旋雜交，之后通過紫外光照射使硝基芐基裂解導致空間位阻的降低引發(fā)多肽固定在水凝膠上，在水凝膠中實現(xiàn)細胞黏附的空間控制。

體內(nèi)多種組織都具有高度的層次性，從單個細胞到復雜的組織，這種結(jié)構(gòu)對維持正常的生理功能非常重要。光響應水凝膠支架為修復缺損組織提供了1種新的方法。通過光響應水凝膠支架高度排列的納米結(jié)構(gòu)以及多種生物活性因子的定位，引導細胞定向生長，最終在缺損間建立1個完整的橋梁，形成新組織完成缺損的修復。

3 光響應水凝膠在給藥系統(tǒng)中的應用

水凝膠是高分子鏈交聯(lián)形成的高含水量三維網(wǎng)絡，由于其可調(diào)的物理、化學和生物學特性，目前被廣泛應用于藥物傳遞中，增強藥物的循環(huán)半衰期，提高藥物的生物相容性[19-20]光響應水凝膠因其具有高時空分辨率的非接觸降解，為藥物傳遞提供了新的可能性[21]。光響應水凝膠可利用光熱效應發(fā)生凝膠—溶膠相變釋放負載藥物，同時可利用自組裝光響應水凝膠通過光聚合或光裂解來達到釋放藥物的目的[22]。因此，光響應水凝膠被認為是1種用于藥物運輸達到按需給藥目的的理想載體。

3.1 基于光熱效應的凝膠-溶膠相變的給藥系統(tǒng)

對近紅外光（near infrared，NIR）敏感的水凝膠利用光熱效應，通過光敏劑將光轉(zhuǎn)化為熱觸發(fā)光響應水凝膠的凝膠—溶膠相變，軟化或融化載藥水凝膠的納米結(jié)構(gòu)從而釋放藥物[23]。光照強度大小和暴露時間長短可準確控制藥物釋放速率。有學者[24]以環(huán)糊精和包覆鉑納米粒子的聚乙二醇為原料，合成了1種近紅外光響應按需降解的水凝膠給藥系統(tǒng)。近紅外光照射不同時間，水凝膠網(wǎng)絡可被部分破壞，達到近紅外光照射精確控制藥物釋放的目的。黑磷（black phosphorus，BP）是1種新發(fā)現(xiàn)的材料，具有光熱轉(zhuǎn)換效率高，良好的生物相容性和高載藥能力的特點[25-27]。有學者[28]報道了1種基于黑磷的利用近紅外光進行光熱轉(zhuǎn)換的光響應水凝膠載藥系統(tǒng)。BP@Hydrogel在1 W·cm2照射下可升高10℃以上，可循環(huán)重復6次，經(jīng)歷可逆的軟化；當激光功率增加到1.5 W·cm2時，溫度急劇升高，水凝膠逐漸熔化，達到控釋藥物的目的。與健康組織相比，腫瘤細胞對熱的耐受性較低。因此，可利用上述水凝膠特性，用于光熱與化療的聯(lián)合使用。NIR響應的水凝膠具有光開關特性，在載藥方面有很好的應用前景，但設計1種能夠通過不同波長的光動態(tài)控制載藥凝膠的硬化/軟化達到按需給藥更具實用性。Zheng等[29]設計了1種對紫外線和近紅外光均有反應，剛度可調(diào)的雙光響應超分子凝膠。紫外線照射水凝膠誘導反式偶氮轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖脚嫉獜亩浕z；近紅外光照射凝膠進行光—熱轉(zhuǎn)換，觸發(fā)熱響應聚合物聚N-異丙基丙烯酰胺[poly（N-isopropylacrylamide），PNIPAAm]親水—疏水轉(zhuǎn)變，凝膠硬化。但由于紫外線是一種高能電磁波，對組織的滲透性很差。Hu等[30]使用轉(zhuǎn)化納米粒子（up-conversion nanoparticles，UCNPs）結(jié)合偶氮鍵，利用近紅外光的光熱效應同時發(fā)射紫外線引起凝膠—溶膠的轉(zhuǎn)換，實現(xiàn)光調(diào)節(jié)藥物釋放的目的。

3.2 基于自組裝的光響應水凝膠的給藥系統(tǒng)

當光響應水凝膠與生物分子如多肽、蛋白質(zhì)、多糖生物分子之間通過可逆的非共價連接時，可以更大程度的發(fā)揮水凝膠納米結(jié)構(gòu)的通用性，靈活性及高敏感性。因此，這種以自組裝為基礎的光響應水凝膠是1種很有前途的藥物輸送平臺，受到了相當大的關注。

利用自組裝結(jié)合生物分子的光響應水凝膠作為藥物的釋放平臺，在治療癌癥或者細菌感染方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。Wang等[31]使用光響應MnO2納米片利用自組裝制備了仿生二氧化錳混合（bioinspired MnO2hybrid，BMH）水凝膠。在808 nm的光照下MnO2納米片將內(nèi)源性過量的H2O2催化分解產(chǎn)生O2緩解腫瘤微環(huán)境乏氧，同時釋放抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素殺傷腫瘤細胞；同時利用MnO2納米片的“納米刀片”效應破壞細胞膜，有助于殺滅細菌，促進感染創(chuàng)面的愈合。相較于傳統(tǒng)共價生物偶聯(lián)得到靜態(tài)結(jié)構(gòu)的水凝膠，自組裝的超分子水凝膠分子之間的動態(tài)非共價鍵有助于在鍵的生成和解離之間建立動態(tài)平衡。Grim等[32]設計了1個烯丙基硫化物手柄，允許在細胞負載的光響應水凝膠中通過光催化硫醇-烯點擊反應實現(xiàn)信號蛋白從水凝膠中完全可逆和重復地捆綁。此外，基于自組裝的超分子水凝膠在控制其力學性能方面具有很高的靈活性。Jiang等[33]利用多聚組氨酸標簽標記具有腺苷鈷胺素結(jié)合域的感光蛋白（photoreceptor C-terminal adenosylcobalamin binding domain，CarHC），將多聚組氨酸標簽標記的感光蛋白通過與過渡金屬離子絡合，并利用CarHC在黑暗中與輔因子AdoB12結(jié)合后自組裝，形成具有一定強度可注射的光響應水凝膠，并將負載白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）的水凝膠注射到受傷的小鼠視神經(jīng)中，通過522 nm的綠光照射使AdoB12中的C-Co鍵斷裂，導致凝膠—溶膠轉(zhuǎn)變，釋放LIF促進軸突再生。

雖然目前通過光激活水凝膠釋放藥物仍有較多挑戰(zhàn)需要解決，如聚合物載體與光源的距離、光穿透組織的密度，以及藥物在光照下降解的可能性等，但是利用光刺激傳遞藥物具有可以對非侵入性的觸發(fā)做出反應等優(yōu)良特性，為研究者提供了1種不需要直接與患者接觸的遠程激活方法。

4 光響應水凝膠在細胞封裝中的應用

有研究[34]表明細胞的表型和功能受到細胞外基質(zhì)機械性能的影響，因此模仿原生細胞外基質(zhì)的生物材料可以在體外模仿細胞微環(huán)境，調(diào)節(jié)細胞行為。然而，許多研究[35-36]表明，體外二維細胞培養(yǎng)環(huán)境和原生細胞微環(huán)境在物理和化學性質(zhì)上的巨大差異，無法維持來自復雜多細胞組織的細胞表型。鑒于光響應水凝膠可以遠程和無接觸地改變細胞生長條件，因此可通過光響應水凝膠封裝相關細胞或生物信號進行三維細胞培養(yǎng)在體外重現(xiàn)原生細胞微環(huán)境。隨著生物打印技術(shù)和各種微流控平臺等各項生物制造技術(shù)的發(fā)展，將其與光響應水凝膠結(jié)合，能擴寬光響應水凝膠在生物工程領域如藥物篩選，再生醫(yī)學的應用。

4.1 傳統(tǒng)塊狀光響應水凝膠作為細胞培養(yǎng)平臺

細胞外基質(zhì)具有各種物理和生化信號，為細胞提供了一個復雜動態(tài)的微環(huán)境。這些ECM信號調(diào)節(jié)細胞行為在不同維度上會產(chǎn)生不同結(jié)果。例如，在二維和三維培養(yǎng)條件下間充質(zhì)干細胞機械響應的明顯差異已被報道[37]。細胞外基質(zhì)彈性模量是1種動態(tài)特性，在各種生物過程中發(fā)生變化，如疾病進展或傷口愈合。然而，大多數(shù)細胞培養(yǎng)平臺表現(xiàn)出的靜態(tài)特性，并不能有效的研究不同彈性模量對細胞表型及其功能的影響。最近，Lee等[38]便基于聚丙烯酰胺水凝膠，利用偶氮苯分子的光異構(gòu)化，開發(fā)出1種通過光照改變其腫脹和硬度的光響應水凝膠，通過紫外線照射凝膠軟化與可見藍光導致硬化，更好的理解骨髓基質(zhì)干細胞機械傳導信號通路過程。光響應水凝膠作為細胞的三維培養(yǎng)環(huán)境，利用光照可以遠程非接觸的控制其局部的理化特性。最近，Crosby等[39]合成了1種由膠原蛋白和被降冰片烯修飾的透明質(zhì)酸組成的光響應水凝膠正交網(wǎng)絡，通過改變光響應交聯(lián)劑的濃度和順序來調(diào)節(jié)水凝膠的局部剛度和降解性，發(fā)現(xiàn)多能干細胞（induced pluripotentstemcells，iPSCs）在局部血管化程度的差異。該項實驗為研究者提供了1種可用于研究細胞對不同微環(huán)境反應差異的細胞培養(yǎng)平臺。

4.2 結(jié)合微流控平臺的光響應水凝膠用于細胞封裝

微流控是1種可精確控制和操控微尺度流體尤其是亞微米結(jié)構(gòu)的技術(shù)，把生物化學分析過程的樣品制備、反應、分離、檢測等基本操作單元集成到1塊微米尺度的芯片上，自動完成分析過程。同時，微流控系統(tǒng)被認為是快速生產(chǎn)均勻微球（microspheres，MSs）最有效的方法。鑒于光響應水凝膠的光敏特性，光響應水凝膠可以與各種微流控平臺結(jié)合，制造光響應水凝膠微球，將細胞封裝在微球內(nèi)，或者是播種在微球表面，作為微載體，擴展光響應水凝膠的臨床應用范圍。Seeto等[40]以微流控設備為基礎，設計了1種新的微流控平臺，利用PEGDA、GelMA和纖維蛋白原（fibrinogen，PF）光交聯(lián)制備水凝膠微球，將每毫升6×106的細胞均勻封裝在微球中，保持較高的細胞活力和功能活性。微球系統(tǒng)由于其高表面/體積比和仿生環(huán)境，有利于細胞的擴張和移植。He等[41]利用數(shù)字光處理技術(shù)，結(jié)合微流控技術(shù)制備了Gel-MA MSs，并將MSCs細胞封裝在微球內(nèi)，將Gel-MA MSs作為MSCs擴散、遷移和增殖的載體，簡化了細胞培養(yǎng)的操作流程，并構(gòu)建了細胞分布均勻、功能特異的大組織。微流控平臺的高精度能夠更精確地制造仿生顯微組織的微尺度特征，所以能更加準確的封裝細胞并在體外模擬細胞三維微環(huán)境。Zheng等[42]通過微流控平臺將光誘導電沉積（photoinduced electrodeposition，PIED）產(chǎn)生裝載成纖維細胞的海藻酸鹽水凝膠微球重組排列成具有高精度微結(jié)構(gòu)和形態(tài)特征的三維顯微組織。微流控已經(jīng)成為1種通用且對細胞友好的圖案化技術(shù)。水凝膠前體溶液中的懸浮細胞通過微流控系統(tǒng)并不會沉淀到底部，從而能將細胞均勻地封裝到三維水凝膠微球中。在未來光響應水凝膠可利用微流控技術(shù)結(jié)合立體光刻等制造技術(shù)封裝多種細胞，添加調(diào)節(jié)細胞增殖和分化的生物分子合成具有高精度復雜結(jié)構(gòu)的大組織和類器官。

5 光響應水凝膠在口腔醫(yī)學中的應用

細菌感染是導致牙體硬組織與牙周組織破壞的主要原因。全身給藥往往導致致病菌產(chǎn)生耐藥性，增加重復感染的風險。因此近年來，可注射水凝膠作為1種極具前景的局部給藥平臺受到越來越多的關注。水凝膠中加入無機納米粒子或納米纖維是改善水凝膠注射性能的1種簡單而有效的方法。因此，Ribeiro等[43]將環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）和β-環(huán)糊精（β-cyclodextrin，β-CD）包合物摻入靜電紡聚合物纖維中，隨后將其切割成短納米纖維（short nanofibers，SF），嵌入到GelMA中，得到可注射的抗菌水凝膠。實驗結(jié)果表明抗菌水凝膠可維持有效藥物濃度較長時間，對糞腸球菌生物膜有良好的抗菌效果，有助于根除在感染牙周組織、根管系統(tǒng)或根尖周組織中定植的微生物及其毒副產(chǎn)物。β-CD的加入增加了CIP的溶解度和賦予GelMA降解度可調(diào)的特性，同時水凝膠與納米纖維之間動態(tài)的相互作用使水凝膠具有剪切變薄和自愈合的性能。

牙周炎常導致牙周組織，特別是牙槽骨的缺損，甚至是牙齒脫落。當牙周炎病情控制后缺損的牙周組織也很難恢復，將牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）與可注射水凝膠相結(jié)合被認為是治療牙周組織缺損的1個有前途的策略。Ma等[44]制備了不同GelMA/PEGDA體積比的可注射光交聯(lián)水凝膠，并將PDLSCs封裝在此水凝膠中，在大鼠牙槽骨缺損中注射GelMA/PEGDA前體溶液并進行原位紫外光交聯(lián)。此水凝膠作為牙周膜干細胞的運載工具與培養(yǎng)基質(zhì)，減少由于機械力所導致的細胞損傷，同時作為生物支架填補缺損為PDLSCs的生長提供空間。隨后的顯微CT和組織學研究證實，缺損處有明顯的新骨形成。因此，在未來研究當中可進一步對基于光響應水凝膠的ECM成分與干細胞類型的組合篩選，更好地應用于牙周組織工程當中。

綜上所述，水凝膠所具有的親水性，使其在模擬細胞微環(huán)境方面具有天然優(yōu)勢。大多數(shù)聚合物都可以用光響應基團修飾，然后在光照射下發(fā)生多種光反應。因此，許多材料均可通過添加光響應基團制備光響應水凝膠。光響應水凝膠可以動態(tài)指導細胞行為，控制局部微環(huán)境，因此可在不同生物醫(yī)學領域中應用，包括作為支架用于神經(jīng)元的定向遷移、心臟纖維的形成和藥物的光釋放以及細胞培養(yǎng)平臺。然而，利用光響應水凝膠制造支架和封裝細胞時在紫外線照射下形成的自由基可能導致DNA的損傷和細胞功能的損害。為更好的應用臨床，人們利用可見光甚至是紅外光來誘導光反應。此外，使用光響應水凝膠作為體內(nèi)的藥物載體，光的穿透深度有限是限制光響應水凝膠應用的主要原因。同時，光響應水凝膠載藥時光熱轉(zhuǎn)換效率低、生物安全性和生物降解性較低、難以代謝出體內(nèi)、細胞毒性等，仍然是其臨床應用時所需要解決的問題。

在未來光響應水凝膠的研究中，仍將以其光響應特性作為研究重點，通過與多種生物制造技術(shù)如三維生物打印，光刻技術(shù)及微流控技術(shù)等結(jié)合，最大限度地解決光響應水凝膠目前所面臨的困境與使用的局限性。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。