蔣菱玉,楊 燕,王振南* 呂慎金*
(1.臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院,山東 臨沂 276000;2 .臨沂市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,山東 臨沂)
羊人工授精是通過人為采精后將優(yōu)質(zhì)的公羊精液輸入母羊體內(nèi)達(dá)到配種繁殖的一種先進(jìn)實(shí)用型技術(shù)。人工授精可以提高優(yōu)質(zhì)公羊種質(zhì)資源的利用率、減少精液的浪費(fèi)、加速繁殖改良,促進(jìn)育種工作的進(jìn)程,培養(yǎng)出優(yōu)良新品種;便于規(guī)模化羊場(chǎng)集中管理,提高飼養(yǎng)管理效率,降低大規(guī)模的飼養(yǎng)成本;同期發(fā)情、授精、妊娠和產(chǎn)犢,提高母畜的受胎率和飼養(yǎng)管理效率;同時(shí)公母畜無交集,防止生殖道傳染病的傳播;此外,人工授精技術(shù)能克服由于時(shí)間、地區(qū)限制及個(gè)體差異等問題,進(jìn)行跨區(qū)域、跨時(shí)間配種、雜交,擴(kuò)展家畜配種地區(qū)的范圍,是一項(xiàng)十分重要的技術(shù)。本文將從人工授精所需的物品、采精前的準(zhǔn)備、采精、精液品質(zhì)檢查、精液的稀釋和保存、發(fā)情鑒定、輸精、后期管理以及人工授精的注意事項(xiàng)和意義進(jìn)行概括分析,旨在羊生產(chǎn)繁育方面上推廣利用人工授精技術(shù)提供一定的參考。
玻璃棒、載玻片、蓋玻片、廣口瓶、托盤、放栓槍、液氮罐、采精架、采精器、集精杯、水浴鍋、溫度計(jì)、顯微鏡、移液槍、保定架、超聲波清洗機(jī)、高壓消毒鍋、干烤箱等。
恒溫保溫箱(便攜式)、陰道輸精槍、子宮角輸精槍、腹腔內(nèi)窺鏡全套(包括內(nèi)窺鏡、穿刺套針、光源等)、手術(shù)車、B型超聲診斷系統(tǒng)(主機(jī)、腹部探頭)、限位柵欄、0.1 % 高錳酸鉀消毒水、毛巾、衛(wèi)生抽紙、記號(hào)蠟筆、隨身筆記本及筆。
配種之前由專業(yè)人員選擇優(yōu)質(zhì)的種公羊進(jìn)行飼養(yǎng)管理,負(fù)責(zé)保證良好的生活環(huán)境和飼料營(yíng)養(yǎng)的均衡搭配,并每天對(duì)其進(jìn)行身體狀態(tài)檢查和進(jìn)食情況記錄。根據(jù)前 1 d檢查情況及需復(fù)配母羊的品種,選擇性欲旺盛、精子活力強(qiáng)、繁殖力強(qiáng)的合適的公羊品種[1]。
種公羊要定期進(jìn)行采精,第一次采精時(shí)應(yīng)提前進(jìn)行訓(xùn)練,如讓其觀看其他羊的交配活動(dòng),訓(xùn)練成功后才能進(jìn)行采精操作。
采精、輸精以及所有接觸精液的儀器、器械都要進(jìn)行清洗、消毒、烘干存放于消毒柜內(nèi)備用。玻璃棒、集精杯等玻璃器皿洗凈后在 160 ℃環(huán)境下進(jìn)行30 min的蒸氣消毒,不耐高溫的可用紫外線消毒,消毒后放在無菌環(huán)境中保存,下次使用前用生理鹽水反復(fù)沖洗。金屬制品用2 % 的NaHCO3溶液清洗,再用蒸餾水沖洗數(shù)次,擦干后用75 % 的酒精消毒,使用前用生理鹽水沖洗[1]。
采精頻率視種公羊的年齡和體況確定。身體狀況良好、體質(zhì)健壯的成年種公羊每日可采精 2次,體質(zhì)稍差的或年齡較小的公羊可適當(dāng)減少至1次/d,連續(xù)采精 3 d后間隔 1 d,使公羊得到休息。第一次采精的羊可1次/d或隔1日1次[2]。
提前做好個(gè)人衛(wèi)生清潔,同時(shí)對(duì)假陰道和接觸精液的器皿等進(jìn)行洗滌和消毒處理,防止細(xì)菌感染等系列問題造成采精失敗。
采精前先用水清洗種公羊的陰莖和包皮,洗干凈后將公羊引到母羊面前。當(dāng)公羊開始爬跨母羊伸出陰莖時(shí),采精員一只手持假陰道與地面成40o角貼近母羊的臀部,迅速用另一只手拖住陰莖插入到假陰道中。公羊表現(xiàn)出明顯的向前沖的動(dòng)作時(shí)為正在射精,該過程很快,此時(shí)采精員要迅速將精液采集到集精瓶中,采集完后在瓶上記錄好公羊號(hào),將集精瓶送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)精液品質(zhì)的檢查。采精結(jié)束后將假陰道進(jìn)行消毒,以便下次使用[3]。
采精過程必須經(jīng)過嚴(yán)格的消毒技術(shù),采精用到的所有物品都要經(jīng)過消毒后才能使用,避免引起疾病和感染。采精工作必須由熟練、細(xì)致的專業(yè)人員操作,且嚴(yán)格控制采精器械的環(huán)境溫度在40~42 ℃[4]。
為達(dá)到良性配種的目的,對(duì)母羊輸精時(shí)要選擇優(yōu)質(zhì)的精液。通過精液品質(zhì)檢查來評(píng)定采集精液的優(yōu)劣,從而決定該精液能否對(duì)母羊進(jìn)行輸精。精液品質(zhì)檢查還能根據(jù)精液的濃稠程度確定稀釋的比例,以便對(duì)精液密度的測(cè)定。
(1)顏色:優(yōu)質(zhì)的精液為乳白色,質(zhì)地較為濃稠,劣質(zhì)精液會(huì)出現(xiàn)紅色、褐色或綠色。
(2)氣味:優(yōu)質(zhì)的精液無味,有時(shí)會(huì)略帶腥味,劣質(zhì)精液有腐敗、發(fā)臭的異味。
(3)精液量:公羊的射精量與品種、年齡、飼養(yǎng)水平、采精頻率、采精技術(shù)等有關(guān)。正常公羊一次采集的精液量通常在0.5~2.0 ml范圍內(nèi)[5]。
4.2.1 精子活力 精子的活力是判斷精子質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo),通常根據(jù)顯微鏡下觀察精子的活躍度來判斷,分為 10個(gè)等級(jí)。活力的檢查方法是用移液槍取 10 μl新鮮精液滴于載玻片中央,用蓋玻片緩緩蓋上,盡量減少氣泡的產(chǎn)生,在40或 100倍顯微鏡下觀察精子的活躍程度。精子的運(yùn)動(dòng)方式有直線運(yùn)動(dòng)、原地?cái)[動(dòng)和靜止,只有呈直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子才具有受精能力。視野中所有精子都做高速直線運(yùn)動(dòng)的精液活力為 1.0,直線運(yùn)動(dòng)的精子在 90 % 以上、僅少數(shù)為原地?cái)[動(dòng)或靜止?fàn)顟B(tài)時(shí),活力為 0.9,依次類推。凡活力在 0.6以上的精液都屬于優(yōu)質(zhì)精液,受精能力較強(qiáng),而活力低于 0.5的精液屬于劣質(zhì)精液,生存能力較差,應(yīng)舍棄不宜使用[6]。
4.2.2 精子的密度 精子的密度指每1 ml的精液中所含的精子的數(shù)目,實(shí)驗(yàn)室一般用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算。粗略判斷精子密度的方法是用移液槍取10 μl新鮮精液滴于載玻片中央,用蓋玻片緩緩蓋上,盡量減少氣泡的產(chǎn)生,將制好的載玻片放在顯微鏡下觀察精子的密集程度,分為密集、中等、稀疏三個(gè)等級(jí)[7]。視野中精子緊密排列,精子之間的距離極小屬于“密”;精子之間的距離較大,各精子之間仍能容納下 1個(gè)精子的距離屬于“中”;精子之間排列松散、距離很大時(shí)屬于“稀”。精確計(jì)算精子的密度時(shí)可先將精液按一定比例稀釋,然后置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上,在顯微鏡下數(shù)每個(gè)中格中的精子數(shù)目,連續(xù)數(shù) 5個(gè),共數(shù)3次,取3次的平均值進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算1 ml精液中的精子數(shù)目。結(jié)果大于 25億個(gè)/ml的精液為“密”,20~25億個(gè)/ml為“中”,少于20億個(gè)/ml為“稀”。優(yōu)質(zhì)精液的數(shù)量通常都高于 20億個(gè)/ml,除精液未混勻等其他不當(dāng)人工檢查操作,等級(jí)為“稀”的均為劣質(zhì)精液,應(yīng)舍棄。
檢查過程中要求操作嚴(yán)謹(jǐn),數(shù)據(jù)可靠,檢測(cè)合格的精液才能用于輸精;精液稀釋后和使用前均需進(jìn)行品質(zhì)檢查;精液品質(zhì)檢查要在 20~25 ℃室溫且干凈的環(huán)境中進(jìn)行,鏡溫要保證在 30 ℃以上,檢查過程要迅速而準(zhǔn)確,避免時(shí)間過久或溫度不適宜造成精子活力的降低甚至死亡[8]。
精子的一定活力和足夠的劑量是保證受精的前提,適當(dāng)?shù)膶⒕哼M(jìn)行稀釋不僅可以為精子提供營(yíng)養(yǎng),提高精子活力,還能擴(kuò)大精液量,將有限的精子輸給更多的母羊,提高種公羊的利用率。通過前期精液品質(zhì)檢查對(duì)精子密度的計(jì)算確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù),保證稀釋后的精液具有正常的活力,符合用于輸精的精液標(biāo)準(zhǔn)。
5.1.1 稀釋液的配制 稀釋液有多種配方,如奶汁稀釋液、生理鹽水稀釋液、葡萄糖卵黃稀釋液等,均呈弱酸性,對(duì)減少精子的活動(dòng)、延長(zhǎng)精子的存活時(shí)間具有顯著的作用。在羊精液稀釋的生產(chǎn)實(shí)踐中使用最多的是生理鹽水稀釋液,原料成本低、操作簡(jiǎn)單。采集到精液后直接注射生理鹽水稀釋即可,也可以用提前進(jìn)行過濾和消毒的0.9 % 的氯化鈉溶液稀釋,通??上♂?2~3倍。此配方稀釋的精液保存時(shí)間較短,稀釋后的精液常溫下只能保存 6 h,生產(chǎn)中要現(xiàn)用現(xiàn)配,且稀釋倍數(shù)較低。當(dāng)稀釋倍數(shù)較大時(shí)可使用奶汁稀釋液或葡萄糖卵黃稀釋液,雖然配制方法較生理鹽水稀釋液復(fù)雜,但營(yíng)養(yǎng)成分高,可為精液提供營(yíng)養(yǎng),且稀釋倍數(shù)高至7倍[9]。
5.1.2 操作步驟 通過精液密度的檢查確定出需要稀釋的倍數(shù),在無菌的環(huán)境中將稀釋液和精液在同一溫度下混合,通過輕輕攪拌或輕微晃動(dòng)的方式混勻。加入稀釋液時(shí)要沿玻璃棒緩緩倒入,避免導(dǎo)入氣泡。精液稀釋后,取一滴樣品于顯微鏡下觀察其活力,并將檢查結(jié)果記錄在采精登記表上。
5.1.3 注意的事項(xiàng) 精液與稀釋液混合前要放置在同一個(gè)盛有溫水的燒杯中,或放置在35℃水浴鍋中,使二者溫度保持一致,避免混合時(shí)溫度差對(duì)精子活力的影響。精液稀釋操作應(yīng)在干凈、無菌的室溫環(huán)境下進(jìn)行,防止外界環(huán)境條件對(duì)精子的影響。稀釋倍數(shù)通常在 2~3倍,稀釋后的精液中精子數(shù)目不低于4億個(gè)/ml[10]。
稀釋后的精液根據(jù)需要輸精的量裝入小試管中,封好口避免灑出,試管規(guī)格通常在 2~5 ml,試管中的精液量不能超過容量的 2/3。精液裝好后在試管外貼上標(biāo)簽紙注明該精液對(duì)應(yīng)的公羊品種、采集時(shí)間和精液品質(zhì),放在室溫下使其自然降溫。
運(yùn)輸距離較近時(shí),可將精液保存在5 ml小試管中,放在保溫瓶中即可,但精液量不能超過試管容量的 2/3,同時(shí)注意將試管口封好避免運(yùn)輸過程中精液灑出。運(yùn)輸距離遠(yuǎn)時(shí),需要將精液在低溫或冷凍條件下保存,且運(yùn)輸途中避免劇烈振蕩,以減少精子在運(yùn)輸過程中的死亡。運(yùn)輸?shù)木憾家⒚骶旱膩碓?、精液量、采集時(shí)間、精子活力和精子密度。
精液在體外的保存效果受多種因素的影響,溫度對(duì)其影響最為顯著。精液有 3種保存方式:室溫保存、低溫保存和冷凍保存。不同溫度下,精子的活動(dòng)能力、運(yùn)動(dòng)速率、代謝水平都有較大差異。
精液在室溫下保存的溫度在 20 ℃ 左右,此時(shí)運(yùn)動(dòng)能力較弱,活力較低,因此存活時(shí)間較長(zhǎng),可保存 1 d;精液在 0~5 ℃ 低溫保存時(shí),代謝水平低、活動(dòng)較慢,產(chǎn)生的代謝廢物減少,活力和活率較高,且保存成本低、運(yùn)輸方便,保存時(shí)間也可延長(zhǎng)至 2~3 d;冷凍保存指將精液保存在液氮貯精罐(-196 ℃)中,以極低的溫度長(zhǎng)期冷凍保存,從而達(dá)到延長(zhǎng)精液壽命的目的。使用時(shí)提前將精液解凍,解凍后的精子活動(dòng)能力較低,受精能力下降。此方法是保存時(shí)間最長(zhǎng)的一種方式,可將精液長(zhǎng)期保存,目前在實(shí)驗(yàn)室相關(guān)研究中被廣泛應(yīng)用[11-13]。
適時(shí)配種是保證羊人工授精成功與否的關(guān)鍵。通過觀察母羊的生理表現(xiàn)、外陰部腫脹程度、黏液性狀可判斷母羊是否發(fā)情[14]。在發(fā)情初期,母羊不安游走、食欲不振、嘶叫。母羊接受公羊爬跨,外陰部腫脹發(fā)紅,陰道潤(rùn)滑,流出玻璃狀的白色黏液,這時(shí)即為發(fā)情盛期。
輸精前要對(duì)所有輸精器械進(jìn)行高溫消毒殺菌,輸精員帶好口罩,身著無菌的操作服,用酒精和生理鹽水對(duì)手進(jìn)行清洗,同時(shí)保證操作環(huán)境的無菌。提前將備好的精液放置在 35 ℃ 恒溫水浴鍋中,取一滴樣品放在顯微鏡下觀察,檢查合格后才可用于輸精[15]。準(zhǔn)備好后將身體狀況良好、發(fā)情鑒定完畢的母羊安置好,蘸取 0.1 % 高錳酸鉀溶液擦拭母羊外陰部進(jìn)行清洗消毒,避免授精時(shí)對(duì)母羊的生殖器官造成感染,消毒完后開始準(zhǔn)備輸精。
輸精前先對(duì)母羊的外陰部進(jìn)行消毒和擦拭,在母羊發(fā)情排卵時(shí)用開腔器深入陰道內(nèi)將子宮口打開,隨后將輸精槍慢慢插入到子宮頸,深度在0.5~1.0 cm處時(shí)將精液緩緩注入,待精液全部輸入母羊體內(nèi)后,緩慢將輸精槍取出[16]。輸精完畢后,讓羊保持原姿勢(shì)停留5~10 min后再將其驅(qū)走。
輸精過程中插入開腔器和輸精槍時(shí)都應(yīng)緩慢操作,否則易劃傷母羊的生殖道,同時(shí)引起母羊弓背努責(zé)導(dǎo)致胸腔內(nèi)血壓增高、子宮平滑肌收縮[17],不易確定子宮頸的位置,給深部輸精工作造成困難。
母羊的發(fā)情時(shí)間很短且無法準(zhǔn)確把握,通常在早晚各試情一次,試情后對(duì)母羊進(jìn)行第 1次輸精,間隔時(shí)間 8 h最適宜,8 h后進(jìn)行第 2次輸精,再過 8 h進(jìn)行第 3次輸精。3次輸精的配種率較高[18],而對(duì)于技術(shù)純熟、經(jīng)驗(yàn)豐富的配種員進(jìn)行2次輸精即可[19]。
母羊的發(fā)情期較短,因此在發(fā)情時(shí)需及時(shí)進(jìn)行輸精。母羊發(fā)情期內(nèi)一般每隔8~10 h進(jìn)行一次輸精,共輸 2次。輸精的關(guān)鍵是要保證充足的輸精量,若輸入的精液為原精液,則輸 0.05~0.10 ml;若將精液稀釋后再輸精,則根據(jù)稀釋倍數(shù)輸入相應(yīng)的0.1~0.2 ml的稀釋精液[20]。
(1)有條件的應(yīng)盡可能采用鮮精輸精,鮮精輸精和凍精輸精相比,活力和活率更高,運(yùn)動(dòng)速率更快,便于觀察操作。
(2)子宮頸輸精時(shí)用 0.1 % 高錳酸鉀溶液或稀釋 15倍的 5 % 新潔兒滅溶液清洗干凈外陰及周圍部位并用消毒紙巾擦干后,應(yīng)用生理鹽水再噴洗一遍(生理鹽水可置于噴壺內(nèi)),擦干后再進(jìn)槍,輸精槍盡量不與外部相觸碰,雙手撐開陰唇后借助開殖器等將輸精槍直接伸入陰道,接觸精液的器械盡可能避免不接觸殺精物品,外陰清洗最好選用新潔兒滅溶液,因?yàn)樾聺崈簻巛^高錳酸鉀刺激性更小,對(duì)精子的危害相對(duì)更小[21]。
(3)子宮頸深處輸精,輸精槍進(jìn)入子宮頸內(nèi) 1 cm左右深處后即可打入精液,一邊打精液一邊退槍,輸精槍進(jìn)入子宮頸內(nèi)時(shí)要順勢(shì)緩慢推入(發(fā)情母羊子宮頸口微張),不可強(qiáng)硬捅插,以免捅傷母羊子宮頸,造成子宮頸發(fā)炎、粘連等繁殖疾病[22]。
(4)子宮頸輸精,打入精液退槍后,保持母羊倒立狀態(tài) 0.5 min左右,可在母羊背部拍一巴掌,讓母羊抽搐收縮子宮頸,便于精液流入子宮內(nèi)[23]。
(5)子宮頸輸精一般在母羊發(fā)情后6~8 h進(jìn)行第一次輸精,8 h后進(jìn)行復(fù)配;腹腔內(nèi)窺鏡子宮角輸精應(yīng)在母羊發(fā)情后24 h內(nèi)完成,以發(fā)情后12~24 h輸精為宜[24]。
(6)母羊配種18~22 d后用公羊進(jìn)行試情,有發(fā)情表現(xiàn)的母羊進(jìn)行補(bǔ)配。
(7)輸精操作前后應(yīng)對(duì)器械進(jìn)行清洗消毒,包括B超儀探頭等,探頭是換能器,是B超儀的主要、重要部件,關(guān)系到孕檢的可行性和準(zhǔn)確性,必須輕拿輕放,不能損壞[25]。
填寫?zhàn)B殖檔案,記錄種公羊品種、種公羊號(hào)、母羊品種、母羊號(hào)、母羊年齡、發(fā)情時(shí)間、輸精時(shí)間、胎次和精子活率等配種信息,便于技術(shù)人員了解母羊的具體情況。
妊娠后,母羊明顯表現(xiàn)出食欲增加、營(yíng)養(yǎng)狀況改善、體重增長(zhǎng)加快、皮毛有光澤,同時(shí)體內(nèi)新陳代謝更加旺盛,消化能力大大提高。配種后的母羊是否再次發(fā)情是判定妊娠依據(jù),但不是母羊妊娠的必要依據(jù),需要具體檢測(cè)。檢測(cè)妊娠可應(yīng)用 B超,在母羊輸精后 60 d左右對(duì)其進(jìn)行直腸檢查,如檢查發(fā)現(xiàn)卵巢上出現(xiàn)持續(xù)黃體、變硬,子宮內(nèi)膜增生,子宮角兩側(cè)不對(duì)稱,子宮壁變厚,有胚泡出現(xiàn),可判斷為妊娠?;蛘吣秆蜉斁?0 d后無重復(fù)發(fā)情同樣可視為妊娠[26]。
(1)同期發(fā)情的母羊要空懷,可通過 B超儀檢測(cè),不然用藥會(huì)流產(chǎn),造成經(jīng)濟(jì)損失。
(2)提前 1個(gè)月左右加強(qiáng)對(duì)采精公羊的飼養(yǎng)管理,提高公羊的飼料營(yíng)養(yǎng),促進(jìn)身體健康狀況,同時(shí)定期進(jìn)行采精訓(xùn)練,有利于提高采集的精子的質(zhì)量。
(3)給母羊放置黃體酮陰道栓(PRID)時(shí),栓槍頭應(yīng)涂抹適量滅菌潤(rùn)滑劑,以方便栓槍進(jìn)出,不傷母羊陰道;埋置 PRID時(shí),若外留線過長(zhǎng)需剪掉過長(zhǎng)部分(外留 12~15 cm即可),外留線過長(zhǎng)陰道栓易被羊只咬拉出來,造成誘導(dǎo)發(fā)情失敗[27]。
(4)最好選擇發(fā)情好、性欲強(qiáng)、身體健壯的母羊做臺(tái)羊;采精前,在采精器夾層內(nèi)注入適量溫水,將溫度調(diào)至 37~40 ℃,在內(nèi)胎上口至下1/3~1/2處涂抹滅菌潤(rùn)滑劑,最后吹氣加壓,盡量模擬母羊陰道環(huán)境,讓公羊在采精時(shí)感到舒適愉悅,才能采到更多、質(zhì)量更好的精液;集精杯使用時(shí)應(yīng)在杯外套上杯套,冬天起到保溫防凍、夏天起到遮陽防曬的功效,可有效保護(hù)精子,以免降低精子質(zhì)量。
隨著人們對(duì)羊產(chǎn)品的消費(fèi)需求日益增高,羊人工授精技術(shù)對(duì)羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)起重要的保障作用。羊人工授精技術(shù)是一種科學(xué)配種方法,技術(shù)手段成熟,目前在羊養(yǎng)殖業(yè)已被廣泛推廣應(yīng)用。但由于部分養(yǎng)殖場(chǎng)衛(wèi)生環(huán)境條件較差、精液的質(zhì)量得不到保證,往往會(huì)導(dǎo)致受胎率偏低。同時(shí),有些養(yǎng)殖場(chǎng)缺乏專業(yè)的采精人員,人手不足或技術(shù)不嫻熟、操作細(xì)節(jié)把握不得當(dāng),導(dǎo)致輸精不成功或?qū)δ秆蛏车涝斐蓳p傷。
未來應(yīng)注重改善養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境,保證精液的質(zhì)量;總結(jié)母畜發(fā)情經(jīng)驗(yàn),減少盲目放對(duì);加大對(duì)專業(yè)人員的技能培訓(xùn),提高操作人員的技術(shù)水平,確保每一名工作人員都能夠詳細(xì)的掌握人工授精技術(shù)要點(diǎn),提高母羊受精率,降低母羊感染等相關(guān)問題。國(guó)家鼓勵(lì)專業(yè)相關(guān)技術(shù)人員深入養(yǎng)殖群體,開展有效的宣傳帶動(dòng)活動(dòng),在人工授精方面實(shí)現(xiàn)創(chuàng)新和突破,不斷學(xué)習(xí)和引進(jìn)專業(yè)知識(shí),構(gòu)建人工授精的專業(yè)知識(shí)體系,加快羊人工授精技術(shù)的普及,實(shí)現(xiàn)羊產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質(zhì)、高效發(fā)展。