裴云霞，曹 健，汪長江，胡興宜，倪天虹，管蘭華，杜克兵*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院，武漢 430070；2.湖北省林業(yè)局林木種苗管理總站，武漢 430079；3.湖北省林業(yè)科學(xué)研究院，武漢 430075)

楓香(LiquidambarformosanaHance)為金縷梅科(Hamamelidaceae)楓香屬(Liquidambar)的高大落葉喬木，廣泛分布于長江流域以南地區(qū)，是我國重要的經(jīng)濟(jì)用材和秋色葉觀賞樹種.由于扦插繁殖生根率較低，生產(chǎn)中楓香主要以播種和嫁接繁殖為主.但播種繁殖的苗木遺傳分化大，質(zhì)量參差不齊；嫁接繁殖又受季節(jié)限制，需要繁殖砧木，生產(chǎn)成本較高[1-3].組織培養(yǎng)具有繁殖系數(shù)高、不受季節(jié)限制、生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)，成為了楓香優(yōu)株無性繁殖和利用的重要途徑之一.當(dāng)前，已有少量關(guān)于楓香組培快繁技術(shù)的研究.許林[4]以楓香的帶芽莖段為外植體開展組培快繁研究，最大增殖系數(shù)達(dá)到5.3.王澤偉等[5]以北美楓香(L.styraciflua)為母本，中國楓香為父本進(jìn)行雜交，選用雜種子代的子葉、子葉節(jié)和下胚軸作為外植體，建立了離體快繁體系.李穎楠[2]用楓香種子為外植體進(jìn)行了組織培養(yǎng)研究.李亮[6]以莖段為外植體，建立了楓香、楓香“變異體”、細(xì)柄阿丁楓(Altingiagracilipes)以及半楓荷(Semiliquidambarcathayensis)的離體快繁體系，最大增殖系數(shù)達(dá)到7.0.總體來看，目前報(bào)道的文獻(xiàn)中以楓香優(yōu)株的莖段作為外植體，開展優(yōu)株無性繁殖的研究還不多，且增殖系數(shù)多數(shù)不高，還有很大的發(fā)展空間.在湖北省楓香種質(zhì)資源調(diào)查的基礎(chǔ)上，篩選出了2個速生優(yōu)株和1個紅葉優(yōu)株.為加快這3個優(yōu)株的繁殖和應(yīng)用，本研究以其帶芽莖段為試驗(yàn)材料，進(jìn)行了組培快繁研究，以期建立起高效的組培快繁體系，并探索不同優(yōu)株對培養(yǎng)基成分響應(yīng)的差異.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為湖北省紅安縣野外選優(yōu)獲得的楓香優(yōu)良單株1#(HA-1)、2#(HA-2)和3#(HA-3).其中，HA-1為觀賞用優(yōu)良單株，其特點(diǎn)是秋季葉色紅艷美觀且持續(xù)時(shí)間長，樹高18.9 m、胸徑41.6 cm；HA-2和HA-3為采用五株優(yōu)勢木法篩選的材用優(yōu)良單株，特點(diǎn)是速生且樹干通直；其中HA-2樹高31.1 m、胸徑44.6 cm，HA-3樹高33 m、胸徑60.4 cm.選取來自3株優(yōu)株樹干中部的當(dāng)年生半木質(zhì)化帶芽莖段作為外植體材料.

1.2 培養(yǎng)條件

所有培養(yǎng)基均以WPM+3.0%蔗糖+0.7%瓊脂為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基pH值為5.8，于121 ℃、110 kPa下滅菌20 min.之后所有材料均置于(25±2)℃的組培室內(nèi)培養(yǎng)，隨機(jī)排列，光照條件為1 500～2 000 lx，光照時(shí)間為16 h/d.

1.3 初代培養(yǎng)

將3種試材取長2～3 cm的帶芽莖段，采用張燁然等[7]的方法進(jìn)行消毒(采用0.1%氯化汞，消毒時(shí)間調(diào)整為10 min)，隨后接種于添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑的初代培養(yǎng)基中，生長調(diào)節(jié)劑組合的比例在參考路佳[8]、雷莎[9]、龔崢等[10]的基礎(chǔ)上設(shè)定，包括6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、激動素(KT)、萘乙酸(NAA)和吲哚丁酸(IBA).每種培養(yǎng)基接種30個外植體，3次重復(fù)，每次重復(fù)接種10瓶，每瓶接種1個外植體，隨機(jī)排列，激素組合編號為初代培養(yǎng)(initial culture)(簡稱IC).接種30 d后統(tǒng)計(jì)腋芽萌發(fā)率，篩選3種試材的最適初代培養(yǎng)基.

1.4 增殖培養(yǎng)

待腋芽生長至1～2 cm時(shí)，將幼芽切下接種到添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑的增殖培養(yǎng)基中，生長調(diào)節(jié)劑組合的比例在參考李穎楠[2]、路佳[8]、吳麗君[11]、張富榮等[12]的基礎(chǔ)上設(shè)定，包括6-BA、NAA、赤霉素(GA3)、玉米素(ZT)和油菜素內(nèi)酯(BR).每種培養(yǎng)基接種30個外植體，5次重復(fù)，每次重復(fù)接種6瓶，每瓶接種1個外植體，隨機(jī)排列，激素組合編號為增殖培養(yǎng)(proliferation culture，PC).接種40 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)，并觀測無菌苗的葉色、芽叢平均高度、愈傷組織大小和顏色等情況，篩選3種試材的最適增殖培養(yǎng)基.增殖系數(shù)的計(jì)算公式為：A=B/C；其中A為增殖系數(shù)，B為接種40 d時(shí)的有效芽數(shù)(個)，C為接種芽總數(shù)(個)，以高度達(dá)1 cm的芽記為有效芽[7].

1.5 生根培養(yǎng)

取高于2 cm的叢生芽為試材，接入含不同植物生長調(diào)節(jié)劑(NAA、IBA)的生根培養(yǎng)基中,生長調(diào)節(jié)劑組合的比例在參考李穎楠[2]、龔崢等[10]的基礎(chǔ)上設(shè)定.每種培養(yǎng)基接種30個外植體，5次重復(fù)，每次重復(fù)接種6瓶，每瓶接種1個外植體，隨機(jī)排列.生根率的計(jì)算公式為：D=E/F×100；其中D為接種40 d后統(tǒng)計(jì)的生根率，E為生根苗數(shù)(個)，F(xiàn)為總苗數(shù)(個).通過統(tǒng)計(jì)生根率、根數(shù)、根長和側(cè)根生長狀況等，篩選3種試材的最佳生根培養(yǎng)基.

1.6 試管苗移栽

生根苗培養(yǎng)40 d后，打開瓶蓋置于自然條件下煉苗.7 d后取出生根苗，洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽于營養(yǎng)土∶沙(1∶1)的方形營養(yǎng)缽中(11 cm×11 cm)，覆塑料杯保濕.每個營養(yǎng)缽1株，15 d后移去塑料杯.40 d后統(tǒng)計(jì)成活率，并記錄生長狀況.

表1 不同培養(yǎng)基對楓香腋芽萌發(fā)的影響Tab.1 Effects of different media on axillary bud germination of L.formosana

(a) HA-1 (b) HA-2 (c) HA-3圖1 接種30 d時(shí)的腋芽萌發(fā)情況Fig.1 Axillary bud germination after 30 days inoculation

2 數(shù)據(jù)處理

圖表中的數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3).采用SAS8.1軟件進(jìn)行方差分析與多重比較(Duncan′s)，百分?jǐn)?shù)經(jīng)過反正弦轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行方差分析.

3 結(jié)果與分析

3.1 初代培養(yǎng)分析

植物激素6-BA、KT、NAA和IBA均對腋芽萌發(fā)有促進(jìn)作用，3種試材的適宜培養(yǎng)基有所不同(見表1).HA-1在組成包括1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA(IC3)的培養(yǎng)基中腋芽萌發(fā)率最高，達(dá)到100%；HA-2和HA-3均在組成包括1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA(IC1)的培養(yǎng)基中腋芽萌發(fā)率最高，分別為100%和33.3%(表1和圖1).

3.2 增殖培養(yǎng)分析

3種試材在不同培養(yǎng)基中的增殖系數(shù)和芽叢平均高度存在顯著差異(見表2).相比于對照組(PC1)，添加6-BA、NAA和GA3能顯著增加3種試材的增殖系數(shù)和芽叢高度.就增殖系數(shù)而言，HA-1在PC9中效果最好，增殖系數(shù)為4.6；HA-2在PC3中效果最好，增殖系數(shù)達(dá)9.0；HA-3則在PC14中效果最好，增殖系數(shù)為4.4.就芽叢高度而言，HA-1在PC15中最高，約為2.5 cm；HA-2和HA-3則在PC16中最高，分別為2.3 cm和3.5 cm.對比圖2和圖3，可知添加GA3可有效促進(jìn)幼芽的高度增長.綜合而言，HA-1在組成包括2.0 mg/L6-BA+0.05 mg/L NAA的培養(yǎng)基中增殖效果較好，增殖系數(shù)為4.6，芽叢平均高度為1.6 cm，幼芽生長正常；HA-2的最適增殖培養(yǎng)基組成包括1.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA，增殖系數(shù)為9.0，芽叢平均高度為1.9 cm，幼苗生長健壯.HA-3的最適增殖培養(yǎng)基組成包括1.0 mg/L 6-BA+0.03 mg/L NAA+1.0 mg/L GA3，增殖系數(shù)為4.4，芽叢平均高度為1.8 cm.

表2 不同培養(yǎng)基對楓香試管苗增殖的影響Tab.2 Effects of different culture media on shoot proliferation of L.formosana

(a) HA-1 (b) HA-2 (c) HA-3圖2 未添加GA3的培養(yǎng)基中生長40 d的情況Fig.2 Growth for 40 days in medium without GA3

(a) HA-1 (b) HA-2 (c) HA-3圖3 添加32 mg/L GA3的培養(yǎng)基中生長40 d的情況Fig.3 Growth for 40 days in medium with 32 mg/L GA3

ZT和BR被認(rèn)為是新型植物生長調(diào)節(jié)劑.本研究以HA-3為試材，設(shè)置了16種含不同濃度ZT和BR的增殖培養(yǎng)基，探究2種激素對楓香組培苗生長的影響(見表3).結(jié)果表明，HA-3在16種培養(yǎng)基中的增殖系數(shù)均較低，最大增殖系數(shù)僅為1.5(PC11)，芽叢平均高度最大為2.8 cm(PC12)，愈傷組織直徑大小不一，介于0.2～1.1 cm之間.同時(shí)發(fā)現(xiàn)，BR對幼苗的葉色和葉片大小產(chǎn)生了明顯影響.當(dāng)BR濃度為0.03 mg/L和0.06 mg/L時(shí)，葉片變小、顏色偏紅；BR濃度升高至0.2 mg/L時(shí)，無菌苗的葉色為深綠色，葉片較大(見圖4).

表3 ZT和BR對HA-3試管苗增殖的影響Tab.3 Effects of ZT and BR on shoot proliferation of HA-3

3.3 生根培養(yǎng)與移栽

3種試材在不添加激素的培養(yǎng)基中均未生根，添加一定濃度的NAA和IBA可顯著促進(jìn)生根，但不同試材之間的生根率和根系形態(tài)明顯不同(見表4).HA-1在含1.0 mg/L IBA的培養(yǎng)基中生根率最高為30%，平均根數(shù)為1.4條，平均根長為0.36 cm，無愈傷組織形成，根系細(xì)長，且有二級側(cè)根形成.HA-2在添加1.0 mg/L IBA的培養(yǎng)基中生根率達(dá)到80%，平均根數(shù)與根長達(dá)到最大值，分別為2.6條與1.43 cm，無愈傷組織形成，根系細(xì)長，二級側(cè)根數(shù)量較少；在添加0.3 mg/L NAA、0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA的培養(yǎng)基中生根率均達(dá)到60%.HA-3在含0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基中的生根率為20%，平均根數(shù)最多為0.8條，平均根長為0.21 cm，有愈傷組織形成，直徑約為0.6 cm，根系呈短粗型，無二級側(cè)根形成.HA-3在含1.0 mg/L IBA培養(yǎng)基中的生根率同樣為20%，但根系性狀明顯不同，其平均根數(shù)為0.4條，平均根長為0.28 cm，無愈傷組織形成，根系為細(xì)長型，且二級側(cè)根數(shù)量較多.

(a) PC13 (b) PC11 (c) PC15圖4 HA-3生長40 d的增殖情況Fig.4 Proliferation of HA-3 growth for 40 days

可見，HA-1、HA-2和HA-3對不同激素組合的響應(yīng)有所不同，不僅生根率有差異，根系形態(tài)也明顯不同(見圖5).綜合而言，可選擇組成包括WPM +3.0%蔗糖+0.7%瓊脂+1.0 mg/L IBA的培養(yǎng)基作為三者的生根培養(yǎng)基.生根苗移栽40 d后，3種試材的成活率均可達(dá)到100%，且幼苗生長健壯(見圖6).

表4 生長調(diào)節(jié)劑對楓香試管苗生根的影響 Tab.4 Effects of hormones on rooting of L. formosana

(a) HA-1 (b) HA-2 (c) HA-3圖5 生長40 d的生根情況Fig.5 Rooting culture for 40 days

4 討論

生長素和細(xì)胞分裂素是組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)細(xì)胞分裂、分化和器官形成最重要的兩類植物激素[13].在已有文獻(xiàn)中，6-BA、NAA、IBA、KT、ZT是組織培養(yǎng)使用較多的激素種類，其中NAA和IBA屬于生長素類，具有促進(jìn)莖伸長、細(xì)胞分裂和分化的作用；6-BA、KT、ZT作為細(xì)胞分裂素類物質(zhì)，能夠加速細(xì)胞分裂，促使細(xì)胞分化和形態(tài)的形成.由于組織培養(yǎng)當(dāng)中植物激素之間存在互相促進(jìn)和抑制作用，故在組織培養(yǎng)中多采用不同激素配合使用的方法.通常，較高的生長素和細(xì)胞分裂素比例能促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖，但激素的類別和濃度的選擇是組織培養(yǎng)中的難點(diǎn).

(a) HA-1 (b) HA-2 (c) HA-3圖6 組培苗移栽后的生長情況Fig.6 Transplanted tissue culture seedlings

楓香的組織培養(yǎng)過程中，也需要添加各種激素以保證植物的正常生理活動.許林[4]發(fā)現(xiàn)在添加0.75 mg/L 6-BA 和0.1 mg/L NAA的培養(yǎng)基中，楓香的腋芽萌發(fā)率可達(dá)到100%.美國楓香(L.styraclflua)在含有1.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA 和0.1 mg/L KT的培養(yǎng)基中腋芽萌發(fā)率可達(dá)96%[9].本研究以楓香帶芽莖段為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，通過選擇6-BA、NAA、IBA和KT作為促進(jìn)腋芽萌發(fā)的激素，通過觀察腋芽萌發(fā)率和生長狀態(tài)，最終表明1.5 mg/L 6-BA、0.05 mg/L NAA、0.1 mg/L IBA和1.0 mg/L KT為HA-1腋芽萌發(fā)的最佳激素組合.而HA-2和HA-3均在含有1.0 mg/L 6-BA、0.05 mg/L NAA的培養(yǎng)基中腋芽萌發(fā)率最高，分別為100%和33.3%.

楓香增殖培養(yǎng)階段，為了試驗(yàn)出生長狀態(tài)正常的繼代苗和較高的增殖系數(shù)，本研究分析了6-BA 、NAA和GA3對3株優(yōu)株增殖的影響.選擇0～3 mg/L 6-BA、0～0.05 mg/L NAA和1～32 mg/L GA3作為增殖培養(yǎng)的激素配比.結(jié)果顯示，與初代培養(yǎng)相似，3種試材的增殖培養(yǎng)效果亦顯著不同.就6-BA而言，HA-1在含有2.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基中的增殖效果最好，增殖系數(shù)為4.6；而HA-2和HA-3則更適合在6-BA質(zhì)量濃度較低的培養(yǎng)基中增殖，這一結(jié)果與李穎楠[2]、路佳[8]等的研究結(jié)果相似.就NAA而言，適宜3株優(yōu)株生長的濃度亦有所不同；HA-1適宜較高質(zhì)量濃度，即0.05 mg/L的NAA，而HA-2和HA-3則在添加較低質(zhì)量濃度NAA的培養(yǎng)基中的增殖效果最佳，分別為0.01 mg/L和0.03 mg/L.綜合分析可知，3種試材對相同激素組合的增殖響應(yīng)顯著不同：激素濃度較高更有利于HA-1的不定芽萌發(fā)，HA-2和HA-3則更適宜較低激素濃度的培養(yǎng)基.造成這種差異的原因可能與試驗(yàn)材料的基因型、年齡或取材部位有關(guān).

植物組織培養(yǎng)中，GA3、ZT和BR也有大量應(yīng)用.GA3屬于四環(huán)二萜類激素，是常用的赤霉素，能夠調(diào)控莖伸長、葉片擴(kuò)大和開花等過程，但不能增加叢生芽的數(shù)量[11,14-15].本研究中，在6-BA和NAA質(zhì)量濃度相同的條件下，GA3的質(zhì)量濃度較高和較低均會抑制HA-1的生長，而在添加中等質(zhì)量濃度(16 mg/L) GA3的培養(yǎng)基中芽叢平均高度明顯增加.HA-2和HA-3則在高質(zhì)量濃度(32 mg/L) GA3培養(yǎng)基中平均高度明顯更高，這與楓香[4]、葡萄(Vitisvinifera)[16]、紅葉石楠(Photiniafraseri)[11]等的研究結(jié)果一致.ZT作為一種細(xì)胞分裂素，可調(diào)節(jié)植物組織器官的生長發(fā)育；BR則參與植株光形態(tài)建成、細(xì)胞分化、開花結(jié)實(shí)以及衰老等過程[13].本研究中，當(dāng)ZT和BR的質(zhì)量濃度低于0.2 mg/L時(shí)，3種試材的增殖系數(shù)和芽叢高度均無顯著變化，這與廉家盛等[17]和寧志怨等[18]對藍(lán)莓(Vacciniummyrtillus)的研究結(jié)果一致.但邰志娟等[19]認(rèn)為添加0.2 mg/L BR能促進(jìn)仙人掌(Opuntiastricta)芽的增殖.本研究雖然沒有通過添加ZT和BR提高楓香的增殖系數(shù)，但從側(cè)面說明這兩種激素對楓香的增殖培養(yǎng)效果并不明顯，這在前人對楓香的組培研究中是沒有報(bào)道過的.同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)BR質(zhì)量濃度為0.03 mg/L和0.06 mg/L時(shí)，幼苗的葉片變小，顏色偏紅；BR質(zhì)量濃度升高至0.2 mg/L時(shí)，幼苗的葉片較大，葉色深綠.這說明低質(zhì)量濃度BR可能影響葉片生長和色素合成，這對于楓香這一秋色葉樹種的遺傳改良具有一定啟示，但其作用機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究.

IBA和NAA能夠調(diào)節(jié)植物營養(yǎng)生長，促進(jìn)生根，被廣泛應(yīng)用于植物的生根培養(yǎng)中[20-22].李亮[6]的研究表明，添加0.75 mg/L的 IBA能夠顯著提高楓香的生根率.同時(shí)李穎楠[2]和路佳[8]發(fā)現(xiàn)在添加0.1 mg/L IBA+0.3 mg/L NAA的培養(yǎng)基中，楓香的生根率可達(dá)87%，平均根長為3.91 cm；在添加0.2 mg/L IBA的培養(yǎng)基中，北美楓香的生根率為79%，平均根數(shù)為7條，平均根長為4.61 cm.因此，本研究選擇0～0.4 mg/L的NAA和0～3.0 mg/L的IBA作為生根培養(yǎng)的激素配比，通過觀察3株楓香優(yōu)株的生根率、平均根數(shù)和平均根長，以確定適宜不同楓香優(yōu)株的最佳生根培養(yǎng)基.結(jié)果顯示，添加NAA不利于3株楓香優(yōu)株的生根培養(yǎng)，而1.0 mg/L的IBA更有利于生根，且3株楓香優(yōu)株中生根率最高的材料為HA-2，生根率達(dá)到80%.但這一結(jié)果與李穎楠[2]、路佳[8]等的結(jié)果有所差異，造成這一結(jié)果的原因，一方面與培養(yǎng)基成分不同有關(guān)，另一方面也可能與試驗(yàn)材料的基因型、年齡或取材部位不同有關(guān).

總而言之，本研究中HA-2的培養(yǎng)效果最好，更適合通過組培方式進(jìn)行繁殖，以擴(kuò)大苗木生產(chǎn)速度和規(guī)模；HA-1、HA-3的增殖和生根培養(yǎng)條件還需要在后續(xù)的試驗(yàn)中進(jìn)一步優(yōu)化.