周慶楠， 趙煥英， 蔡爽， 楊寧燕， 周焱， 尚佳健

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院兒童口腔科，北京（100050）； 2.首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室基因組學(xué)研究平臺，北京（100069）

重度低齡兒童齲（severe early childhood caries，S-ECC）是指小于6 歲的兒童所患的嚴(yán)重齲病，存在患病率高、進(jìn)展快的特點(diǎn)。兒童齲病的分布并非平均，而是存在患齲風(fēng)險(xiǎn)高的人群，即使在接受全口牙齒治療后，仍有較高的齲病復(fù)發(fā)傾向，術(shù)后1年再發(fā)齲率可達(dá)59%[1]。乳牙列易患齲，也是恒牙患齲的危險(xiǎn)因素，這部分患兒在混合牙列期乃至恒牙列期依舊存在患齲高風(fēng)險(xiǎn)。

S-ECC 的病因是多因素和復(fù)雜的，生態(tài)菌斑學(xué)說的提出表明，齲病的發(fā)生并不依賴于某一種特定的細(xì)菌，微生物間、宿主與牙菌斑間的相互作用共同維持微生態(tài)的動態(tài)平衡，齲病可能是由齲損不同階段和部位的主要致齲微生物水平以及環(huán)境失衡決定的，菌群微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化與齲病發(fā)生密切相關(guān)[2-3]。

全身麻醉下一次完成全口齲病治療后，患兒口內(nèi)的患齲狀態(tài)可以得到迅速改善，恢復(fù)咀嚼效能，從微生物角度分析，普遍認(rèn)為，口內(nèi)微生物環(huán)境會在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生較大變化，但菌群微生物群落改建的過程、某些菌群在治療后的早期定植等對于遠(yuǎn)期無齲狀態(tài)維持的作用尚不明確。因此本研究擬利用16S rRNA 基因的高通量測序技術(shù)，分析在全身麻醉下一次完成齲病治療的S-ECC 患兒治療前、治療后短期內(nèi)菌斑微生物群落構(gòu)成變化，從微生物學(xué)角度觀察治療對于群落動態(tài)改建的影響，以期為兒童齲病風(fēng)險(xiǎn)評估、齲病管理和防治等提供新的思路。

1 資料和方法

1.1 研究對象

菌群微生物多樣性統(tǒng)計(jì)研究的樣本量的計(jì)算參考調(diào)查幼兒菌斑細(xì)菌微生物群多樣性的類似研究[4-5]，旨為初步探究治療后短期內(nèi)牙菌斑微生物改建過程，依據(jù)α 多樣性（Shannon 指數(shù)等）的平均值、稀疏曲線、測序深度覆蓋及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果，設(shè)定α=0.05，1-β=0.9，考慮失訪率，每組擬納入20 例S-ECC 患兒。無齲對照組1∶1 設(shè)定。納入2020 年8 月—2021 年1 月期間在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院兒童口腔科接受全身麻醉下齲病治療的3 ～5 歲S-ECC 患兒20 例為齲病組。納入經(jīng)口腔檢查無齲的20 名兒童作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：齲病組：①乳牙列完整，既往充填體≤1；②齲均（dmft）≥6；對照組（caries-free，CF）：經(jīng)口腔檢查無早期脫礦或白斑病變的臨床證據(jù)[6]，齲面均（dmfs）=0。排除標(biāo)準(zhǔn)：①治療前3 個(gè)月內(nèi)全身應(yīng)用抗生素；②系統(tǒng)性疾病史及遺傳病史。本項(xiàng)目已得到首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)（批號：CMUSH-IRB-KJ-PJ-2020-17），患兒家長知情同意，并自愿簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集部位及方法 兩組兒童均安排在早上進(jìn)食和刷牙前采集齦上菌斑，時(shí)間為上午8∶00—10∶00。在采樣前用清水、生理鹽水交替沖洗口腔30 s（如隨訪復(fù)查過程中，遇患兒無法自主配合的情況，情緒安撫、家長陪同下，在采樣前用清水漱口1 min），四手操作棉卷、吸唾器隔濕下，用無菌刮匙采集全牙列無齲部位齦上菌斑（除金屬預(yù)成冠表面）。

采集樣本置于裝有0.2 mL ATL 緩沖液（pH=8.0，Zeesan，中國）的EP 管中，樣本2 h 內(nèi)置于-20 ℃保存，4 h 內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 牙齒治療及術(shù)后隨訪 S-ECC 患兒在全身麻醉下一次完成全口齲病治療，治療結(jié)束后的7 d、1 個(gè)月、3 個(gè)月隨訪復(fù)查，進(jìn)行菌斑采集，根據(jù)隨訪復(fù)查時(shí)間點(diǎn)分為齲病術(shù)前（C）、治療后7 d（C-7D）、1 個(gè)月（C-1M）、3 個(gè)月（C-3M）。詳細(xì)記錄新發(fā)齲壞、繼發(fā)齲壞、充填物脫落及并發(fā)癥等情況。

1.2.3 高通量測序 室溫下解凍臨床收集到的菌斑樣本，進(jìn)行DNA 提取、純化，篩選A260/A280 比值為1.8 ～2.0，濃度＞20 ng/μL 的DNA 樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增、建立16S rRNA 基因文庫，應(yīng)用Illumina Miseq平臺進(jìn)行雙端測序，保留長度大于200 bp 的序列。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采取獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對兩組初診月齡、性別進(jìn)行比較；獲得有效序列后，對提取出的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）進(jìn)行聚類分析（相似性設(shè)為97%）；應(yīng)用SPSS26.0 對組間α 多樣性指數(shù)進(jìn)行單因素方差分析及組間多重比較；篩選組間差異物種，經(jīng)Kruskal-Wallis 非參數(shù)檢驗(yàn)或單因素方差分析，Bonferroni 校正P值進(jìn)行組間兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 OTU 聚類

本研究共納入S-ECC 患兒（C）和無齲兒童（CF）各20例，其中，S-ECC患兒組初診月齡（50.77±8.87）個(gè)月，男10 例，女10 例；無齲兒童組初診月齡（48.80 ± 11.75）個(gè)月，男7 例，女13 例，兩組月齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。C 組術(shù)前dmft為12.75 ± 2.86，dmfs 為27.50 ± 9.14，術(shù)前、治療后7 d、1 個(gè)月、3 個(gè)月無著差異（P＞0.05）。

共獲得7 203 146 條高質(zhì)量DNA 序列，共可識別287 個(gè)OTU，每一個(gè)OTU 代表一個(gè)物種，以組內(nèi)50%以上樣本內(nèi)存在為OTU 篩選條件，作韋恩圖（圖1）。5 組共有74 個(gè)物種，各組存在特有OTU 序列，其中無齲組特有23 個(gè)OTU，物種組成更為多樣。

Figure 1 Venn diagram of OTU of plaque microbial cimmunity before and after treatment in children with S-ECC圖1 S-ECC 患兒治療前后菌斑微生物OTU 韋恩圖

2.2 微生物多樣性水平

基于OTU 結(jié)果計(jì)算物種豐富度估計(jì)指數(shù)（Chao1）及物種多樣性指數(shù)（Shannon-Wiener 和Simpson 指數(shù)）等評價(jià)微生物α 多樣性水平常用的指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果如圖2 所示，組間α 多樣性指數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）。

Figure 2 Comparison of alpha diversity of plaque microbial cimmunity before and after treatment in children with S-ECC圖2 S-ECC 患兒治療前后菌斑微生物α 多樣性指數(shù)比較

2.3 微生物群落物種構(gòu)成分析

如圖3 所示，共獲得10 門，15 綱，28 目，45 科，84 屬和99 種的物種分布信息。厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）五個(gè)菌門，是主要優(yōu)勢菌門；鏈球菌屬（Streptococcus）、纖毛菌屬（Leptotrichia）、二氧化碳嗜纖維菌屬（Capnocytophaga）、奈瑟菌屬（Neisseria）、韋榮菌屬（Veillonella）、梭桿菌屬（Fusobacterium）、棒桿菌（Corynebacteriaceae）、放線菌屬（Actinomyces）、嗜血菌屬（Haemophilus）等16 種菌屬占獲得序列的80%以上，為主要優(yōu)勢菌屬。其中鏈球菌屬、纖毛菌屬、二氧化碳嗜纖維菌屬、韋榮菌屬、放線菌屬、嗜血菌屬（Haemophilus）、彎曲菌屬（Campylobacter）等的相對豐度在組間存在差異。

Figure 3 The relative abundance of phylum and genus of plaque microbial cimmunity before and after treatment in children with S-ECC圖3 S-ECC 患兒治療前后菌斑微生物門、屬水平物種組成

觀察差異菌屬在組間的變化趨勢。其中，鏈球菌屬的相對豐度在S-ECC 患兒治療前（C）和無齲兒童（CF）組間無顯著性差異，在S-ECC 患兒治療后7 d（C-7D）鏈球菌屬相對豐度較治療前顯著增高，在術(shù)后復(fù)查各時(shí)間點(diǎn)，鏈球菌屬在結(jié)構(gòu)中所占比例均高于無齲兒童（CF）組（P＜0.05）。在治療后7 d，可以觀察到S-ECC 患兒的纖毛菌屬相對豐度水平低于其余各組（P＜0.05）；聚集桿菌屬（Aggregatibacter）、普雷沃-7 屬（Prevotella-7）的相對豐度在治療后7 d 顯著下降（P＜0.05）。韋榮菌屬、放線菌屬、擬普雷沃菌屬（Allprevotella）在S-ECC 患兒治療前（C）和無齲兒童（CF）組間相對豐度存在差異，可能與齲病狀態(tài)識別相關(guān)；二氧化碳嗜纖維菌屬（Capnocytophaga）在無齲兒童中的相對豐度高于S-ECC 患兒，表現(xiàn)與無齲狀態(tài)相關(guān)（P＜0.05）。S-ECC 患兒治療后的1 個(gè)月和3 個(gè)月，菌群內(nèi)微生物屬水平相對豐度水平相似；術(shù)后3 個(gè)月，鏈球菌屬、韋榮菌屬的相對豐度水平升高，二氧化碳嗜纖維菌屬的相對豐度下降，見圖4。

Figure 4 Relative abundance of different genera of plaque before and after treatment in children with S-ECC圖4 S-ECC 患兒治療前后菌斑差異菌屬相對豐度

S-ECC 患兒治療術(shù)后7 d（C-7D）的血鏈球菌（Streptococcus sanguinis）相對豐度顯著高于S-ECC患兒治療前（C）、無齲兒童（CF）（P＜0.05），在治療后血鏈球菌相對豐度上升，在治療后3 個(gè)月下降。顆粒二氧化碳嗜纖維菌（Capnocytophaga granulosa）在CF 組的相對豐度高于S-ECC 患兒治療前后，與治療前、治療后7 d、3 個(gè)月的相對豐度比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。S-ECC 患兒治療前（C）和無齲兒童（CF）的變異鏈球菌（Streptococcus mutans）相對豐度存在顯著差異（P＜0.01），S-ECC 患兒治療后7 d、3 個(gè)月與CF 組無顯著差異，而在治療后3 個(gè)月相對豐度出現(xiàn)上升，顯著高于無齲兒童組（P＜0.01），見表1。

表1 S-ECC 患兒治療前后菌斑血鏈球菌、變異鏈球菌、顆粒二氧化碳嗜纖維菌相對豐度Table 1 Relative abundance of Streptococcus sanguine,Streptococcus mutans and Capnocytophaga granulosa of plaque before and after treatment in children with S-ECC

3 討 論

隨著分子生物學(xué)和微生物功能基因組學(xué)的發(fā)展進(jìn)步，學(xué)者們得以破譯生物膜內(nèi)復(fù)雜的生態(tài)，對微生物群落中細(xì)菌的種群分布、多樣性及致齲機(jī)制進(jìn)行更深入的探討。在本研究中，支持以往假設(shè)“核心微生物”的概念[7-8]，菌斑微生物群落總體微生物組成相似，組間共有優(yōu)勢菌屬表明核心微生物群的存在，使微生物生態(tài)環(huán)境保持相對穩(wěn)定，強(qiáng)調(diào)了揭示個(gè)體間共有微生物的必要性和重要性。

目前對于“核心微生物菌群”組成并未達(dá)成一致，主要與不同種族、社區(qū)封閉水平、特定的取樣部位、局部解剖形態(tài)和分析方法等相關(guān)。以往學(xué)者研究中發(fā)現(xiàn)牙齒、舌、軟硬腭、黏膜等不同口腔部位具有不同的微生物組成[9]，微生物在不同的生態(tài)位之間是不同的，局部解剖形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)等均能對微生物產(chǎn)生影響。唾液中的細(xì)菌數(shù)量眾多，其微生物和營養(yǎng)成分受食物攝入量、回流、環(huán)境和其他影響而形成。Hurley 等[10]確定了菌斑微生物群和唾液微生物群之間的明顯差異，雖然菌斑及齲病部位微生物群的多樣性不如唾液微生物群，但一些罕見分類群的存在可能是這些兒童健康與疾病之間的差異。由于齲病是一種由菌斑生物膜介導(dǎo)的局部疾病，生物膜中的細(xì)菌不同于唾液中懸浮的單個(gè)細(xì)菌，它們是整體生存的微生物生態(tài)群體，是口腔細(xì)菌生存、代謝和致病的基礎(chǔ)。檢測齦上菌斑微生物群組成的變化是在齲病臨床表現(xiàn)之前檢測低齡兒童齲風(fēng)險(xiǎn)的一種方法，并為早期治療齲病提供了機(jī)會，以防止不可逆轉(zhuǎn)的成洞性齲形成[7]。因此本研究認(rèn)為，對于齲病的研究采集菌斑生物膜樣本更具有代表性。

以往有研究表明，齲病的發(fā)生、發(fā)展與口腔微生物群落多樣性水平的改變密切相關(guān)。健康牙面的牙菌斑比齲損部位的菌斑α 多樣性水平高，認(rèn)為更多樣化的群落可能對應(yīng)更健康的生態(tài)系統(tǒng)，隨著齲病嚴(yán)重程度的加重，多樣性水平降低[11-12]。在本研究中，主要觀察在治療后微生物菌群的整體改變，因此本研究采集部位是全牙列無齲牙面的集合菌斑，降低了由于不同齲壞程度部位對α 多樣性水平的影響。結(jié)果與先前的研究一致，并未觀察到顯著的微生物α 多樣性水平變化。Teng 等[13]則認(rèn)為在臨床癥狀未出現(xiàn)時(shí)，微生物多樣性隨著低齡兒童齲嚴(yán)重程度變化而顯著增加，而在齲病進(jìn)展階段，微生物多樣性趨于穩(wěn)定。齲病相關(guān)的群落通常是高度多樣化的，治療前后微生物群落的改變并不體現(xiàn)在α 多樣性指數(shù)水平，定性、定量的α 多樣性指數(shù)研究對遠(yuǎn)期監(jiān)測治療后齲病狀態(tài)改變、識別早期齲病發(fā)生的意義較低。

全身麻醉下牙齒治療可以在短時(shí)間內(nèi)迅速改善口內(nèi)微生物環(huán)境，治療后7 d 的菌群結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出更大的波動性，體現(xiàn)了治療對于菌斑群落的影響，有學(xué)者認(rèn)為樹脂單體對人體免疫系統(tǒng)細(xì)胞有生物學(xué)效應(yīng)，修復(fù)材料可能會影響細(xì)菌的黏附，進(jìn)而擾亂口腔微生物群譜[14]。

有學(xué)者研究認(rèn)為，變異鏈球菌和血鏈球菌之間存在拮抗關(guān)系，變異鏈球菌產(chǎn)生的突變素能抑制血鏈球菌的生長，而血鏈球菌能產(chǎn)生過氧化氫來抑制變異鏈球菌的初始生物膜形成。血鏈球菌在牙面的早期定植延遲了變異鏈球菌在牙齒表面的定植，變異鏈球菌與血鏈球菌的相互作用會影響兒童的齲病狀況[15]，兩者間的比例也被認(rèn)為是評估齲病風(fēng)險(xiǎn)的一種方法。本研究中，治療后血鏈球菌的迅速定植，對遠(yuǎn)期無齲狀態(tài)的維持起到重要作用。隨著術(shù)后血鏈球菌的相對豐度下降，術(shù)后3 個(gè)月出現(xiàn)復(fù)發(fā)情況時(shí)可以觀察到變異鏈球菌相對豐度的上升，且變異鏈球菌在無齲組、齲病組間存在的顯著差異，表現(xiàn)出對于齲病狀態(tài)識別的敏感性，但其是否能夠真正預(yù)測遠(yuǎn)期齲病復(fù)發(fā)仍需長時(shí)間進(jìn)一步觀察。也有研究表明不同類型、不同基因型的鏈球菌可能在兒童早期齲病中起重要作用，在未檢出或僅檢測到低水平變異鏈球菌的受試者中，唾液鏈球菌、戈登鏈球菌水平的升高被證實(shí)與齲病有關(guān)[16]。在以遠(yuǎn)緣鏈球菌為主的大多數(shù)樣本中，也存在低水平的變異鏈球菌[17]。唾液中變形鏈球菌、索氏鏈球菌等水平的升高可能是兒童飲食中碳水化合物攝入頻繁的替代指標(biāo)。這種攝入導(dǎo)致微生物群落的失調(diào)，導(dǎo)致齦上菌斑中產(chǎn)酸細(xì)菌和耐酸細(xì)菌的增加[7]。提示這些菌種與齲病的關(guān)系還有待于進(jìn)一步的研究，可能這些菌種是變異鏈球菌的替代病原菌，推測其致齲機(jī)制并不是單純的變異鏈球菌含量升高，可能是與整個(gè)微生物群落結(jié)構(gòu)變化相關(guān)。

二氧化碳嗜纖維菌屬為兼性厭氧菌或微需氧菌，菌屬中各菌種鑒別特征不明顯，以往多報(bào)導(dǎo)其與牙周疾病密切相關(guān)。但也有研究中指出，其對牙周炎的致病性被過高估計(jì)，該菌從健康齦溝處分離率相當(dāng)高，屬于齦溝菌斑的正常菌群成員，故應(yīng)認(rèn)為是人類口腔的正常菌群[17]。

因此本研究推測是由于治療改變了口內(nèi)的致齲環(huán)境，打破了原有微生物間的平衡，一些在低pH環(huán)境下活躍的致齲菌群減少，如聚集桿菌屬、普雷沃-7 屬、纖毛菌屬、血鏈球菌屬等所表現(xiàn)出的對于治療的敏感性，在相互協(xié)同、拮抗作用下，逐漸開始建立新平衡狀態(tài)下的群落結(jié)構(gòu)，這其中同樣不乏精氨酸代謝等過程的參與。

有研究表明，血鏈球菌等在健康人群菌斑生物膜中比例較高的一個(gè)關(guān)鍵特性是它們可以通過精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)（arginine deiminase system，ADS）產(chǎn)生氨的能力，這對生物膜的pH 動態(tài)平衡有著積極的影響[18]。Nascimento 等[19]的研究也證實(shí)與齲齒活躍兒童相比，無齲組兒童牙齒表面的牙菌斑細(xì)菌具有更高的精氨酸活性，認(rèn)為齦上生物膜中的精氨酸代謝可能會極大地影響宿主對齲齒的抵抗力或易感性。齲齒活躍個(gè)體和齲齒活躍牙齒部位的生物膜中的微環(huán)境也可能不利于高水平的精氨酸表達(dá)，或者可能包含降低精氨酸表達(dá)或酶活性的抑制因子。

綜上所述，口腔菌斑群落內(nèi)存在“核心微生物群”，共同維持菌斑微生態(tài)的穩(wěn)定。S-ECC 患兒在接受治療后口內(nèi)微生物致齲環(huán)境迅速變化，菌斑菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。纖毛菌屬、聚集桿菌屬等表現(xiàn)出對于治療的敏感性，血鏈球菌、纖毛菌屬等的早期定植有助于逐漸建立新平衡（無齲）狀態(tài)下的群落結(jié)構(gòu)。值得持續(xù)關(guān)注二氧化碳嗜纖維菌屬、顆粒二氧化碳嗜纖維菌屬等在微生物結(jié)構(gòu)中維持無齲狀態(tài)的作用，對群落中存在的韋榮菌屬、擬普雷沃菌屬、變異鏈球菌等可能的齲病微生物標(biāo)記物仍需繼續(xù)監(jiān)測并輔以代謝組學(xué)等技術(shù)手段驗(yàn)證，有待進(jìn)一步研究。

【Author contributions】 Zhou QN processed the research and wrote the article. Shang JJ designed the study and revised the article. Zhao HY processed and analyzed the data. Yang NY, Cai S and Zhou Y processed the research and revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.