楊曉玲，賴麗金，譚桂蘭

肝癌是一種嚴(yán)重威脅人類生命健康和影響人類生活質(zhì)量的惡性腫瘤，其發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過程，目前肝癌的發(fā)生機(jī)制還未完全闡明［1］。手術(shù)切除、放射治療和化療等是常見的肝癌治療手段，這些治療方法取得了顯著成果，但仍然不能滿足需求［2］。千金藤素是從傳統(tǒng)中藥千金藤中提取出來的活性成分，具有抗炎、提高免疫力等功效［3］。很多研究顯示，千金藤素還具有抗腫瘤作用，對于腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用，并且可以在體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生［4］。子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞經(jīng)過千金藤素處理以后，細(xì)胞凋亡增多，細(xì)胞增殖能力下降［5］。在研究千金藤素對結(jié)腸癌生長影響的研究中發(fā)現(xiàn)，千金藤素可以有效下調(diào)腫瘤中核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信號(hào)通路的激活程度［6］。NFκB是在腫瘤組織中異常激活的信號(hào)通路，抑制其激活可以阻礙腫瘤進(jìn)展［7］。目前對于千金藤素對肝癌細(xì)胞增殖凋亡的影響和機(jī)制還不清楚。本研究于2020年1—6月，以肝癌細(xì)胞HepG2作為實(shí)驗(yàn)對象，探討千金藤素處理后肝癌細(xì)胞增殖和凋亡變化，以期為千金藤素治療肝癌提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）抗體、p21抗體購自美國Proteintech Group公司；千金藤素（BP0334）購自上海紀(jì)寧生物科研有限公司；活化胱天蛋白酶3（cleaved-caspase-3）抗體購自美國Abcam；細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗體、核因子κB p65（NF-κB p65）抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；NF-κB信號(hào)激活劑腫瘤壞死因子-α（TNF-α）購自美國Sigma；肝癌細(xì)胞HepG2購自通派（上海）生物科技有限公司。

1.2 MTT方法檢測細(xì)胞增殖活性取對數(shù)期的肝癌細(xì)胞，將細(xì)胞種植于96孔板，接種的細(xì)胞懸浮液濃度為3×103個(gè)細(xì)胞∕100 μL，將細(xì)胞放在培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，然后把上清吸棄，將細(xì)胞分成對照組和CEP組（5、10、20、40、80 μmol∕L共5個(gè)濃度梯度），對照組細(xì)胞用不添加千金藤素的培養(yǎng)液培養(yǎng)，CEP組細(xì)胞中添加5、10、20、40、80 μmol∕L千金藤素培養(yǎng)液。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d以后，分別在每個(gè)孔內(nèi)添加MTT各15 μL（濃度為5 g∕L），放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用移液槍小心吸盡孔內(nèi)的上清，繼續(xù)添加150 μL的DMSO溶液，震蕩孵育結(jié)合10 min，在酶標(biāo)儀上分別測定每個(gè)孔的A值，檢測波長設(shè)置為490 nm。

1.3 PI單染檢測細(xì)胞周期將對照組和CEP組細(xì)胞按照常規(guī)方法培養(yǎng)2 d以后，以0.25%的胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，添加冰預(yù)冷的乙醇（濃度為75%）溶液固定后，添加PI染液孵育結(jié)合20 min。放在流式細(xì)胞儀中測定細(xì)胞周期變化。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡將對照組和CEP組細(xì)胞按照常規(guī)方法培養(yǎng)2 d以后，以0.25%的胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，用PBS溶液將細(xì)胞洗滌2次，然后添加PI以及Annexin V-FITC染色液混合，加入300 μL的結(jié)合緩沖液，在使用流式細(xì)胞儀檢測之前添加200 μL的結(jié)合緩沖液混合。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞中cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NF-κB p65蛋白表達(dá)將對照組和CEP組細(xì)胞按照常規(guī)方法培養(yǎng)2 d以后，以0.25%的胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，在細(xì)胞沉淀中加入蛋白裂解試劑，置于冰水混合物上孵育20 min，轉(zhuǎn)移到4℃離心機(jī)中，以12 000g高速離心10 min。移液槍把離心后的上清溶液轉(zhuǎn)移到離心管中，使用二辛可寧酸（BCA）法檢測蛋白濃度。在蛋白上清中添加5×上樣緩沖液（loading buffer）均勻混合以后，放在沸水浴中孵育5 min，變性后的蛋白在-20℃保存。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制用10%分離膠以及5%濃縮膠。按照每個(gè)孔中50 μg蛋白上樣，首先以90 V的電壓在濃縮膠中電泳，等到溴酚藍(lán)染料快要進(jìn)入到濃縮膠以后，把電壓調(diào)整到120 V繼續(xù)電泳，溴酚藍(lán)進(jìn)入到底部以后停止電泳。取出凝膠，把NC膜裁剪成合適大小，在80 V電壓條件下電轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜在冰上進(jìn)行，轉(zhuǎn)膜進(jìn)行60 min。把NC膜放在封閉液（5%牛血清白蛋白溶液）中孵育2 h，然后將NC膜放在含有一抗的平皿內(nèi)，在4℃過夜。NC膜置于含有二抗孵育液的平皿內(nèi)，在37℃孵育2 h。ECL方法發(fā)光。內(nèi)參設(shè)置為GAPDH，分析目的蛋白表達(dá)水平。cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NF-κB p65一抗稀釋倍數(shù)為1∶600、1∶600、1∶600、1∶400、1∶600，二抗稀釋倍數(shù)為1∶4 000。

1.6 NF-κB信號(hào)激活劑對千金藤素調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖、周期和凋亡影響肝癌細(xì)胞用20 μg∕L NF-κB信號(hào)激活劑TNF-α和20 μmol∕L的千金藤素共同處理記為CEP+TNF-α組，按照MTT、PI單染和Annexin V-FITC∕PI雙染法檢測細(xì)胞增殖活性、周期和凋亡變化，蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞中cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NF-κB p65蛋白水平，步驟同上。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 21.0軟件分析本研究數(shù)據(jù)，按照±s表示，兩組數(shù)據(jù)間比較用t檢驗(yàn)和Dunnett-t檢驗(yàn)，多組差異比較用單因素方差，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 千金藤素對肝癌細(xì)胞增殖活性影響10、20、40、80 μmol∕L的千金藤素處理后的肝癌細(xì)胞增殖活性降低（表1）。20 μmol∕L的千金藤素對肝癌細(xì)胞增殖抑制率約為50%，選用20 μmol∕L的千金藤素做后續(xù)研究。

表1 千金藤素（CEP）處理后肝癌細(xì)胞吸光度（A值）變化

表1 千金藤素（CEP）處理后肝癌細(xì)胞吸光度（A值）變化

注：①與0 μmol∕L比，均P＜0.05。

組別對照組CEP 5 μmol∕L組CEP 10 μmol∕L組CEP 20 μmol∕L組CEP 40 μmol∕L組CEP 80 μmol∕L組F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 3 3 A值0.68±0.05 0.63±0.06 0.50±0.03①0.36±0.03①0.28±0.02①0.21±0.01①77.20＜0.001

2.2 千金藤素對肝癌細(xì)胞周期和凋亡影響千金藤素處理后的肝癌細(xì)胞G0∕G1期細(xì)胞比例升高，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中周期促進(jìn)因子cyclin D1蛋白水平下降，周期抑制因子p21蛋白水平升高，凋亡促進(jìn)蛋白Bax、cleaved-caspase-3水平升高（表2）。千金藤素阻滯肝癌細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

表2 千金藤素處理后肝癌細(xì)胞周期分布比例、凋亡率和cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3水平

表2 千金藤素處理后肝癌細(xì)胞周期分布比例、凋亡率和cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3水平

注：CEP為千金藤素，cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白，cleaved caspase-3為活化胱天蛋白酶3。

組別對照組CEP組t值P值重復(fù)次數(shù)3 3細(xì)胞周期比例∕%G0∕G1 50.61±4.17 65.81±3.73 4.71 0.009 S 18.35±1.16 10.54±1.09 8.50 0.001 G2∕M 31.04±2.81 23.65±1.50 4.02 0.016凋亡率∕%2.18±0.12 13.47±1.58 12.34＜0.001 cyclin D1 0.68±0.07 0.39±0.04 6.20 0.003 p21 0.20±0.03 0.41±0.05 6.18 0.003 Bax 0.32±0.03 0.66±0.06 8.71 0.001 cleaved caspase-3 0.15±0.02 0.31±0.04 6.10 0.004

2.3 千金藤素對肝癌細(xì)胞中NF-κB信號(hào)的影響千金藤素處理后的肝癌細(xì)胞中NF-κB關(guān)鍵蛋白NFκBp65水平［（0.19±0.02）比（0.36±0.05），t=5.41，P＜0.05］下降（圖1）。千金藤素抑制肝癌細(xì)胞中NF-κB信號(hào)激活。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測千金藤素對肝癌細(xì)胞中NF-κBp65蛋白表達(dá)影響

2.4 NF-κB信號(hào)激活劑對千金藤素影響肝癌細(xì)胞增殖活性、周期和凋亡的作用與單純經(jīng)過千金藤素處理的細(xì)胞比較，NF-κB信號(hào)激活劑TNF-α和千金藤素共同處理后的肝癌細(xì)胞增殖活性升高，G0∕G1期比例降低，凋亡率降低（圖2，表3）。NF-κB信號(hào)激活劑逆轉(zhuǎn)千金藤素對肝癌細(xì)胞增殖抑制、周期阻滯和凋亡促進(jìn)作用。

表3 NF-κB信號(hào)激活劑和千金藤素（CEP）處理后肝癌細(xì)胞A值、細(xì)胞周期分布比例和凋亡率

表3 NF-κB信號(hào)激活劑和千金藤素（CEP）處理后肝癌細(xì)胞A值、細(xì)胞周期分布比例和凋亡率

注：CEP為千金藤素，TNF-α為腫瘤壞死因子-α。

組別CEP CEP+TNF-α t值P值重復(fù)次數(shù)3 3 A值0.35±0.04 0.46±0.03 3.76 0.020細(xì)胞周期比例∕%G0∕G1 66.38±5.80 53.27±4.12 3.19 0.033 S 11.94±1.21 22.65±1.27 10.58 0.001 G2∕M 21.68±2.37 22.08±2.15 0.22 0.837凋亡率∕%14.17±1.28 8.12±0.96 6.55 0.003

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測NF-κB信號(hào)激活劑和千金藤素處理后肝癌細(xì)胞凋亡變化

2.5 NF-κB信號(hào)激活劑對千金藤素影響肝癌細(xì)胞中cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NFκBp65蛋白表達(dá)作用與單純經(jīng)過千金藤素處理的細(xì)胞比較，NF-κB信號(hào)激活劑TNF-α和千金藤素共同處理后的肝癌細(xì)胞中cyclin D1蛋白水平升高，p21、Bax、cleaved-caspase-3蛋 白 水 平 降 低，NF-κBp65蛋白水平升高（圖3，表4）。NF-κB信號(hào)激活劑逆轉(zhuǎn)千金藤素對肝癌細(xì)胞中cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NF-κBp65蛋白表達(dá)影響。

表4 NF-κB信號(hào)激活劑和千金藤素處理后肝癌細(xì)胞中cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NF-κBp65蛋白水平∕

表4 NF-κB信號(hào)激活劑和千金藤素處理后肝癌細(xì)胞中cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NF-κBp65蛋白水平∕

注：CEP為千金藤素，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白，cleaved caspase-3為活化胱天蛋白酶3，NF-κB p65為核因子κB p65。

組別CEP CEP+TNF-α t值P值重復(fù)次數(shù)3 3 cyclin D1 0.36±0.03 0.54±0.06 4.72 0.009 p21 0.43±0.05 0.20±0.02 7.31 0.002 Bax 0.59±0.07 0.39±0.04 4.28 0.013 cleaved-caspase-3 0.34±0.03 0.18±0.02 7.50 0.002 NF-κBp65 0.35±0.05 0.52±0.04 4.56 0.010

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測NF-κB信號(hào)激活劑和千金藤素處理后肝癌細(xì)胞中cyclin D1、p21、Bax、cleaved-caspase-3、NF-κBp65蛋白水平

3 討論

本研究表明，千金藤素處理后的肝癌細(xì)胞增殖能力下降，千金藤素具有抑制肝癌細(xì)胞生長的作用。千金藤素是一種雙親性、帶有正電荷的生物堿，能夠增加質(zhì)膜的穩(wěn)定性，提高機(jī)體免疫力、抑制炎癥發(fā)生［8］。千金藤素還具有抗腫瘤生長的作用，單獨(dú)使用千金藤素能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長并提高機(jī)體免疫力［9］。研究顯示，千金藤素可以在體外抑制口腔鱗癌、結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞增殖［10-11］。本研究結(jié)果與上述研究報(bào)道相符合，均提示千金藤素具有體外抗腫瘤細(xì)胞生長的作用。

研究表明，千金藤素抑制腫瘤細(xì)胞生長與影響細(xì)胞周期進(jìn)程有關(guān)［12］。細(xì)胞周期進(jìn)展是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵，細(xì)胞從上一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂結(jié)束稱為一個(gè)細(xì)胞周期，在這一過程中，細(xì)胞周期調(diào)控因子扮演重要角色［13］。cyclin D1是細(xì)胞周期的正調(diào)控因子，其可以促進(jìn)細(xì)胞從G0∕G1期向S期轉(zhuǎn)變［14］。p21是細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子，其表達(dá)水平升高后可以抑制腫瘤細(xì)胞有序進(jìn)展［15］。細(xì)胞凋亡減少是腫瘤發(fā)生的重要特征，細(xì)胞凋亡與細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)，其中Bcl-2和caspase蛋白家族是目前研究最多的與細(xì)胞凋亡有關(guān)的調(diào)節(jié)因子［16］。Bax是Bcl-2蛋白家族成員，其在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮促進(jìn)作用［17］。caspase-3是caspase凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游執(zhí)行因子，其活化后形成cleavedcaspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡發(fā)生的標(biāo)志［18］。本研究顯示，千金藤素處理后的肝癌細(xì)胞G0∕G1期比例升高，細(xì)胞中cyclin D1蛋白水平降低，p21蛋白水平升高，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中Bax和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)增多，提示千金藤素可以抑制肝癌細(xì)胞周期進(jìn)展并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。

NF-κB是在B細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種核因子，其常常以二聚體的形式在細(xì)胞內(nèi)存在，NF-κB在多種類型的細(xì)胞中均有表達(dá)，并且參與細(xì)胞多種病理和生理過程［19］。NF-κBp65是NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的必需因子，也是NF-κB信號(hào)激活程度的標(biāo)志［20］。NF-κB與人類腫瘤進(jìn)展有關(guān)，其在腫瘤發(fā)生中過度激活，通過靶向抑制NF-κB的激活可以降低腫瘤的惡性程度［21］。本研究顯示，千金藤素處理以后的肝癌細(xì)胞中NF-κB信號(hào)激活程度降低，提示千金藤素可能通過抑制NF-κB信號(hào)通路調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖和凋亡。之前的研究報(bào)道表明，千金藤素在抵抗結(jié)直腸癌等腫瘤細(xì)胞惡性生長的同時(shí)可以下調(diào)細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路的激活水平，千金藤素作用機(jī)制與NF-κB信號(hào)有關(guān)［6］。本研究表明，NF-κB信號(hào)激活劑可以逆轉(zhuǎn)千金藤素對肝癌細(xì)胞增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用，提示千金藤素通過抑制NF-κB調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖和凋亡。

以上表明，千金藤素具有體外抑制肝癌細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，其作用機(jī)制與抑制NF-κB信號(hào)有關(guān)。本研究結(jié)果為研究千金藤素抗腫瘤作用機(jī)制提供了參考，為千金藤素治療肝癌的臨床應(yīng)用提供了理論資料。在以后的實(shí)驗(yàn)中會(huì)對千金藤素的具體作用機(jī)制進(jìn)行探討和驗(yàn)證。