王帥，朱超男，鄔鵬宇，崔志成，趙長(zhǎng)全

心肌缺血再灌注損傷是心血管疾病在缺血發(fā)生后，血流恢復(fù)所引起的心肌損傷，是心血管疾病中常見(jiàn)的病理現(xiàn)象，長(zhǎng)時(shí)間缺血后恢復(fù)血液供應(yīng)時(shí)，局部炎癥增加，導(dǎo)致繼發(fā)性損傷［1-2］。長(zhǎng)期缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞損傷可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、自噬、壞死。因此，研究再灌注損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的具體機(jī)制，可以對(duì)其臨床治療提供新的治療靶點(diǎn)。蘿卜硫素（sulforaphane，SFN）又稱(chēng)萊菔硫素，不僅有良好的抗癌活性，對(duì)缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷也具有保護(hù)作用，但其具體作用機(jī)制尚不完全清楚［3-4］。色氨酸（tryptophan，TRP）是一種必需氨基酸，是神經(jīng)遞質(zhì)和其他關(guān)鍵的生物合成中間體，在機(jī)體代謝功能中起著至關(guān)重要的作用［5］。犬尿氨酸（kynurenine，KYN）途徑是哺乳動(dòng)物TRP代謝的主要途徑［6］，研究顯示，炎性或應(yīng)激因子誘導(dǎo)吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）可以激活TRP轉(zhuǎn)化為KYN，參與心血管疾病發(fā)生過(guò)程［7］，研究報(bào)道，TRP∕KYN在心肌梗死病人的自身免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)，抑制TRP∕KYN表達(dá)可有效緩解心肌損傷［8］。然而關(guān)于TRP∕KYN在心肌缺血再灌注損傷中的作用研究報(bào)道較少，本研究于2019年7月至2020年6月，通過(guò)觀(guān)察SFN對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌損傷的影響，初步探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)自北京生命科學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，8周齡，體質(zhì)量250 g左右，合格證號(hào)為SYXK（京）2015-0002，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.2 試劑及儀器蘇木-伊紅染液（上海舜百生物科技有限公司，貨號(hào)SBT10001）；SFN（成都格純生物醫(yī)藥有限公司，貨號(hào)4478-93-7）、白細(xì)胞介素（IL）-1β ELISA試劑盒（貨號(hào)ml028514）、IL-6 ELISA試劑盒（貨號(hào)ml102828）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試 劑 盒（貨 號(hào)ml002095）均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技公司；TUNEL試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)C1086）；兔源單克隆B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白（Bax）抗體（貨號(hào)ab32503）、兔源單克隆B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）抗體（貨號(hào)ab692）、兔源多克隆活化胱天蛋白酶3（cleaved-capase3）抗體（貨號(hào)ab214430）、兔源單克隆IDO抗體（貨號(hào)ab235902）均購(gòu)自abcam公司；生物顯微鏡（日本尼康公司，型號(hào)e200）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)伯樂(lè)公司，型號(hào)1708280）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 心肌缺血再灌注損傷大鼠模型構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組將SD雄性大鼠隨機(jī)分為四組，假手術(shù)（Control）組、模型（I∕R）組、SFN低（I∕R+L SFN）、高（I∕R+H SFN）劑量組，每組10只。I∕R+L SFN、I∕R+H SFN組術(shù)前2 h自尾靜脈分別注射SFN 5 mg∕kg、10 mg∕kg，Control、I∕R組注射等量生理鹽水［4，9］。除Control外，其他大鼠參考文獻(xiàn)［10］制備心肌缺血再灌注損傷模型，用10%水合氯醛溶液（4 mL∕kg）腹腔注射麻醉，大鼠四肢皮下連接心電圖電極，實(shí)驗(yàn)全程記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。打開(kāi)大鼠胸腔，用0號(hào)縫合針線(xiàn)在冠動(dòng)脈左前降支下結(jié)扎，當(dāng)結(jié)扎部位以下心肌顏色變暗且心電圖ST段升高，則表明心肌缺血成功，結(jié)扎30 min后，剪開(kāi)縫合線(xiàn)再灌注2 h，缺血區(qū)域的心肌顏色變紅，T波波幅開(kāi)始回落、ST段下降1∕2以上，則再灌注成功。Control大鼠手術(shù)中只在左側(cè)冠狀動(dòng)脈的前降支下穿線(xiàn)，不結(jié)扎。

1.3.2 標(biāo)本采集術(shù)后24 h后，采集各組大鼠尾靜脈血5 mL，1 800 r∕min離心10 min取血清，儲(chǔ)存于-80℃冰箱待測(cè)；腹腔注射10%水合氯醛麻醉，處死大鼠，分離心肌組織，剪取約1.0 g用于提取組織蛋白，儲(chǔ)存在-80℃冰箱中備用，剩余心肌組織用4%多聚甲醛溶液固定，做常規(guī)石蠟切片，備用。

1.3.3 各組大鼠血清中炎性因子檢測(cè)取“1.3.2”中血清，用ELISA試劑盒分別檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α含量，具體操作步驟參考其說(shuō)明書(shū)。

1.3.4 HE染色觀(guān)察各組大鼠心肌組織病理變化將“1.3.2”中常規(guī)石蠟切片，脫蠟至水化，行HE染色，每張切片選取5個(gè)視野，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察心肌組織病理學(xué)改變。

1.3.5 原位末端標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況將“1.3.2”中常規(guī)石蠟切片，脫蠟至水化，PBS漂洗3次，血清封閉30 min，加TUNEL工作液，避光孵育1 h，具體操作步驟參考TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，凋亡細(xì)胞為陽(yáng)性其細(xì)胞核呈棕黃色或褐色，在熒光顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞凋亡數(shù)目，用Image Pro Plus軟件進(jìn)行分析，每張切片選取5個(gè)視野，根據(jù)公式凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞∕總細(xì)胞數(shù)×100%，記錄各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況。

1.3.6 檢測(cè)各組大鼠心肌組織中TRP、KYN濃度取“1.3.2”中各組大鼠心肌組織0.5 g冰浴進(jìn)行研磨勻漿，離心取上清液置于透析帶內(nèi)，加透析液，于4℃搖床透析36 h，取透析液100 μL于離心管中，離心14 000 r∕min，10 min，取上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾后，用高效液相色譜儀進(jìn)行分析，色譜柱為Agilent TC-C18（250 mm×5 mm，5 μm），乙腈為流動(dòng)相，流速1.0 mL∕min，在紫外波長(zhǎng)為280 nm檢測(cè)TRP色譜，紫外波長(zhǎng)為360 nm檢測(cè)KYN色譜，根據(jù)TRP、KYN標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算TRP、KYN濃度及KYN∕TRP比值。

1.3.7 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2、cleaved-capase3、IDO蛋白表達(dá)情況取“1.3.2”中各組大鼠心肌組織0.5 g提取蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，取50 μg蛋白變性，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗（抗Bax、Bcl-2、cleaved-capase3、IDO、GAPDH抗體，1∶1 000）4℃過(guò)夜，次日加二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h，加ECL化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行顯色，用GAPDH作內(nèi)參，Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用±s表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SFN減少血清中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的生成I∕R組較Control IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高（均P＜0.05）；I∕R+L SFN、I∕R+H SFN組較I∕R組IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低，且呈劑量依賴(lài)（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 SFN對(duì)大鼠血清中炎性因子白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的影響∕（μg∕Ls）

表1 SFN對(duì)大鼠血清中炎性因子白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的影響∕（μg∕Ls）

注：Control為假手術(shù)組，I∕R為模型組，I∕R+L SFN為蘿卜硫素低劑量組，I∕R+H SFN為蘿卜硫素高劑量組。①與Control組相比，P＜0.05。②與I∕R組相比，P＜0.05。③與I∕R+L SFN組相比，P＜0.05。

組別Control I∕R I∕R+L SFN I∕R+H SFN F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 IL-1β 116.84±10.05 297.32±13.12①235.13±14.24①②208.76±16.56①②③299.59＜0.001 IL-6 398.76±20.31 657.34±25.17①595.16±30.02①②482.34±30.55①②③184.74＜0.001 TNF-α 210.04±12.56 483.16±20.31①376.42±28.23①②287.39±27.05①②③263.48＜0.001

2.2 SFN減輕對(duì)大鼠心肌組織病理癥狀Control大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，纖維結(jié)構(gòu)排列規(guī)則；與Control相比，I∕R組大鼠心肌細(xì)胞破碎、壞死，細(xì)胞排列不規(guī)則，心肌纖維斷裂，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與I∕R組相比，I∕R+L SFN、I∕R+H SFN組大鼠心肌細(xì)胞上述病理癥狀明顯減輕。見(jiàn)圖1。

2.3 SFN減少大鼠心肌細(xì)胞凋亡與Control相比，I∕R組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高（P＜0.05），心肌組織Bax、IDO、cleaved-capase3蛋白水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平顯著降低（P＜0.05；圖4）；與I∕R組相比，I∕R+L SFN、I∕R+H SFN組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)依次降低（P＜0.05），心肌組織Bax、cleaved-capase3、IDO蛋白水平顯著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2，3，表2。

圖3 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2、cleaved-capase3、IDO蛋白表達(dá)

表2 SFN對(duì)大鼠心肌組織Bax、Bcl2、capase3、IDO蛋白表達(dá)的影響

表2 SFN對(duì)大鼠心肌組織Bax、Bcl2、capase3、IDO蛋白表達(dá)的影響

注：Control為假手術(shù)組，I∕R為模型組，I∕R+L SFN為蘿卜硫素低劑量組，I∕R+H SFN為蘿卜硫素高劑量組，Bax為B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白，Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤-2，cleaved-capase3為活化胱天蛋白酶3，IDO為吲哚胺2，3-雙加氧酶。①與Control組相比，P＜0.05。②與I∕R組相比，P＜0.05。③與I∕R+L SFN組相比，P＜0.05。

組別Control I∕R I∕R+L SFN I∕R+H SFN F值P值鼠數(shù)10 10 10 10凋亡指數(shù)1.07±0.08 32.85±3.13①21.32±2.57①②16.64±1.02①②③397.37＜0.001 Bax 0.67±0.04 0.95±0.03①0.86±0.03①②0.77±0.02①②③151.84＜0.001 Bcl2 1.03±0.06 0.66±0.04①0.72±0.03①②0.87±0.02①②③168.62＜0.001 cleaved-capase3 0.64±0.04 0.92±0.02①0.84±0.03①②0.73±0.02①②③182.93＜0.001 IDO 0.84±0.02 1.02±0.04①0.97±0.03①②0.91±0.01①②③80.44＜0.001

2.4 SFN降低大鼠心肌組織TRP、KYN表達(dá)水平與Control相比，I∕R組大鼠心肌組織TRP、KYN濃度、KYN∕TRP比值顯著升高（P＜0.05）；與I∕R組相比，I∕R+L SFN、I∕R+H SFN組大鼠心肌組織TRP、KYN濃 度、KYN∕TRP比 值 依 次 降 低（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 SFN對(duì)大鼠心肌組織TRP、KYN的影響

表3 SFN對(duì)大鼠心肌組織TRP、KYN的影響

注：Control為假手術(shù)組，I∕R為模型組，I∕R+L SFN為蘿卜硫素低劑量組，I∕R+H SFN為蘿卜硫素高劑量組，TRP為色氨酸，KYN為犬尿氨酸。①與Control組相比，P＜0.05。②與I∕R組相比，P＜0.05。③與I∕R+L SFN組相比，P＜0.05。

組別Control I∕R I∕R+L SFN I∕R+H SFN F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 TRP∕（pmol∕L）402.23±23.55 783.75±30.32①654.62±28.35①②527.30±27.09①②③358.13＜0.001 KYN∕（pmol∕L）215.31±20.03 567.54±28.18①446.57±25.46①②312.73±23.28①②③397.56＜0.001 KYN∕TRP比值0.54±0.03 0.72±0.02①0.68±0.02①②0.59±0.01①②③150.19＜0.001

3 討論

再灌注是治療缺血性心臟病的主要方法，但再灌注會(huì)引起組織的持續(xù)損傷，心肌細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)是心肌缺血再灌注損傷的關(guān)鍵過(guò)程［11］。心肌缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，研究顯示，再灌注損傷是由于炎癥細(xì)胞因子表達(dá)增加引起的，IL-1β、IL-6是促進(jìn)炎性因子，TNF-α是一種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，可促進(jìn)炎癥介質(zhì)的表達(dá)，共同調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，I∕R組較Control大鼠心肌細(xì)胞破碎、壞死，細(xì)胞排列不規(guī)則，心肌纖維斷裂，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血清中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著升高，與申震等［13］研究結(jié)果一致，提示心肌缺血再灌注引起心肌組織發(fā)生炎癥反應(yīng)和損傷。因此，改善心肌缺血再灌注損在缺血性心臟病的治療中具有重要意義。SFN是一種異硫氰酸酯，具有抗氧化活性，對(duì)心血管疾病有治療作用。Bonetto等［14］研究顯示，SFN能夠減輕炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)局部缺血后心室功能。本研究發(fā)現(xiàn)，SFN治療后較I∕R組大鼠心肌細(xì)胞上述病理癥狀明顯減輕，血清中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量依次降低，提示SFN可以抑制炎性因子分泌，緩解心肌組織炎癥反應(yīng)和心肌損傷。

細(xì)胞凋亡是促炎性程序性細(xì)胞死亡，抑制細(xì)胞凋亡可以減輕再灌注損傷［15］。Bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡因子，Bax通過(guò)激活cleaved-capase3引起細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要作用［16］。Peng等［17］研究顯示，SFN可以抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌具有保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與I∕R組相比，SFN治療后較I∕R組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、促凋亡相關(guān)蛋白Bax、cleaved-capase3表達(dá)顯著降低，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著升高，提示SFN通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，抑制心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

TRP-KYN是機(jī)體色氨酸分解代謝的主要途徑，參與免疫性疾病、神經(jīng)精神性疾病、心血管疾病等疾病的發(fā)生［18-19］。IDO是KYN途徑催化TRP降解的限速酶，由促炎性刺激和T輔助細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6等誘導(dǎo)參與細(xì)胞凋亡［20］。研究顯示，TRP-KYN通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞介導(dǎo)炎癥、免疫激活等反應(yīng)在心肌缺血再灌注損傷等心血管疾病中發(fā)揮重要作用［21］。楊夢(mèng)等［22］研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠體內(nèi)氨基酸代謝、能量代謝及氧化應(yīng)激反應(yīng)，可以有效緩解高血壓心力衰竭大鼠尿液代謝的異常。Baumgartner等［23］研究顯示，通過(guò)TRP-KYN介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)是參與調(diào)節(jié)血管炎癥的重要機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，I∕R組較Control大鼠心肌組織TRP、KYN濃度、KYN∕TRP比值、IDO蛋白表達(dá)顯著升高，SFN治療后較I∕R組大鼠心肌組織TRP、KYN濃度、KYN∕TRP比值、IDO蛋白表達(dá)依次降低，提示TRP、KYN濃度、KYN∕TRP比值和IDO蛋白表達(dá)與心肌缺血再灌注損傷有關(guān)，SFN可以抑制IDO、TRP、KYN、KYN∕TRP表達(dá)，推測(cè)SFN可能通過(guò)抑制TRP-KYN信號(hào)通路，減少心肌細(xì)胞凋亡，緩解機(jī)體炎癥反應(yīng)，對(duì)心肌損傷有保護(hù)作用。

綜上所述，SFN可能通過(guò)抑制TRP-KYN信號(hào)通路，緩解機(jī)體炎癥反應(yīng)，減少心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌損傷有保護(hù)作用，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，補(bǔ)充SFN對(duì)心肌梗死損傷等多方面進(jìn)行補(bǔ)充驗(yàn)證。

（本文圖1，2見(jiàn)插圖1-3）

圖1 各組大鼠心肌組織的病理變化（HE染色×200） 圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞的凋亡檢測(cè)（TUNEL染色×200）