劉 佳，王建鳳，高麗娟，王秋水，馮月超，劉 艷，丁 奇，王 穎，邵 鵬

（北京市科學(xué)技術(shù)研究院分析測(cè)試研究所（北京市理化分析測(cè)試中心），北京 100089）

現(xiàn)代畜牧業(yè)中，獸藥被廣泛用于維持動(dòng)物健康、預(yù)防感染和治療疾?。?］。然而，用藥不規(guī)范或者非法使用違禁藥物將導(dǎo)致動(dòng)物源性產(chǎn)品中違禁藥物檢出、獸藥殘留超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，產(chǎn)生食品安全風(fēng)險(xiǎn)［1－4］。為了確保食品安全，國(guó)際食品法典委員會(huì)、歐盟委員會(huì)、中國(guó)等均規(guī)定了食品中藥物最大殘留限量［5］，如GB 31650－2019［6］《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)－食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定了動(dòng)物源性食品中磺胺類抗生素、倍氯米松等的最大殘留限量?？紤]到養(yǎng)殖者用藥的不確定性和復(fù)雜性，建立一種高通量、快速測(cè)定動(dòng)物源性食品中多藥物殘留的檢測(cè)方法刻不容緩。

動(dòng)物源性食品存在基質(zhì)復(fù)雜、干擾物多等特點(diǎn)，且多藥物分析中藥物極性往往差異較大，單一的前處理技術(shù)難以適用于所有目標(biāo)物。最初用于農(nóng)藥殘留分析的快速樣品前處理技術(shù)——QuEChERS目前已被廣泛用于動(dòng)物源性食品中多類獸藥的殘留分析［7－9］，然而該方法無(wú)法充分回收動(dòng)物養(yǎng)殖中常用的極性藥物，如四環(huán)素和喹諾酮類［5］。因此，建立一種適用于多組分的前處理技術(shù)十分必要。

目前，液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法被廣泛用于動(dòng)物源性食品中多藥物的同時(shí)檢測(cè)［7，10－13］。該法具有高的靈敏度和選擇性，但存在兩點(diǎn)不足：一是無(wú)法分析多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）中未定義的化合物，因此無(wú)法獲得關(guān)于未知藥物的信息［14］；另一方面，通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行多藥物殘留分析可能非常耗時(shí)，尤其是對(duì)數(shù)百種不同化合物的分析［15］。四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF MS）具有數(shù)據(jù)采集速度快、分辨能力高、質(zhì)量精度高、檢測(cè)靈敏度高等多重優(yōu)點(diǎn)，能夠同時(shí)分析無(wú)限數(shù)量的化合物，實(shí)現(xiàn)非靶向目標(biāo)化合物定性，近年來(lái)已發(fā)展成為一種高效的篩查方法，在食品安全分析領(lǐng)域有害物質(zhì)高通量、快速篩查方面得到廣泛應(yīng)用［9，14，16－19］。

本研究以GB 31650－2019［6］、《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號(hào)公告》［20］等中限用、禁用的β-興奮劑、蛋白同化激素、抗生素等79種藥物為研究對(duì)象，在優(yōu)化樣品前處理技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用超高效液相色譜－四極桿－飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC－Q－TOF MS）技術(shù)，建立了豬肉中79種藥物的多殘留定性篩查方法。該方法具有通量高、簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與樣品

Acquity UPLC超高效液相色譜儀、SYNAPT G2－Si四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、Waters Acquity BEH HSS－C18柱（美國(guó)Waters公司）；GR22GⅢ高速冷凍離心機(jī)（日本Hitachi公司）；MS200多管渦旋混勻儀（杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司）；N－EVAPTM112恒溫水浴氮吹儀（美國(guó)Organomation Associates公司）；Secura225D－1CN天平（德國(guó)Sartorius公司）；Vortex Genius 3旋渦混合器（德國(guó)IKA公司）；Milli－Q超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；FAVEX－NM50獸藥殘留快速柱（500 mg/6 mL，高雄巨研科技股份有限公司）。

79種藥物標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司和美國(guó)A Chemtek公司；乙腈、甲醇、甲酸（色譜純）、甲酸銨（美國(guó)Thermo Fisher Scientific有限公司）；叔丁基甲基醚（色譜純，美國(guó)Sigma－Aldrich公司）；碳酸鈉（Na2CO3）、乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA－Na2）（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；0.22 μm有機(jī)尼龍濾膜（天津津騰公司）。

所用樣品為市售豬肉鮮肉，購(gòu)自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

根據(jù)各藥物標(biāo)準(zhǔn)品的溶解性，選擇甲醇、乙腈等溶劑配制質(zhì)量濃度100～1 000 μg/mL的各藥品單一標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，-18℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別移取適量單一標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋配制成1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取適量混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用基質(zhì)空白提取液逐級(jí)稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品制備

1.2.2 .1樣品提取稱取粉碎均質(zhì)后的樣品2 g（精確至0.01 g）于50 mL聚丙烯離心管中，先加入10 mL 0.5%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸－乙腈溶液，充分混勻后以2 500 r/min振蕩提取30 min，10 000 r/min下冷凍離心10 min后將上清液全部移出，再加入10 mL甲醇，以2 500 r/min振蕩提取30 min，10 000 r/min冷凍離心10 min，上清液全部移出。分別準(zhǔn)確移取兩次上清液各5 mL，置于FAVEX－NM50凈化柱中，以每秒1滴流速加壓，收集濾液，于40℃氮吹至近干，用1 mL乙腈（0.1%甲酸）∶5 mmol/L甲酸銨（0.1%甲酸）（13∶87，體積比）定容，渦旋復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm有機(jī)尼龍濾膜過(guò)濾，待儀器分析。

1.2.2 .2基質(zhì)空白提取液的制備取不含被測(cè)物的豬肉樣品，按照“1.2.2.1”操作處理，得到基質(zhì)空白提取液。

1.2.3 分析方法

(1)城鄉(xiāng)發(fā)展聯(lián)動(dòng)性不足。長(zhǎng)沙市城鄉(xiāng)旅游產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)和要素目前尚不完整，與工業(yè)、農(nóng)業(yè)、林業(yè)以及其他產(chǎn)業(yè)融合不足：縣域內(nèi)旅行社、游客集散中心、旅游咨詢中心等功能發(fā)揮的不夠；餐飲住宿、休閑經(jīng)營(yíng)規(guī)模有待擴(kuò)大，服務(wù)水平有待提升；缺少規(guī)?；奶厣止に嚻贰⑼撂禺a(chǎn)等旅游商品及其加工的銷售場(chǎng)所。同時(shí)由于各鎮(zhèn)村各自為政、爭(zhēng)先恐后地做規(guī)劃、出臺(tái)優(yōu)惠辦法來(lái)發(fā)展鄉(xiāng)村旅游，統(tǒng)籌開(kāi)發(fā)不足、景點(diǎn)同質(zhì)化情況日漸增多。

1.2.3 .1色譜條件色譜柱：Waters Acquity BEH HSS－C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A：0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸－乙腈；流動(dòng)相B：0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸-5 mmol/L甲酸銨溶液。梯度洗脫程序：0～0.5 min，13%A；0.5～10.0 min，13%～50%A；10.0～10.75 min，50%～95%A；10.75～12.25 min，95%A；12.25～12.5 min，95%～13%A；12.5～15.0 min，13%A。柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.4 mL/min。

1.2.3 .2質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；離子源溫度：150℃；電噴霧電壓：3 000 V；脫溶劑氣流速：800 L/h；脫溶劑氣溫度：400℃；錐孔氣流速：50 L/h；錐孔電壓：15 V；掃描時(shí)間：0～15 min；掃描間隔時(shí)間：0.1 s；MSE（全信息串聯(lián)質(zhì)譜）模式檢測(cè)，靈敏度模式；質(zhì)量掃描范圍：m/z50～1 200；數(shù)據(jù)采集模式：Continuum模式；碰撞能量范圍：10～60 eV。質(zhì)量校正液為亮氨酸腦啡肽。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

利用Masslynx軟件對(duì)前處理后的樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，以UNIFI軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，基于實(shí)驗(yàn)室自行建立的包括79種藥物在內(nèi)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)［21］進(jìn)行檢索，以目標(biāo)化合物的一級(jí)質(zhì)譜精確分子量、保留時(shí)間、碎片離子等信息進(jìn)行藥物殘留的快速定性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

所測(cè)定的79種藥物化學(xué)性質(zhì)相差較大，較難達(dá)到良好分離，尤其是對(duì)于分子式相同或結(jié)構(gòu)式相近的化合物，其有相近或相同的碎片離子，且出峰時(shí)間相近易造成譜圖干擾。對(duì)于高分辨質(zhì)譜，目標(biāo)物質(zhì)在色譜柱上的分離程度越高，其二級(jí)質(zhì)譜的干擾碎片信息越少，更有利于定性結(jié)果的準(zhǔn)確判斷［22］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有機(jī)相為乙腈時(shí)，化合物峰形對(duì)稱性好、分離度高、保留較好；當(dāng)在水相和有機(jī)相中加入甲酸時(shí)，可明顯提高β-興奮劑、糖皮質(zhì)激素、蛋白同化激素類化合物在離子源中的離子化效率，增加正離子目標(biāo)物質(zhì)的響應(yīng)值。同時(shí)，甲酸銨溶液對(duì)部分目標(biāo)物質(zhì)的色譜峰形具有改善作用。因此，結(jié)合出峰時(shí)間、峰形以及化合物響應(yīng)，選用乙腈（0.1%甲酸）-5 mmol/L甲酸銨（0.1%甲酸）作為流動(dòng)相，梯度洗脫程序見(jiàn)“1.2.3.1”。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

進(jìn)行非靶向篩查時(shí)要求前處理方法能夠全面地提取樣品中的化合物［23］。因此，以提取物質(zhì)的數(shù)量盡可能多為前提進(jìn)行樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化，對(duì)提取溶劑進(jìn)行考察。

2.2.1 提取溶劑優(yōu)化

本研究中化合物的極性范圍非常廣泛，且絕大多數(shù)目標(biāo)化合物在有機(jī)溶劑中的溶解度較大，因此分別采用甲醇、乙腈、叔丁基甲基醚中的一種或多種溶劑對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行提取。已有研究表明［16，24］，提取溶劑的pH值會(huì)影響酸堿兩性物質(zhì)的電離，因此，同時(shí)考察了有機(jī)溶液中加入弱酸和弱堿對(duì)目標(biāo)物的提取效果。分別研究了①甲醇，②0.5%甲酸－甲醇，③乙腈，④0.5%甲酸－乙腈，⑤甲醇和乙腈等比例混合溶劑（含0.5%甲酸），⑥甲醇、乙腈和0.1%EDTA－Na2等比例混合溶劑（含0.5%甲酸），⑦10%Na2CO3和叔丁基甲基醚（1∶9，體積比）的提取效果。不同提取溶劑下目標(biāo)化合物的提取情況如表1所示，提取液⑥和⑦分別提取出77種和51種目標(biāo)化合物，除四環(huán)素類中的土霉素外，提取液③提取出其它78種目標(biāo)化合物。其余4種提取溶劑均提取出全部79種目標(biāo)化合物，目標(biāo)物提取率達(dá)100%。在這4種提取溶劑中，79種目標(biāo)化合物的提取回收率如圖1所示。由于目標(biāo)化合物性質(zhì)差別較大，其回收率表現(xiàn)出較大差異：對(duì)于大環(huán)內(nèi)酯類以及磺胺類抗生素，甲醇表現(xiàn)出明顯優(yōu)于其他3種提取溶劑的提取效果；0.5%甲酸-乙腈對(duì)大多數(shù)喹諾酮類抗生素、β-興奮劑、蛋白同化激素、糖皮質(zhì)激素以及孕激素拮抗劑的提取效果優(yōu)于其它3種提取溶劑。綜合考慮79種物質(zhì)的平均回收率和目標(biāo)化合物在不同回收率范圍的個(gè)數(shù)（表2），選擇0.5%甲酸－乙腈和甲醇組合作為提取溶劑，并對(duì)兩種溶劑的組合順序進(jìn)行優(yōu)化。

表2 不同提取溶劑下豬肉中79種目標(biāo)化合物在不同回收率范圍的個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of 79 target compounds in pork under different extraction solvents in different recovery ranges

圖1 不同提取溶劑對(duì)79種目標(biāo)化合物回收率的影響Fig.1 Effect of different solvents on the recoveries of 79 target compounds

表1 不同提取溶劑對(duì)豬肉中79種目標(biāo)化合物的提取情況Table 1 Extraction of 79 target compounds from pork with different extraction solvents

2.2.2 提取溶劑組合優(yōu)化

由于物質(zhì)種類較多，每類化合物中選擇2～3種代表性物質(zhì)，考察①先甲醇后0.5%甲酸－乙腈；②先0.5%甲酸－乙腈后甲醇；③甲醇和0.5%甲酸－乙腈同時(shí)提取對(duì)回收率的影響，結(jié)果如圖2所示。除阿奇霉素、羅紅霉素外，組合②對(duì)于選定目標(biāo)化合物的提取效果優(yōu)于其他兩種組合。因此，采用先0.5%甲酸－乙腈后甲醇的組合提取順序。

圖2 部分目標(biāo)化合物在不同組合提取順序下的回收率Fig.2 Recoveries of some target compounds under different solvent combinations

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指目標(biāo)分析物以外的其他組分引起的分析信號(hào)增強(qiáng)或抑制現(xiàn)象［25］，通過(guò)采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值（SSE）來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)［26］。SSE值為0.8～1.2時(shí)，表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯［27］；當(dāng)SSE＞1.2時(shí)，表明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)SSE＜0.8時(shí)，表明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)［28］。本實(shí)驗(yàn)分別配制豬肉空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與對(duì)應(yīng)濃度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線考察SSE值，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明：86.1%（68/79）的目標(biāo)物質(zhì)SEE在0.8～1.2范圍內(nèi)，6.3%（5/79）的目標(biāo)物質(zhì)SEE＜0.8，存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，7.6%（6/79）的目標(biāo)物質(zhì)存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，通常采用同位素內(nèi)標(biāo)法或基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法［22］進(jìn)行校正。本方法的目標(biāo)物質(zhì)接近百種，使用內(nèi)標(biāo)的成本偏高，不利于方法的推廣，因此，采用空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正以降低基質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。

表3 豬肉中79種藥物的信號(hào)抑制/增強(qiáng)、線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量下限Table 3 Signal suppression/enhancements（SSEs），regression equations，linear ranges，correlation coefficients（r2），limits of detection（LODs）and limits of quantitation（LOQs）of 79 drugs in pork

（續(xù)表3）

（續(xù)表3）

2.4 線性關(guān)系、檢出限及定量下限

用空白基質(zhì)提取液配制系列濃度的79種藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)，繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，79種藥物在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均不低于0.99（表3）。分別以3倍信噪比（S/N）和10倍信噪比對(duì)應(yīng)的濃度確定方法的檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）［28］，79種藥物的LOD為0.05～10 μg/kg，LOQ為0.10～20 μg/kg。通過(guò)與GB 31650－2019［6］中提及的相關(guān)藥物殘留限量相比，該方法定量下限遠(yuǎn)低于對(duì)應(yīng)物質(zhì)限量標(biāo)準(zhǔn)，可以很好地滿足食品中藥物殘留的篩查需求。

2.5 非靶向篩查技術(shù)的應(yīng)用

2.5.1 模擬加標(biāo)樣本分析

選取每類物質(zhì)中的1～3種代表性物質(zhì)共21種（普萘洛爾、群勃龍、勃地酮、諾龍、米非司酮、雄烯二酮、氫化可的松、潑尼松、去氫表雄酮、可的松、倍氯米松、氨苯蝶啶、阿奇霉素、羅紅霉素、伊維菌素、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、甲氧芐啶、磺胺甲噻二唑、氧氟沙星、奧比沙星），采用所建立的方法對(duì)加標(biāo)水平為10 μg/kg和20 μg/kg的上述21種物質(zhì)的豬肉樣本進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)檢索質(zhì)譜信息數(shù)據(jù)庫(kù)，采用精確質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間的方式進(jìn)行非靶向定性篩查，在質(zhì)量數(shù)精確度允許偏差為10 ppm，保留時(shí)間偏差為0.2 min，且至少檢測(cè)到1種碎片離子的條件下，10 μg/kg加標(biāo)水平的篩查結(jié)果見(jiàn)表4，部分典型藥物的全掃描圖見(jiàn)圖3。由表4可知，10 μg/kg加標(biāo)下，除定量下限高于10 μg/kg的倍氯米松（表3）未篩查出外，其余物質(zhì)全部篩出；20 μg/kg加標(biāo)下21種物質(zhì)可全部篩查出來(lái)。

圖3 部分典型藥物的全掃描圖Fig.3 Full-scan chromatograms of some typical drugs

表4 10 μg/kg加標(biāo)水平下樣本的篩查結(jié)果Table 4 Screening results of specimen at 10 μg/kg spiked level

（續(xù)表4）

2.5.2 實(shí)際樣本檢測(cè)

采用本方法對(duì)市售的6份豬肉樣本進(jìn)行篩查分析，結(jié)果顯示，除1份樣本為陰性外，其余5份樣本均檢出氫化可的松，含量為1.39～13.6 μg/kg。所有陽(yáng)性樣本中氫化可的松的離子加和模式均為［M+H］+。為了檢驗(yàn)篩查結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用高靈敏度Xevo TQ－S串聯(lián)四極桿質(zhì)譜［8］對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行驗(yàn)證，以樣品3為例，Xevo TQ－S串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀的確證色譜圖見(jiàn)圖4。與本方法結(jié)果一致。

圖4 樣品3的Xevo TQ－S串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀色譜圖Fig.4 Xevo TQ－S tandem quadrupole mass spectrometer chromatogram of sample 3

我國(guó)GB 31650－2019［6］中規(guī)定，氫化可的松是被允許外用于所有食品動(dòng)物且不需要制定殘留限量的獸藥。結(jié)果表明6份市售豬肉樣本在所研究的79種藥物范圍內(nèi)是安全的。

3 結(jié)論

本研究基于UPLC－Q－TOF MS，建立了無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)品即可實(shí)現(xiàn)豬肉中79種藥物殘留的快速定性篩查技術(shù)，并將其應(yīng)用于模擬陽(yáng)性樣本以及隨機(jī)市售樣本的篩查。結(jié)果表明該方法具有通量高、簡(jiǎn)便、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，可用于風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警、日常監(jiān)測(cè)及應(yīng)急檢測(cè)，為豬肉類食品安全提供了有力的技術(shù)支撐。