公智卿，陳懌鵬，盧冬梅，辛麗麗，郭 菁，邢廣群

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院 腎病科，山東 青島 266555)

腹膜透析相關(guān)性腹膜炎(peritoneal dialysis-associated peritonitis，PDAP)是腹膜透析常見的并發(fā)癥，可以影響腹膜的結(jié)構(gòu)和功能，并引起腹膜透析技術(shù)失敗以及嚴(yán)重的包裹硬化性腹膜炎，危及患者生命。對病原體的及時精準(zhǔn)診斷、盡早選用敏感的抗生素是最有效的措施[1-2]。腹膜炎的主要致病菌有細(xì)菌和真菌，覆蓋細(xì)菌表面的復(fù)雜多聚糖網(wǎng)絡(luò)在革蘭陰性菌和革蘭陽性菌之間是不同的，革蘭陰性菌被兩層細(xì)胞膜包裹，兩層細(xì)胞膜被一層肽聚糖層隔開，并在外膜中含有脂多糖。相比之下，革蘭陽性細(xì)菌細(xì)胞膜只有厚厚的肽聚糖層覆蓋[3]。細(xì)菌多糖通常是由雙糖至八糖形成的規(guī)則的重復(fù)單位構(gòu)成，這些聚糖的精確結(jié)構(gòu)可能在具有相同細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的細(xì)菌之間存在顯著差異，甚至在同一細(xì)菌物種的不同菌株之間也可能存在差異[4]。構(gòu)成細(xì)菌常見的單糖有甘露糖、葡萄糖、巖藻糖等。革蘭陰性菌中含有的脂多糖是由脂質(zhì)A，核心多糖和O抗原組成的脂質(zhì)和多糖的復(fù)合物，Milan Manani等[5]研究表明，革蘭陰性菌腹膜炎患者的透析液中脂多糖水平較革蘭陽性菌腹膜炎腹透液和正常腹透液顯著升高。真菌細(xì)胞壁中含有半乳甘露聚糖和(1→3)-β-D-葡聚糖，其在真菌生長和組織侵襲過程中會釋放到周圍環(huán)境中，Worasilchai等[6]研究表明，檢測腹膜透析液中半乳甘露聚糖和(1→3)-β-D-葡聚糖的含量可以作為真菌性腹膜炎的早期診斷。

目前對腹膜炎患者腹膜透析液中單糖研究較少，高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)具有應(yīng)用范圍廣、分析速度快、敏感度高和耐鹽污染等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于降解后單糖含量測定、食品中成分測定、藥物含量測定等領(lǐng)域[7]。Trezzi 等[8]應(yīng)用色譜法研究表明，測定腦脊液中單糖成分變化可以用于早期診斷帕金森病。因此，本研究將應(yīng)用高效液相色譜法對腹膜透析液中由多聚糖降解后的單糖水平進(jìn)行分析，探究腹膜透析相關(guān)性腹膜炎患者腹透液中單糖水平的差異。

1 資料與方法

1.1病例選擇 2020年10月01日到2021年10月31日到青島大學(xué)附屬醫(yī)院西海岸腎病科住院的透析齡>3個月、年齡≥18歲的腹膜透析患者90例，收集患者腹膜透析液樣本，包括無腹膜炎腹膜透析液樣本52個，腹膜炎腹膜透析液樣本38個，其中革蘭陽性菌腹膜炎腹膜透析液樣本24個，革蘭陰性菌腹膜炎腹膜透析液樣本14個。PDAP的診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照2022年國際腹膜透析協(xié)會 (ISPD)指南, 符合以下3項中2項及以上者可診斷為PDAP：(1)腹痛和(或)透出液渾濁，伴或不伴發(fā)熱；(2)透出液白細(xì)胞計數(shù)超過100×106/L，其中多形核中性粒細(xì)胞達(dá)50%以上；(3)透出液微生物培養(yǎng)陽性[1]。本研究獲得青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(審批文號：QYFYWZLL26672)。

1.2實驗與方法

1.2.1實驗儀器 PCR儀(T100 Thermal cycler)購于新加坡Thermal Cycler公司；渦旋振蕩器(VG 3 S25, VORTEX GENIUS3)購于德國IKA 儀器設(shè)備有限公司；掌上離心機(jī)(LX-100)購于江蘇其林貝爾儀器有限公司；高速離心機(jī)購于美國Thermo公司；磁力攪拌器(C-MAG HS7)購于德國IKA 儀器設(shè)備有限公司；高效液相色譜儀(HPLC，Agilent 1260/1290)、Eclipse XD B-C18 色譜柱(150 mm*4.6 mm，5 μm)購于美國Agilent公司；超聲波振動清洗器(KH7200E)購于昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；電子天平(TP-213 型)購于北京丹佛儀器有限公司；PH 計(雷磁 PHs-3C)購于上海精密科學(xué)儀器有限公司；Simplicity UV 純水儀購于德國Millipore公司；烘箱購于上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司。

1.2.2實驗試劑 三氯甲烷購于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)購于美國Sigma Aldrich 公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品購于美國Sigma公司，色譜甲醇、乙腈、甲醇均購于Merck公司濃鹽酸溶液、NaOH溶液、乙酸銨、冰醋酸均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2.3方法 留取無腹膜炎患者入院當(dāng)天腹透液和腹膜炎患者初入院經(jīng)驗性抗生素使用之前的第一袋1.5%葡萄糖濃度的腹膜透析液，無菌操作采集患者留腹>2 h的腹膜透析液20 ml，放入-80 ℃冰箱中保存，同時抽取20 ml注入需氧、厭氧血培養(yǎng)瓶中。將所有收集的腹膜透析液樣本一式三份，測定3次單糖濃度取平均值。取5 μl腹膜透析液加入八連管的底部。八連管加蓋后放入PCR儀中，溫度設(shè)置為100 ℃, 降解10 min。經(jīng)過一系列實驗處理后，最終取50 μl上清液于棕色上樣瓶內(nèi)，隨后用HPLC進(jìn)行色譜分析[檢測波長245 nm；色譜柱溫37 ℃；進(jìn)樣量20 μl；流速1 ml/min；流動相配置：85%乙酸銨-乙酸緩沖溶液(PH=5.5)、15%乙腈][9]。

2 結(jié) 果

2.13組臨床資料比較 腹膜炎組與無腹膜炎組在體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、白蛋白、C反應(yīng)蛋白(CRP)、血鈉、血鈣、血磷上差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見表1。腹膜炎組與無腹膜炎組甘露糖、葡萄糖和巖藻糖的濃度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。革蘭陽性菌腹膜炎組與革蘭陰性菌腹膜炎組甘露糖濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 見表1～2。 腹膜透析相關(guān)性腹膜炎病原菌構(gòu)成見表3。

表1 3組臨床資料比較

表2 腹膜透析液降解單糖濃度比較(μmol/L)

表3 腹膜透析相關(guān)性腹膜炎病原菌構(gòu)成情況

2.2Logistic回歸分析 對無腹膜炎組和腹膜炎組進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析示，巖藻糖濃度是腹膜炎發(fā)生的獨立危險因素(P<0.01), 見表4。對革蘭陽性菌腹膜炎組和革蘭陰性菌腹膜炎組進(jìn)行亞組分析，根據(jù)ROC曲線結(jié)果，對甘露糖濃度進(jìn)行賦值后行l(wèi)ogistic回歸分析，結(jié)果表明甘露糖濃度是革蘭陽性菌腹膜炎發(fā)生的獨立危險因素(P<0.01), 見表5～6。

表4 腹膜炎影響因素的logistic回歸分析

表5 變量賦值說明

表6 革蘭陽性菌腹膜炎影響因素的logistic回歸分析

2.3ROC曲線分析 降解的巖藻糖診斷腹膜炎的AUC是0.820，95%CI(0.732，0.908)，敏感度為71.05%，特異度為84.62%，最佳截斷值為3.045 μmol/L。降解甘露糖對革蘭陽性菌腹膜炎診斷的AUC是0.863, 95%CI(0.740，0.986)，敏感度為78.57%，特異度為83.33%，最佳截斷值為0.345 μmol/L, 見圖1～2。

圖1 降解的巖藻糖診斷腹膜炎的ROC曲線 圖2 降解的甘露糖診斷革蘭陽性菌腹膜炎的ROC曲線

3 討 論

在全球范圍內(nèi)，腹膜透析相關(guān)性腹膜炎的發(fā)生率估計為0.24～1.66次/患者年[1]。傳統(tǒng)的病原菌實驗室培養(yǎng)時間長，耗時約為3～5 d，培養(yǎng)陽性率與腹水中病原菌數(shù)量和種類密切相關(guān)，有些患者雖然有非常明確的細(xì)菌感染炎癥表現(xiàn)，腹膜透析液培養(yǎng)的病原學(xué)卻是陰性，影響了抗生素的選擇和治療?；诖?，國內(nèi)外一直在不斷探索改進(jìn)檢測手段。目前有質(zhì)譜檢測、16s rRNA基因測序、納米材料檢測等均可以減少培養(yǎng)時間，有一定的敏感度和特異度，但成本高昂、不能提供藥敏信息、需要特殊檢測儀器等問題，限制了它們的應(yīng)用[10-13]。

本研究利用HPLC，通過酸降解和PCR后進(jìn)行色譜分析，檢測腹膜透析液中降解的單糖水平，發(fā)現(xiàn)腹膜透析相關(guān)性腹膜炎患者的透析液相較于無腹膜炎患者的透析液，降解的葡萄糖、巖藻糖含量是顯著降低的，甘露糖濃度在革蘭陽性菌腹膜炎感染中也是降低的。腹膜透析液中葡萄糖濃度的變化對腹膜透析相關(guān)性腹膜炎的患者而言沒有意義，主要有以下原因：不同的患者腹膜功能不同，腹膜透析液的留腹時間、腹膜透析液的葡萄糖濃度不同和腹腔內(nèi)病原體生長消耗都會影響葡萄糖的濃度。巖藻糖和甘露糖濃度的降低考慮與腹腔內(nèi)病原體生長消耗、體內(nèi)炎癥狀態(tài)等有關(guān)。與革蘭陽性菌腹膜炎組相比，革蘭陰性菌腹膜炎組腹膜透析液中甘露糖的水平高，首要考慮是因為覆蓋細(xì)菌表面的復(fù)雜聚糖網(wǎng)絡(luò)在革蘭陰性菌和革蘭陽性菌之間有所不同。其次，既往研究顯示，腹膜透析液中甘露糖濃度升高，對革蘭陰性菌感染引起的炎癥反應(yīng)具有抑制作用，與機(jī)體自身的免疫反應(yīng)有關(guān)[14-15]。在臨床上，我們對遇到的3例培養(yǎng)陰性的腹膜炎患者進(jìn)行腹膜透析液的甘露糖濃度檢測，結(jié)果提示有2例患者的腹膜透析液甘露糖濃度小于0.345 μmol/L，提示存在革蘭陽性菌感染，給予對革蘭陽性菌敏感的頭孢唑林后治愈；1例患者的甘露糖濃度大于0.345 μmol/L，提示存在革蘭陰性菌感染，給予對革蘭陰性菌敏感的頭孢他啶后治愈，這進(jìn)一步驗證了我們的研究成果。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，腹膜透析相關(guān)性腹膜炎發(fā)生時，降解的巖藻糖水平明顯下降，對腹膜炎有明確的提示作用；檢測腹膜透析液的甘露糖濃度可以早期鑒別革蘭陽性菌腹膜炎及革蘭陰性菌腹膜炎。HPLC相較于基因測序，檢測時間短、檢測成本低，對臨床上早期判斷病原菌種類，選用適當(dāng)抗生素有一定的指導(dǎo)意義。本研究為單中心研究，病例數(shù)較少，沒有納入真菌性腹膜炎患者，檢測單糖種類較少，還需要進(jìn)一步對結(jié)果進(jìn)行驗證。